Avaliação do mouse microinjeção de oócitos, maturação e ploidia

Summary

Ovócitos são propensas a aneuploidia devido a erros na segregação cromossômica durante a maturação meiótica. Aneuplóides ovos pode causar infertilidade, abortos espontâneos ou transtornos de desenvolvimento como a síndrome de Down. Aqui, descrevemos métodos para introduzir materiais de escolha em oócitos e métodos para estudar e avaliar a maturação meiótica ploidia.

Abstract

Erros na segregação cromossômica levar a células aneuplóides. Em células somáticas, aneuploidia é associado com o câncer, mas nos gametas, aneuploidia leva à infertilidade, abortos espontâneos ou transtornos de desenvolvimento como a síndrome de Down. Gametas haplóides por meio de formulário específico da espécie programas de desenvolvimento que são acoplados a meiose. A primeira divisão meiótica (MI) é exclusivo para a meiose porque cromátides irmãs permanecem ligados enquanto cromossomos homólogos são separados. Por razões ainda não totalmente compreendidas, esta divisão reducional é propenso a erros e é mais comumente a fonte de aneuploidia do que erros na meiose II (MII) ou de erros na meiose masculina ^1,2.

Nos mamíferos, os oócitos prisão em prófase da MI com um grande, vesícula intacta germinal (GV; núcleo) e só retomar a meiose quando recebem estímulos ovulatórios. Uma vez que retoma a meiose, oócitos MI completo e passar por uma divisão celular assimétrica, prendendo novamente na metáfase da MII. Ovos não completa MII até que sejam fertilizados por esperma. Oócitos também pode sofrer maturação meiótica utilizando estabelecidos em condições de cultura in vitro ^3. Porque a geração de mutantes de camundongos transgênicos e gene-alvo é caro e pode demorar longos períodos de tempo, manipulação de gametas femininos in vitro é uma estratégia mais econômica e economia de tempo.

Aqui, descrevemos métodos para isolar prófase detido oócitos de camundongos e por microinjeção. Qualquer material de escolha pode ser introduzido no óvulo, mas porque meiotically-oócitos competentes são transcricionalmente silenciosos cRNA ^4,5, e não DNA, deve ser injetado para estudos de expressão ectópica. Para avaliar a ploidia, descrevemos nossas condições para maturação in vitro de oócitos MII aos ovos. Historicamente, o cromossomo espalhando técnicas são usadas para contar o número de cromossomos ^6. Este método é tecnicamente desafiadora e está limitado a apenas identificar hyperploidies. Aqui, descrevemos um método para determinar hipo e hyperploidies usando ovos intactos ^7-8. Este método usa monastrol, um inibidor cinesina-5, que entra em colapso o eixo bipolar em um eixo monopolar cromossomos ⁹ separando assim de tal forma que cinetócoros individuais podem ser facilmente detectadas e contadas usando um soro anti-CREST auto-imunes. Porque este método é realizado em ovos intactos, cromossomos não são perdidos devido a erro do operador.

Protocol

1. Coleta de oócitos do mouse

1. Para maximizar o número de folículos antrais isolados de cada rato, por via intraperitoneal injetar camundongos fêmeas sexualmente maduros (usamos seis semanas de idade CF-1 ratos de Harlan), com 5 UI de égua grávida gonadotrofina sérica (PMSG).
2. Prepare o meio de coleta (MEM / PVP) (3 ml / rato), adicionando milrinona para 2,5 mM e aqueça-a 37 ° C. A milrinona é um inibidor da fosfodiesterase que mantém parada meiótica vez ovócitos são retirados os folículos. Alternativamente, 3-isobutil-1-metilxantina (IBMX) (0,2 mM) ou dibutyryl-monofosfato cíclico de adenosina (dbcAMP) (100 mg / ml) podem ser usados. Preparar o meio de cultura pela adição de glutamina (1 mM) e milrinona (2,5 mM) para 1 ml de CZB e permitir que ele atinja o equilíbrio na incubadora por pelo menos uma hora. Configure o microgotas de cada um em uma placa de Petri e sobreposição com óleo mineral. O prato CZB é colocado na incubadora, enquanto o prato MEM / PVP permanece fora de um aquecedor de slides. Outra coleção e meio de cultura que estão comercialmente disponíveis (M2 e M16 da Especialidade de mídia ou Sigma) também são usados ​​rotineiramente.
3. Aproximadamente 48 horas após PMSG priming, sacrificar o mouse usando CO ₂ sedação seguido por deslocamento cervical, dissecar os ovários e colocá-los em um vidro de relógio contendo pré-aquecido MEM / PVP + milrinona (MEM / PVP + M).
4. Usando uma seringa de insulina 1 ml, âncora dos ovários para o prato e liberar os folículos antrais por punção-los várias vezes com calibre 27 (ou costura) agulhas que são mantidas juntas.
5. Ao olhar através de um microscópio de dissecação, recolher complexos cumulus-oócitos utilizando uma boca-operado pipeta de vidro. É útil ter um microscópio com muito contraste. Como alternativa, o meio contendo o tecido e as células podem ser pipetados em uma tampa de uma placa de Petri de plástico. Apenas coletar grandes folículos antrais pequenos e não pré-antral folículos ou oócitos desnudados. Depois de coletados, os complexos de transferência para um microdrop de M + MEM / PVP que está no slide e mais quente sob óleo.
6. Com uma pipeta pequeno (pouco maior que o diâmetro do ovócito), pipeta cima e para baixo os complexos de separar as células cumulus. Transferir os oócitos desnudados com maior pipeta em um microdrop de CZB + milrinona (CZB + M) e coloque na incubadora.
7. Permitir a recuperação de oócitos por pelo menos 1 h na incubadora antes de manipulação.

2. Microinjeção de oócitos

1. Faça pipetas de injeção puxando de vidro de borosilicato tubo capilar em um extrator mecânico. Nós usamos um Flaming-Brown micropipeta extrator (Modelo P-97) com as seguintes configurações: P = 500, Calor = 300, Pull = 150, Vel = 100 Time, = 150.
2. Prepare a plataforma microinjeção colocando uma queda de 5 mL de M + MEM / PVP o mais próximo possível de uma queda de 0,5 mL de material de injecção de escolha (por exemplo, siRNA, cRNA, oligonucleotídeo morfolino, etc) em um slide-câmara de um bem que tem a câmara de mídia removido. Cubra com óleo mineral e lugar no palco microscópio (Fig. 1).
3. Injeção local e pipetas holding para a titulares e posição para a queda de M. + MEM / PVP Ligue os tanques de nitrogênio, que estão ligados à picoinjector e anti-vibração mesa. Abra a ponta da pipeta de injeção batendo-o contra a pipeta holding, enquanto enchendo-o com o meio. Se a abertura é muito grande, o meio vai entrar e sair rapidamente ea agulha irá matar a célula. Pipetas com muito pequeno de uma abertura, muitas vezes entopem com facilidade.
4. Ovócitos transferência (10/05) da incubadora para o MEM / M + PVP queda na plataforma. Antes de injetar, configurar o picoinjector. Usamos os seguintes parâmetros na nossa picoinjector (Modelo PLI-100 em Harvard Apparatus): PBal = 2,5-3,5 psi, PInj = 7,8 psi, PClear = 10-12 psi tempo, = 3s. Isso resulta em um volume de injeção do PL 10/05.
5. Enquanto pressiona CLEAR, mover a agulha de injeção para a queda de material e de preenchimento. Devolvê-lo à queda média.
6. Use a pipeta holding para capturar um óvulo e alinhar a agulha de injeção, de oócitos e pipeta holding ao longo do eixo-x.
7. Sob maior ampliação, o avanço da pipeta de injeção através do óvulo com o cuidado de evitar o núcleo. Uma vez que a membrana plasmática é perfurada, pressione INJECT. Após a injeção, retire a agulha. Liberação do ovócito e repita. Uma vez que todos os ovócitos são injetados, devolvê-los à incubadora. Manter em CZB + M para quantidade desejada de tempo, desta vez é dependente do objetivo experimental (siRNA ie e knockdown morfolino (até 24 h), a superexpressão (3-12 h)). Por favor note que as incubações mais de 24 h irá comprometer a maturação meiótica.

3. Maturação de oócitos

1. Após a incubação, lavar os oócitos através de várias gotas de CZB (meio de maturação) e transferir para um microdrop de meio de maturação sob óleo e coloque na incubadora.
2. 16 h para permitir t maturação completa o metáfase da meiose II.

4. Análise de ploidia

1. Prepare CZB monastrol + (100 mM) e coloque 750 mL no poço de uma placa de cultura órgão que tem água no anel externo.
2. Lavar os ovos através de várias gotas de CZB + monastrol e transferi-los para a placa de cultura de órgãos. Lugar na incubadora por 1 h.
3. Corrigir os ovos, transferindo-os em um vidro de relógio contendo paraformaldeído 2% em PBS por 20 minutos em temperatura ambiente. Transferência para outro vidro de relógio com solução de bloqueio. Este prato pode ser armazenado a 4 ° C até ser transformado.
4. Transferência para solução de permeabilização (PBS + 0,3% BSA + tritonX-100 0,1% + 0,02% NaN ₃₎ em um vidro de relógio por 15 minutos em temperatura ambiente. Enxágüe através de vários grandes volumes de solução de bloqueio (PBS + 0,3% BSA + 0,01 Tween-20 + 0,02% NaN _3).
5. O resto do procedimento é realizado na tampa de uma placa de 96 poços em câmara úmida à temperatura ambiente, que é protegido da luz. As gotas (~ mL 25) são colocados dentro do recortes circulares. Transferência de ovos para solução de bloqueio por 15 minutos.
6. Para centrômeros rótulo, ovos transferência para uma gota de solução de bloqueio contendo CREST anti-soro a 1:40. Incubar por pelo menos 1 h. Lave a 3 gotas de solução de bloqueio, incubação de 15 minutos em cada.
7. Transferência de ovos para uma gota de solução de bloqueio contendo Cy5 ou Alexa-fluor-594-conjugado anti-IgG humana (1:200) e incubar por 1 hora. Repita os passos de lavagem como acima, exceto para o último passo, incluem Sytox Green (1:5.000) na solução de bloqueio para detectar cromossomos. Montar em 5 mL de Vectashield. Para evitar esmagamento dos ovos, colocar 4 pequenas manchas de geléia de petróleo nos cantos do local onde a lamela será. Coloque uma lamela em cima e feche com unha polonês. Armazenar em uma caixa de lâminas a 4 ° C até o processamento através de microscopia confocal.
8. Enquanto imagem com um objetivo 100X, captura 0,4 mM passos no Z-plano e imagem de toda a região do eixo metáfase. Contar centrômeros usando software de imagem, como Image J (NIH).

5. Resultados representativos:

Figura 2 é uma projeção Z-a partir de um ovo euplóide. Na metáfase da MII, os ovos do mouse euplóide contêm 20 pares de cromossomos e, portanto, tem 40 centrômeros. Ocasionalmente, os cromossomos não se espalhado, apesar do tratamento monastrol. Esta situação torna difícil a contagem confiável centrômeros e, portanto, não incluem estes ovos em nossas análises. Ocasionalmente, pode ser um desafio para determinar se um CREST-imunorreativa "spot" é 1 ou 2 centrômeros. Usando programas como o Image J é útil porque pode-se analisar cada Z-seção, enquanto cuidadosamente observando a orientação dos cromossomos, o número de seções em que um "spot" é detectado ea intensidade de pixels de "spots" tem. Dependendo de onde o fuso meiótico é posicionado em relação ao corpo polar, as regiões do DNA podem se sobrepor e estas amostras não devem ser incluídos na análise.

Manipulação, in vivo ovularam ovos de ratos jovens reprodutivamente têm baixas taxas de aneuploidia (~ 1-2%). No entanto, por razões não compreendidas microinjeção, e nos procedimentos de maturação in vitro pode aumentar essa taxa para cima de 10%. Portanto, é fundamental que oócitos injetados são incluídos em qualquer estudo microinjeção.

Figura 1. Prato microinjeção configurar. Um slide de câmara com 5 gotas mL de MEM / PVP + M cai logo acima 0.5μl de solução injectável. Cubra com óleo mineral. Neste exemplo, existem 3 gotas por 3 soluções diferentes de injeção eo slide está sentado no palco de um microscópio. À esquerda é a agulha microinjeção e para a direita é a pipeta holding. Observe que há um reflexo do porta-agulhas.

Figura 2. Resultados ploidia. A Z-projeção de um ovo euplóide II metáfase. DNA é colorida em verde e cinetócoros são coloridos em vermelho. As setas apontam para duas distintas braços cromátides indicando que cinetócoros (# 17 e # 18) se sobrepõem. Ovos do mouse euplóide contêm 20 pares cinetocoro (40 total "spots"). Um ovo aneuplóides conteria qualquer variação neste número. Se este procedimento foram realizados em oócitos metáfase MI, haveria 40 pares cinetocoro (80 total "spots").

Tabela 1. Receita para o meio de coleta e microinjeção (MEM / PVP + M). Todos os materiais são de cultura do embrião-grade e da Sigma-Aldrich. Filtro de esterilizar através 0.22μm filtros PVDF (usamos Stericups Milipore) e armazenar a 4 ° C.

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Tabela 2. Receita para o meio CZB. Todos os materiais são de cultura do embrião-grade e da Sigma-Aldrich. Filtro de esterilizar através 0.22μm filtros PVDF (usamos Stericups Milipore) e armazenar a 4 ° C.

Discussion

Microinjeção de ovócitos é um método poderoso para estudar mecanismos que regulam a maturação meiótica ^{10,11, 12, 13.} Este método oferece um modo econômico para testar hipóteses antes de fazer um grande investimento no desenvolvimento de modelos de ratos transgênicos e orientada. Coleta de oócitos e técnicas de microinjeção exigem mais tempo para dominar do que os procedimentos típicos de biologia celular. Obstáculos específicos com a coleta de vezes incluem controlar a pipeta na boca, puxando a pipeta de vidro tamanho adequado para a coleta e remoção das células somáticas e aumentando a velocidade de coleta para minimizar o tempo em que os oócitos estão fora da incubadora. Recomendamos a prática muitas vezes antes de fazer experimentos. Transferência entre oócitos microgotas, mantendo o mesmo número de células é uma ótima maneira de tornar-se confortável com este método.

A morte celular ocorre comumente enquanto aprende microinjeção. Isso poderia ocorrer por uma série de razões, incluindo a injecção de demasiado grande de um volume de material (ou seja, a abertura de agulha é muito grande), atingindo o núcleo com a agulha de injeção, piercing no lado oposto do oócito ou que o material injetado é tóxico para o ovócito. Praticando com injeção de tampão em oócitos até a sua taxa de sobrevivência é, pelo menos, 50% é a chave para dominar esta técnica. Se oócitos maduros não é provável que a milrinona não foi diluída o suficiente. Recomendamos enxaguar os oócitos através de muitos grandes gotas de milrinona livre CZB antes da maturação.

A microinjeção seguintes ploidia análise é um dos muitos testes para avaliar a maturação meiótica. Análises de rotina que usamos no laboratório incluem o monitoramento da cinética pelo qual o progresso através de oócitos meiose, imunofluorescência para analisar a formação do fuso e alinhamento de cromossomos e ativação ovo ou a fertilização in vitro para avaliar as conseqüências do desenvolvimento da manipulação de oócitos ^{14,15, 16, 17.}

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Table of specific reagents:
Milrinone	Sigma-Aldrich	M4659	Resuspend in DMSO at 2.5mM
Mineral oil	Sigma-Aldrich	M5310	Only use embryo-tested, sterile-filtered
CREST autoserum	Immunovision	HCT-0100
Sytox Green	Invitrogen	57020
Anti-human Alexa 594	Invitrogen	A-11014
Vectashield	Vector Laboratories	H-100
Paraformaldehyde	Polysciences, Inc.	577773
Albumin from bovine serum	Sigma-Aldrich	A3294
PMSG	Calbiochem	367222
Monastrol	Sigma-Aldrich	M8515	Resuspend in DMSO at 100mM
Tween-20	Sigma-Aldrich	274348
TritonX-100	Sigma-Aldrich	X-100
Table of specific equipment:
Mouthpiece	Biodiseno	MP-001-Y
Watchglass	Electron Microscopy Sciences	70543-30
Syringe	BD Biosciences	309623	1ml, 27G1/2
60 mm Petri Dish	Falcon BD	351007
Glass Pasteur pipets	Fisher Scientific	13-678-200
Side warmer	Fisher Scientific		Any standard model
Dissection microscope			Any standard model
Chamber Slide	Nalge Nunc international	177372
Capillary Tubing	Drummond Scientific	1-000-0500	microcaps
Pipette Puller	Flaming-Brown micropipette puller		Model P-97
Inverted microscope	Nikon Instruments		Any standard model
Micromanipulators	Eppendorf		Any standard model
Picoinjector	Harvard Apparatus	Model PLI-100	Any standard model
CO2 tanks			For incubator
N2 tank			For table and injector
Anti-vibration table	Technical Manufacturing Corp.		Any standard model
Incubator			Any standard model
Holding pipettes	Eppendorf	930001015	Vacutip
Confocal microscope	Leica Microsystems		Any standard model
Dissection tools	Fine Science Tools		Any standard model
Humidified chamber			We use tupperware
Lid of 96 well plate	Nalge Nunc international	263339
Microscope slides	Fisher Scientific	12-544-3
Coverslips	Thomas Scientific	6663-F10	Thickness will vary for particular microscopes
Center well organ culture dish	Fisher Scientific	353037	60 X 15mm