Eizellen sind anfällig für Aneuploidie aufgrund von Fehlern in Chromosomensegregation während meiotischen Reifung. Aneuploiden Eier können zu Unfruchtbarkeit, Fehlgeburten oder Entwicklungsstörungen wie dem Down-Syndrom. Hier beschreiben wir Methoden, um Material der Wahl in Oozyten und Methoden zur meiotischen Reifung zu studieren und zu bewerten Ploidie einzuführen.
Fehler in Chromosomensegregation zu aneuploiden Zellen führen. In somatischen Zellen ist Aneuploidie mit Krebs in Verbindung gebracht, aber in Gameten führt Aneuploidie zu Unfruchtbarkeit, Fehlgeburten oder Entwicklungsstörungen wie dem Down-Syndrom. Haploide Gameten Form durch artspezifische Entwicklungsprogramme, die Meiose gekoppelt sind. Die ersten Reifeteilung (MI) ist einzigartig auf der Meiose, weil Schwesterchromatiden verbunden bleiben, während homologen Chromosomen getrennt sind. Aus Gründen noch nicht vollständig verstanden ist dies reductional Division fehleranfällig und wird häufiger die Quelle der Aneuploidie als Fehler in der Meiose II (MII) oder als Fehler in der männlichen Meiose 1,2.
In Säugetieren, Eizellen Verhaftung Prophase der MI mit einem großen, intakten Keimbläschen (GV; Kern) und erst wieder Meiose, wenn sie ovulatorischen Hinweise erhalten. Nach der Meiose wieder aufgenommen wird, Eizellen komplette MI und unterliegen einer asymmetrischen Zellteilung, verhaften wieder in der Metaphase der MII. Eier werden nicht komplette MII, bis sie durch Spermien befruchtet werden. Eizellen können auch unterziehen meiotischen Reifung mit in-vitro-Kultur Bedingungen 3 etabliert. Da Generation von transgenen und Gen-gezielte Mausmutanten ist kostspielig und kann längere Zeit dauern, ist die Manipulation der weiblichen Gameten in vitro eine wirtschaftlichere und zeitsparende Strategie.
Hier beschreiben wir Methoden zur Prophase verhaftet Eizellen von Mäusen und für die Mikroinjektion zu isolieren. Jegliches Material der Wahl kann in die Eizelle eingebracht werden, sondern weil meiotisch-kompetenten Oozyten transkriptionell stillen sind 4,5 cRNA und nicht DNA, muss für ektopische Expression Studien injiziert werden. Um zu beurteilen, Ploidie, beschreiben wir unsere Bedingungen für in-vitro-Maturation von Eizellen zu MII Eier. Historisch gesehen sind Chromosom-Verbreitung Techniken zum Zählen Chromosom Nummer 6 verwendet. Diese Methode ist technisch anspruchsvoll und ist limitiert auf nur identifizieren hyperploidies. Hier beschreiben wir eine Methode, um Hypo-und hyperploidies mit intakten Eiern 7-8 zu bestimmen. Diese Methode verwendet Monastrol, ein Kinesin-5-Hemmer, dass die bipolare Spindel fällt in eine monopolare Spindel 9 so trennt Chromosomen so dass die einzelnen Kinetochoren leicht erkannt und mit Hilfe eines anti-CREST autoimmune Serum gezählt werden. Da diese Methode in intakten Eiern durchgeführt wird, sind die Chromosomen nicht verloren wegen Bedienfehler.
Mikroinjektion von Eizellen ist eine leistungsfähige Methode, um Mechanismen, die meiotischen Reifung 10,11, 12, 13 regulieren zu studieren. Diese Methode bietet eine kostengünstige Möglichkeit, Hypothesen testen, bevor was eine große Investition in die Entwicklung transgener und gezielte Mausmodellen. Eizellenentnahme und Mikroinjektion Techniken erfordern mehr Zeit als typische Zellbiologie Verfahren beherrschen. Spezifische Hindernisse mit der Sammlung enthalten oft die Steuerung der Mund pipettieren, Ziehen der richtigen Größe Glaspipette für die Sammlung und Strippen der Körperzellen und wachsende Sammlung Geschwindigkeit, um die Zeit, in der Eizellen außerhalb des Inkubators zu minimieren. Wir empfehlen praktizieren viele Male vor der Durchführung von Experimenten. Übertragen Eizellen zwischen Mikro unter Beibehaltung der gleichen Anzahl von Zellen ist ein guter Weg, um sich mit dieser Methode.
Der Zelltod tritt häufig beim Lernen Mikroinjektion. Dies könnte für eine Reihe von Gründen, einschließlich Injektion zu groß mit einem Volumen von Material (dh die Injektionsnadel Öffnung zu groß ist), trifft den Kern mit der Injektionsnadel, Durchstechen der gegenüberliegenden Seite der Eizelle oder die auftreten können, das Material injiziert ist giftig für die Eizelle. Das Üben mit Injektion von Puffer in Oozyten, bis Ihre Überlebensrate liegt bei mindestens 50% ist der Schlüssel zur Beherrschung dieser Technik. Wenn Eizellen reifen nicht es ist wahrscheinlich, dass die Milrinon nicht verdünnt genug. Wir empfehlen Spülen der Eizellen durch viele große Tropfen Milrinon-free CZB vor der Reifung.
Die Ploidie Analyse folgende Mikroinjektion ist eine von vielen Assays zur meiotischen Reifung zu beurteilen. Andere Routineanalysen wir den Einsatz im Labor gehören die Überwachung der Kinetik, mit dem die Eizellen Fortschritt durch Meiose, Immunfluoreszenz zur Spindel Bildung und Chromosomen-Ausrichtung und Ei-Aktivierung zu analysieren oder in-vitro-Fertilisation mit den Entwicklungs Folgen der Eizelle Manipulation 14,15, 16 zu bewerten, 17.
The authors have nothing to disclose.
Diese Arbeit wurde in Richard M. Schultz 's Labor durchgeführt. Die Autoren möchten auch Michael Lampson für die Konzeption der Zentromer-Counting-Assay und den Zugang zu seinem konfokalen Mikroskop erkennen. Teresa Chiang und Francesca Duncan in die Optimierung der Zentromer-Counting-Test unterstützt. Paula Stein wird von HD022681 unterstützt (RMS) und Karen Schindler wird von HD055822 unterstützt.
Table of specific reagents:
Name of Reagent | Company | Catalogue Number | Comments |
---|---|---|---|
Milrinone | Sigma-Aldrich | M4659 | Resuspend in DMSO at 2.5mM |
Mineral oil | Sigma-Aldrich | M5310 | Only use embryo-tested, sterile-filtered |
CREST autoserum | Immunovision | HCT-0100 | |
Sytox Green | Invitrogen | 57020 | |
Anti-human Alexa 594 | Invitrogen | A-11014 | |
Vectashield | Vector Laboratories | H-100 | |
Paraformaldehyde | Polysciences | 577773 | |
Albumin from bovine serum | Sigma-Aldrich | A3294 | |
PMSG | Calbiochem | 367222 | |
Monastrol | Sigma-Aldrich | M8515 | Resuspend in DMSO at 100mM |
Tween-20 | Sigma-Aldrich | 274348 | |
TritonX-100 | Sigma-Aldrich | X-100 |
Table of specific equipment:
Name of Equipment | Company | Catalogue Number | Comments |
---|---|---|---|
Mouthpiece | Biodiseno | MP-001-Y | |
Watchglass | Electron Microscopy Sciences | 70543-30 | |
Syringe | B-D | 309623 | 1ml, 27G1/2 |
60 mm Petri Dish | Falcon | 351007 | |
Glass Pasteur pipets | Fisher scientific | 13-678-200 | |
Side warmer | Fisher scientific | Any standard model | |
Dissection microscope | Any standard model | ||
Chamber Slide | Nunc | 177372 | |
Capillary Tubing | Drummond | 1-000-0500 | microcaps |
Pipette Puller | Flaming-Brown micropipette puller | Model P-97 | |
Inverted microscope | Nikon | Any standard model | |
Micromanipulators | Eppendorf | Any standard model | |
Picoinjector | Harvard Apparatus | Model PLI-100 | Any standard model |
CO2 tanks | For incubator | ||
N2 tank | For table and injector | ||
Anti-vibration table | Technical Manufacturing | Any standard model | |
Incubator | Any standard model | ||
Holding pipettes | Eppendorf | 930001015 | Vacutip |
Confocal microscope | Leica | Any standard model | |
Dissection tools | Fine science tools | Any standard model | |
Humidified chamber | We use tupperware | ||
Lid of 96 well plate | Nunc | 263339 | |
Microscope slides | Fisher scientific | 12-544-3 | |
Coverslips | Thomas scientific | 6663-F10 | Thickness will vary for particular microscopes |
Center well organ culture dish | Fisher scientific | 353037 | 60 X 15mm |