Oocyter är benägna att aneuploidi pga fel i kromosomsegregering under meiotiska mognad. Aneuploid ägg kan orsaka infertilitet, missfall eller utvecklingsstörning sjukdomar som Downs syndrom. Här beskriver vi metoder för att presentera material i valet till äggceller och metoder för att studera meiotiska mognad och bedöma ploidi.
Misstag i kromosomsegregering leda till aneuploid celler. I somatiska celler är aneuploidi i samband med cancer, men i könsceller leder aneuploidi till infertilitet, missfall eller utvecklingsstörning sjukdomar som Downs syndrom. Haploida gameter form genom artspecifika utvecklingsmässiga program som är kopplade till meios. Den första meiotiska divisionen (MI) är unik för meios eftersom systerkromatider sitta kvar medan homologa kromosomer är segregerade. Av skäl som inte helt klarlagda, är detta reductional division benägna att fel och är mer vanligt källan aneuploidi än fel i meios II (MII) eller än fel i manliga meios 1,2.
Hos däggdjur, oocyter gripandet vid profas av MI med en stor, intakt embryon vesikler (GV, kärnan) och endast återuppta meios när de får ovulatoriska ledtrådar. När meios meritförteckningar, äggceller komplett hjärtinfarkt och genomgå en asymmetrisk celldelning, arresterade igen på metafas av MII. Ägg kommer inte att slutföras MII förrän de befruktas av spermier. Oocyter också kan genomgå meiotiska mognad hjälp av etablerade in vitro odlingsbetingelser 3. Eftersom generation transgena och genprodukter riktade mus mutanter är kostsamt och kan ta lång tid, är manipulation av kvinnliga könsceller in vitro ett mer ekonomiskt och tidsbesparande strategi.
Här beskriver vi metoder för att isolera profas-greps ägg från möss och för mikroinjektion. Allt material val kan föras in i äggcellen, men eftersom meiotically-behörig oocyter är transkriptionellt tysta 4,5 Crna, och inte DNA, måste injiceras för ektopiska uttryck studier. För att bedöma ploidi beskriver vi våra villkor för in vitro-mognad av ägg till MII ägg. Historiskt sett är kromosom-sprida metoder som används för att räkna kromosom nummer 6. Denna metod är tekniskt utmanande och är begränsad till endast identifiera hyperploidies. Här beskriver vi en metod för att bestämma hypo-och hyperploidies med intakta ägg 7-8. Denna metod använder monastrol, en kinesin-5-hämmare, som kollapsar den bipolära spindeln i en monopolär spindeln 9 alltså separera kromosomer så att enskilda kinetochores lätt kan detekteras och räknas med hjälp av en anti-CREST autoimmuna serum. Eftersom denna metod utförs i intakta ägg, är kromosomer inte förlorade på grund av operatörens fel.
Mikroinjektion av oocyter är en kraftfull metod för att studera mekanismer som reglerar meiotiska mognad 10,11, 12, 13. Denna metod ger ett ekonomiskt sätt att testa hypoteser innan du köper en stor investering i att utveckla transgen och riktade musmodeller. Äggcell insamling och tekniker mikroinjektion kräver mer tid att bemästra än vanliga rutiner cellbiologi. Särskilda hinder med samlingen innehåller ofta kontrollera munnen pipett dra rätt Pipettstorlek glas för insamling och strippning av somatiska celler och öka insamlingen hastighet för att minimera den tid som oocyter ligger utanför inkubatorn. Vi rekommenderar att öva många gånger innan de gör experiment. Överföra oocyter mellan microdrops samtidigt som samma antal celler är ett bra sätt att bli bekväm med denna metod.
Celldöd inträffar vanligen under inlärningen mikroinjektion. Detta kan inträffa av flera skäl, bland annat injektion av alltför stor för en mängd material (dvs injektionsnålen öppningen är för stor), slog i kärnan med injektionsnål, piercing motsatta sidan av ägget eller att materialet sprutas är giftigt för i äggcellen. Öva med att injicera bufferten i oocyter tills din överlevnad är minst 50% är nyckeln till att behärska denna teknik. Om oocyter misslyckas med att mogna är det troligt att milrinon inte späddes nog. Vi rekommenderar att skölja oocyter genom många stora droppar milrinon-fri CZB innan mognad.
Den ploidi analyser efter mikroinjektion är en av många analyser för att bedöma meiotiska mognad. Andra rutinanalyser vi använder i laboratoriet omfattar övervakning kinetik genom vilket oocyter framsteg genom meios, immunofluorescens att analysera spindel formation och kromosom inriktning och ägg aktivering eller provrörsbefruktning för att bedöma utvecklingsmässiga konsekvenserna av äggcellen manipulation 14,15, 16, 17.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete utfördes i Richard M. Schultz 's laboratorium. Författarna vill också tacka Michael Lampson för konceptualisering av centromer-räkna analysen och tillgång till hans konfokalmikroskop. Teresa Chiang och Francesca Duncan hjälp med att optimera centromer-räkna-analysen. Paula Stein stöds av HD022681 (till RMS) och Karen Schindler stöds av HD055822.
Table of specific reagents:
Name of Reagent | Company | Catalogue Number | Comments |
---|---|---|---|
Milrinone | Sigma-Aldrich | M4659 | Resuspend in DMSO at 2.5mM |
Mineral oil | Sigma-Aldrich | M5310 | Only use embryo-tested, sterile-filtered |
CREST autoserum | Immunovision | HCT-0100 | |
Sytox Green | Invitrogen | 57020 | |
Anti-human Alexa 594 | Invitrogen | A-11014 | |
Vectashield | Vector Laboratories | H-100 | |
Paraformaldehyde | Polysciences | 577773 | |
Albumin from bovine serum | Sigma-Aldrich | A3294 | |
PMSG | Calbiochem | 367222 | |
Monastrol | Sigma-Aldrich | M8515 | Resuspend in DMSO at 100mM |
Tween-20 | Sigma-Aldrich | 274348 | |
TritonX-100 | Sigma-Aldrich | X-100 |
Table of specific equipment:
Name of Equipment | Company | Catalogue Number | Comments |
---|---|---|---|
Mouthpiece | Biodiseno | MP-001-Y | |
Watchglass | Electron Microscopy Sciences | 70543-30 | |
Syringe | B-D | 309623 | 1ml, 27G1/2 |
60 mm Petri Dish | Falcon | 351007 | |
Glass Pasteur pipets | Fisher scientific | 13-678-200 | |
Side warmer | Fisher scientific | Any standard model | |
Dissection microscope | Any standard model | ||
Chamber Slide | Nunc | 177372 | |
Capillary Tubing | Drummond | 1-000-0500 | microcaps |
Pipette Puller | Flaming-Brown micropipette puller | Model P-97 | |
Inverted microscope | Nikon | Any standard model | |
Micromanipulators | Eppendorf | Any standard model | |
Picoinjector | Harvard Apparatus | Model PLI-100 | Any standard model |
CO2 tanks | For incubator | ||
N2 tank | For table and injector | ||
Anti-vibration table | Technical Manufacturing | Any standard model | |
Incubator | Any standard model | ||
Holding pipettes | Eppendorf | 930001015 | Vacutip |
Confocal microscope | Leica | Any standard model | |
Dissection tools | Fine science tools | Any standard model | |
Humidified chamber | We use tupperware | ||
Lid of 96 well plate | Nunc | 263339 | |
Microscope slides | Fisher scientific | 12-544-3 | |
Coverslips | Thomas scientific | 6663-F10 | Thickness will vary for particular microscopes |
Center well organ culture dish | Fisher scientific | 353037 | 60 X 15mm |