माउस Oocyte Microinjection परिपक्वता, और Ploidy आकलन

Summary

Oocytes meiotic परिपक्वता के दौरान गुणसूत्र अलगाव में त्रुटियों के कारण aneuploidy के लिए प्रवण हैं. Aneuploid अंडे बांझपन, गर्भपात, डाउन सिंड्रोम की तरह या विकासात्मक विकारों पैदा कर सकता है. यहाँ, हम विधियों का वर्णन oocytes और meiotic परिपक्वता अध्ययन और ploidy आकलन के तरीकों में पसंद की सामग्री का परिचय.

Abstract

Mistakes in chromosome segregation lead to aneuploid cells. In somatic cells, aneuploidy is associated with cancer but in gametes, aneuploidy leads to infertility, miscarriages or developmental disorders like Down syndrome. Haploid gametes form through species-specific developmental programs that are coupled to meiosis. The first meiotic division (MI) is unique to meiosis because sister chromatids remain attached while homologous chromosomes are segregated. For reasons not fully understood, this reductional division is prone to errors and is more commonly the source of aneuploidy than errors in meiosis II (MII) or than errors in male meiosis ^1,2.

In mammals, oocytes arrest at prophase of MI with a large, intact germinal vesicle (GV; nucleus) and only resume meiosis when they receive ovulatory cues. Once meiosis resumes, oocytes complete MI and undergo an asymmetric cell division, arresting again at metaphase of MII. Eggs will not complete MII until they are fertilized by sperm. Oocytes also can undergo meiotic maturation using established in vitro culture conditions ³. Because generation of transgenic and gene-targeted mouse mutants is costly and can take long periods of time, manipulation of female gametes in vitro is a more economical and time-saving strategy.

Here, we describe methods to isolate prophase-arrested oocytes from mice and for microinjection. Any material of choice may be introduced into the oocyte, but because meiotically-competent oocytes are transcriptionally silent ^4,5 cRNA, and not DNA, must be injected for ectopic expression studies. To assess ploidy, we describe our conditions for in vitro maturation of oocytes to MII eggs. Historically, chromosome-spreading techniques are used for counting chromosome number ⁶. This method is technically challenging and is limited to only identifying hyperploidies. Here, we describe a method to determine hypo-and hyperploidies using intact eggs ^7-8. This method uses monastrol, a kinesin-5 inhibitor, that collapses the bipolar spindle into a monopolar spindle ⁹ thus separating chromosomes such that individual kinetochores can readily be detected and counted by using an anti-CREST autoimmune serum. Because this method is performed in intact eggs, chromosomes are not lost due to operator error.

Protocol

1. माउस oocyte संग्रह प्रत्येक माउस से अलग antral रोम की संख्या को अधिकतम करने के लिए, intraperitoneally गर्भवती घोड़ी सीरम gonadotropin (PMSG) के 5 आइयू के साथ यौन परिपक्व मादा चूहों इंजेक्षन (हम 6 सप्ताह पुरानी Harlan से CF-1 चूहों का उपयोग करें). 2.5 सुक्ष्ममापी milrinone जोड़कर संग्रह मध्यम सदस्य (/ PVP) (3 मिलीग्राम / माउस) तैयार है और यह 37 पर गर्म डिग्री सेल्सियस Milrinone एक phosphodiesterase अवरोध करनेवाला है कि meiotic गिरफ्तारी का कहना है एक बार oocytes रोम से हटा रहे है. वैकल्पिक रूप से, (IBMX 3) ​​- isobutyl-1-methylxanthine (0.2 मिमी) या dibutyryl चक्रीय adenosine monophosphate (dbcAMP) (100 / μg मिलीलीटर) इस्तेमाल किया जा सकता है. CZB के 1 मिलीलीटर (1 मिमी) glutamine और milrinone (2.5 सुक्ष्ममापी) जोड़कर संस्कृति के माध्यम से तैयार है और इनक्यूबेटर में कम से कम एक घंटे के लिए संतुलित करने के लिए अनुमति. एक पेट्री और खनिज तेल के साथ पकवान उपरिशायी में प्रत्येक के microdrops सेट. CZB पकवान इनक्यूबेटर में रखा गया है जबकि सदस्य / PVP पकवान एक गर्म स्लाइड पर बाहर रहता है. अन्य संग्रह और संस्कृति माध्यम है कि व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं (M2 और विशेषता मीडिया या सिग्मा से M16) भी नियमित रूप से इस्तेमाल कर रहे हैं. लगभग 48 घंटे भड़काना PMSG के बाद, सीओ 2 ग्रीवा अव्यवस्था से बाद बेहोश करने की क्रिया का उपयोग कर माउस का बलिदान, अंडाशय काटना और उन्हें एक पूर्व गर्म सदस्य / PVP + milrinone (सदस्य / PVP एम +) युक्त watchglass में जगह. 1 मिलीलीटर इंसुलिन सिरिंज का प्रयोग, पकवान अंडाशय लंगर के लिए और उन्हें (या सिलाई) 27 गेज सुई है कि एक साथ fastened हैं के साथ कई बार puncturing द्वारा antral रोम जारी. जबकि एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के माध्यम से देख, एक मुँह संचालित ग्लास विंदुक का उपयोग मेघपुंज-oocyte परिसरों इकट्ठा. यह उपयोगी है विपरीत की एक बहुत कुछ के साथ एक खुर्दबीन है. वैकल्पिक रूप से, ऊतक और कोशिकाओं से युक्त मध्यम एक प्लास्टिक पेट्री डिश के एक ढक्कन पर pipetted कर सकते हैं. केवल बड़े, antral नहीं रोम और छोटे पूर्व antral रोम या denuded oocytes इकट्ठा. एक बार एकत्र, / सदस्य PVP + एम के microdrop कि गर्म स्लाइड पर और तेल के तहत परिसरों हस्तांतरण. (थोड़ा oocyte के व्यास से बड़ा) एक छोटे विंदुक का प्रयोग, विंदुक ऊपर और नीचे मेघपुंज कोशिकाओं को अलग परिसरों. CZB + milrinone (CZB + एम) के एक microdrop में एक बड़ा विंदुक और इनक्यूबेटर में जगह के साथ denuded oocytes स्थानांतरण. Oocytes इनक्यूबेटर में कम से कम 1 घंटे के लिए ठीक करने के लिए हेरफेर करने के लिए पहले अनुमति दें. 2. Oocyte microinjection एक यांत्रिक खींचने में borosilicate ग्लास केशिका टयूबिंग खींच द्वारा इंजेक्शन pipettes बनाओ. = 500, हीट = 300 खींचो, = 150, वेळ = 100, समय 150 = पी: हम निम्नलिखित सेटिंग्स के साथ एक ज्वलंत ब्राउन micropipette डांड़ी (मॉडल पी – 97) का उपयोग बंद के रूप में के रूप में संभव / सदस्य PVP + एम के 5 μl ड्रॉप पसंद के इंजेक्शन सामग्री की एक 0.5 μl ड्रॉप (जैसे siRNA, क्रेना, morpholino oligonucleotide, आदि) के लिए 1-अच्छी तरह से एक कक्ष स्लाइड पर रखकर microinjection मंच तैयार मीडिया कक्ष हटा दिया. खनिज तेल और खुर्दबीन मंच पर जगह (1 छवि) के साथ कवर. प्लेस और / सदस्य PVP + एम. के ड्रॉप में और धारकों और स्थिति में इंजेक्शन पकड़े pipettes नाइट्रोजन टैंक है कि picoinjector और विरोधी कंपन तालिका से जुड़े हैं पर मुड़ें. धीरे से उसे पकड़े विंदुक के खिलाफ दोहन जबकि यह मध्यम के साथ भरने के द्वारा इंजेक्शन पिपेट की नोक खोलें. अगर उद्घाटन बहुत बड़ी है, मध्यम में और बाहर जल्दी से स्थानांतरित करेंगे और सुई सेल मार देगा. के साथ भी एक खोलने के छोटे pipettes अक्सर आसानी से रोकना. इनक्यूबेटर से स्थानांतरण (5-10) मंच सदस्य / PVP + एम ड्रॉप करने के लिए oocytes. इंजेक्शन लगाने से पहले, picoinjector सेटअप. PBal = 2.5-3.5 साई, PInj = 7.8 साई, PClear समय = 10-12 साई, = 3s: हम हमारे picoinjector (मॉडल पीएलआई-100 हार्वर्ड उपकरण से) निम्न पैरामीटर का उपयोग करें. 5-10 pl का एक इंजेक्शन की मात्रा में यह परिणाम है. जबकि स्पष्ट दबाव, सामग्री ड्रॉप इंजेक्शन सुई चाल और भरने. यह मध्यम ड्रॉप करने के लिए लौटें. पकड़े पिपेट का उपयोग करने के लिए एक oocyte कब्जा और x-अक्ष के साथ इंजेक्शन की सुई, oocyte और पकड़े विंदुक संरेखित. उच्च आवर्धन के तहत, नाभिक से बचने के लिए सावधान किया जा रहा oocyte के माध्यम से इंजेक्शन विंदुक अग्रिम. एक बार प्लाज्मा झिल्ली छेदा है, इंजेक्षन दबाएँ. इंजेक्शन के बाद, सुई वापस ले लें. रिलीज oocyte और दोहराने. एक बार सभी oocytes अंतःक्षिप्त रहे हैं, उन्हें इनक्यूबेटर पर लौटने के लिए. समय के वांछित राशि के लिए CZB + एम में पकड़ो, इस समय प्रयोगात्मक उद्देश्य (यानी siRNA और morpholino पछाड़ना (24 घंटे), overexpression (3-12 घंटे)) पर निर्भर है. कृपया ध्यान दें कि 24 घंटे से अधिक समय incubations meiotic परिपक्वता समझौता होगा. 3. Oocyte परिपक्वता बाद ऊष्मायन CZB के कई बूँदें (परिपक्वता मध्यम) के माध्यम से oocytes धोने और तेल और इनक्यूबेटर में जगह के तहत परिपक्वता के माध्यम से एक microdrop के लिए स्थानांतरण. पूर्ण परिपक्वता टी के लिए 16 घंटे की अनुमति दें अर्धसूत्रीविभाजन II के ओ मेटाफ़ेज़. 4. Ploidy विश्लेषण CZB + (100 सुक्ष्ममापी) monastrol और जगह एक अंग संस्कृति डिश है कि बाहरी रिंग में पानी की अच्छी तरह से में 750 μl तैयार करें. CZB + monastrol की कई बूँदें के माध्यम से अंडे धो और उन्हें अंग संस्कृति डिश में स्थानांतरित. एक एच. के लिए इनक्यूबेटर में रखें उन्हें एक कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए पीबीएस में 2% paraformaldehyde युक्त watchglass में स्थानांतरित कर अंडे को ठीक करें. अवरुद्ध समाधान के साथ एक और watchglass में स्थानांतरण. इस पकवान 4 में संग्रहीत किया जा सकता डिग्री सेल्सियस जब तक संसाधित. कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए एक watchglass में permeabilization समाधान (पीबीएस + 0.3% BSA + 0.1% TritonX 100 + 0.02% 3 NaN) करने के लिए स्थानांतरण . अवरुद्ध समाधान के कई बड़ी मात्रा के माध्यम से कुल्ला (पीबीएस + BSA 0.3% + 0.01 बीच – 20 + 0.02% 3 NaN). प्रक्रिया के बाकी के कमरे के तापमान पर एक humidified है कि प्रकाश से सुरक्षित है कक्ष में एक 96 अच्छी तरह से थाली के ढक्कन पर किया जाता है. बूँदें (~ 25 μl) परिपत्र indentations के अंदर रखा जाता है. 15 मिनट के लिए समाधान अवरुद्ध करने के लिए अंडे स्थानांतरण. लेबल centromeres, हस्तांतरण अवरुद्ध शिखा 1:40 पर विरोधी सीरम युक्त समाधान की एक बूंद के लिए अंडे. 1 एच. कम से कम के लिए सेते अवरुद्ध समाधान के 3 बूँदें के माध्यम से धो, प्रत्येक में 15 मिनट incubating. अवरुद्ध Cy5 या Alexa – fluor-594-संयुग्मित विरोधी मानव आईजीजी (1:200) और 1 के लिए सेते युक्त समाधान की एक बूंद के लिए अंडे स्थानांतरण. अंतिम चरण के लिए छोड़कर के रूप में ऊपर कदम धोने दोहराएँ, Sytox ग्रीन (1:5,000) के अवरुद्ध गुणसूत्रों का पता लगाने के समाधान में शामिल हैं. Vectashield के 5 μl में माउंट. अंडे की पेराई रोकने के लिए, जहां coverslip हो जाएगा के कोनों पर पेट्रोलियम जेली के 4 छोटे धब्बे डाल दिया. ऊपर और नेल पॉलिश के साथ मुहर पर एक coverslip रखें. 4 में एक स्लाइड बॉक्स में स्टोर ° सी confocal माइक्रोस्कोपी के माध्यम से प्रसंस्करण तक. जबकि एक 100X उद्देश्य से इमेजिंग, जेड शिल्प और छवि मेटाफ़ेज़ धुरी के पूरे क्षेत्र में 0.4 सुक्ष्ममापी कदम पर कब्जा. छवि जम्मू (एनआईएच) जैसे इमेजिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग कर centromeres गणना. 5. प्रतिनिधि परिणाम: चित्रा 2 एक euploid अंडे से एक-Z प्रक्षेपण है. MII के मेटाफ़ेज़ कम euploid माउस अंडे क्रोमोसोम के 20 जोड़े होते हैं और इसलिए 40 centromeres है. कभी – कभी गुणसूत्रों monastrol इलाज के बावजूद फैल असफल. इस स्थिति में यह मुश्किल मज़बूती centromeres गिनती करने के लिए और इसलिए हम इन अंडों हमारे विश्लेषण में शामिल नहीं बनाता है. कभी कभी, यह पता लगाएँ कि क्या एक शिखा – immunoreactive "स्थान" 1 या 2 centromeres है चुनौतीपूर्ण हो सकते हैं. छवि जम्मू के रूप में इस तरह के कार्यक्रमों का उपयोग करना उपयोगी है क्योंकि एक प्रत्येक जेड – अनुभाग का विश्लेषण जबकि ध्यान से गुणसूत्रों की अभिविन्यास टिप्पण कर सकते हैं वर्गों में जो एक "स्थान" का पता लगाया है और पिक्सेल तीव्रता "स्पॉट" की संख्या है. निर्भर करता है जहां meiotic धुरी ध्रुवीय शरीर के सापेक्ष तैनात है, डीएनए के क्षेत्रों ओवरलैप और इन नमूनों को विश्लेषण में शामिल नहीं होना चाहिए कर सकते हैं. Unmanipulated reproductively युवा चूहों से vivo ovulated अंडे में aneuploidy (~ 1-2%) की कम दर है. हालांकि, कारणों के लिए समझ नहीं है, और इन विट्रो परिपक्वता प्रक्रियाओं में microinjection इस दर ऊपर 10% बढ़ा सकते हैं . इसलिए, यह महत्वपूर्ण है कि नियंत्रण इंजेक्शन oocytes किसी भी microinjection अध्ययन में शामिल हैं. चित्रा 1. Microinjection पकवान की स्थापना की. इंजेक्शन समाधान की 0.5μl बूँदें बस के ऊपर 5 सदस्य / PVP एम + μl बूंदों के साथ एक चैम्बर स्लाइड. खनिज तेल के साथ कवर. इस उदाहरण में वहाँ 3 अलग इंजेक्शन समाधान के लिए 3 बूँदें और स्लाइड एक खुर्दबीन के मंच पर बैठा है. बाईं microinjection सुई और सही करने के लिए पकड़े विंदुक है. ध्यान दें कि वहाँ सुई धारकों की एक प्रतिबिंब है. चित्रा 2. Ploidy परिणाम. एक euploid मेटाफ़ेज़ द्वितीय अंडे के Z प्रक्षेपण. डीएनए हरे रंग में रंग जाता है और kinetochores लाल रंग में रंग हैं. तीर 2 अलग chromatid हथियार है कि kinetochores ओवरलैप (# 17 और # 18) का संकेत करने के लिए बिंदु. Euploid माउस अंडे 20 kinetochore जोड़े (40 कुल "स्पॉट") होते हैं. एक aneuploid अंडा इस नंबर पर किसी भी बदलाव शामिल होगा. यदि इस प्रक्रिया मेटाफ़ेज़ एमआई oocytes पर आयोजित की गई, वहाँ 40 kinetochore जोड़े (80 कुल "स्पॉट") होगा. तालिका 1. संग्रह और microinjection मध्यम के लिए पकाने की विधि (सदस्य / PVP एम +) . सभी सामग्री भ्रूण संस्कृति और सिग्मा Aldrich से ग्रेड कर रहे हैं. PVDF 0.22μm (हम Milipore Stericups उपयोग) फिल्टर और 4 बजे दुकान डिग्री सेल्सियस के माध्यम से बाँझ फ़िल्टर "alt =" iles/ftp_upload/2851/2851table2.jpg तालिका 2 "/> तालिका 2. CZB मध्यम के लिए पकाने की विधि. सभी सामग्री भ्रूण संस्कृति और सिग्मा Aldrich से ग्रेड कर रहे हैं. PVDF 0.22μm (हम Milipore Stericups उपयोग) फिल्टर और 4 बजे दुकान डिग्री सेल्सियस के माध्यम से बाँझ फ़िल्टर

Discussion

Oocytes की Microinjection तंत्र है कि meiotic परिपक्वता ^{10,11, 12, 13} को विनियमित करने के अध्ययन के लिए एक शक्तिशाली विधि है. इस विधि के लिए परिकल्पना ट्रांसजेनिक और लक्षित माउस मॉडल विकसित करने में एक बड़ा निवेश करने से पहले परीक्षण के लिए एक किफायती तरीका प्रदान करता है. Oocyte संग्रह और microinjection तकनीक ठेठ कोशिका जीव विज्ञान प्रक्रियाओं की तुलना में मास्टर और अधिक समय की आवश्यकता है. संग्रह के साथ विशिष्ट बाधाओं अक्सर मुंह विंदुक को नियंत्रित करने, संग्रह के लिए उचित आकार ग्लास विंदुक खींच और दैहिक कोशिकाओं के विपठ्ठन और संग्रह की गति बढ़ाने के लिए समय है जिसमें oocytes इनक्यूबेटर के बाहर हैं कम से कम शामिल है. हम कई बार अभ्यास करने के लिए प्रयोग कर रही करने से पहले सलाह देते हैं. Microdrops बीच oocytes स्थानांतरण जबकि कक्षों की एक ही नंबर को बनाए रखने के लिए एक शानदार तरीका है इस विधि के साथ सहज हो.

कोशिका मृत्यु सामान्यतः होता है, जबकि microinjection सीखने. यह भी सामग्री की मात्रा (यानी इंजेक्शन सुई उद्घाटन भी बड़ा है) की बड़ी इंजेक्शन सहित कारणों की एक संख्या, इंजेक्शन की सुई के साथ नाभिक मार oocyte के विपरीत पक्ष भेदी के लिए या कि हो सकता है इंजेक्शन सामग्री oocyte के लिए विषैला होता है. Oocytes में बफर इंजेक्शन के साथ अभ्यास जब तक आपके जीवित रहने की दर कम से कम 50% है इस तकनीक mastering के लिए महत्वपूर्ण है. यदि oocytes परिपक्व असफल यह संभावना है कि milrinone पर्याप्त नहीं पतला था. हम milrinone मुक्त CZB के कई बड़े बूंदों के माध्यम से परिपक्वता के पहले oocytes rinsing सलाह देते हैं.

ploidy विश्लेषण निम्नलिखित microinjection कई assays के meiotic परिपक्वता का आकलन है. अन्य दिनचर्या विश्लेषण हम प्रयोगशाला में प्रयोग है जिसके द्वारा अर्धसूत्रीविभाजन के माध्यम से oocytes प्रगति, धुरी गठन और गुणसूत्र संरेखण और अंडे सक्रियण विश्लेषण या इन विट्रो निषेचन में oocyte ^14,15 हेरफेर के विकास ^{परिणाम, 16} का आकलन करने ^के लिए immunofluorescence , कैनेटीक्स निगरानी ^17.

Materials

Table of specific reagents:

Name of Reagent	Company	Catalogue Number	Comments
Milrinone	Sigma-Aldrich	M4659	Resuspend in DMSO at 2.5mM
Mineral oil	Sigma-Aldrich	M5310	Only use embryo-tested, sterile-filtered
CREST autoserum	Immunovision	HCT-0100
Sytox Green	Invitrogen	57020
Anti-human Alexa 594	Invitrogen	A-11014
Vectashield	Vector Laboratories	H-100
Paraformaldehyde	Polysciences	577773
Albumin from bovine serum	Sigma-Aldrich	A3294
PMSG	Calbiochem	367222
Monastrol	Sigma-Aldrich	M8515	Resuspend in DMSO at 100mM
Tween-20	Sigma-Aldrich	274348
TritonX-100	Sigma-Aldrich	X-100

Table of specific equipment:

Name of Equipment	Company	Catalogue Number	Comments
Mouthpiece	Biodiseno	MP-001-Y
Watchglass	Electron Microscopy Sciences	70543-30
Syringe	B-D	309623	1ml, 27G1/2
60 mm Petri Dish	Falcon	351007
Glass Pasteur pipets	Fisher scientific	13-678-200
Side warmer	Fisher scientific		Any standard model
Dissection microscope			Any standard model
Chamber Slide	Nunc	177372
Capillary Tubing	Drummond	1-000-0500	microcaps
Pipette Puller	Flaming-Brown micropipette puller		Model P-97
Inverted microscope	Nikon		Any standard model
Micromanipulators	Eppendorf		Any standard model
Picoinjector	Harvard Apparatus	Model PLI-100	Any standard model
CO2 tanks			For incubator
N2 tank			For table and injector
Anti-vibration table	Technical Manufacturing		Any standard model
Incubator			Any standard model
Holding pipettes	Eppendorf	930001015	Vacutip
Confocal microscope	Leica		Any standard model
Dissection tools	Fine science tools		Any standard model
Humidified chamber			We use tupperware
Lid of 96 well plate	Nunc	263339
Microscope slides	Fisher scientific	12-544-3
Coverslips	Thomas scientific	6663-F10	Thickness will vary for particular microscopes
Center well organ culture dish	Fisher scientific	353037	60 X 15mm