ביציות נוטים aneuploidy בשל טעויות הפרדה כרומוזום במהלך ההבשלה meiotic. ביצים Aneuploid יכול לגרום לבעיות פוריות הפלות או הפרעות התפתחותיות כמו תסמונת דאון. כאן אנו מתארים שיטות להציג חומרים הבחירה לתוך ביציות ושיטות מחקר התבגרות meiotic ולהעריך ploidy.
טעויות הפרדה כרומוזום להוביל תאים aneuploid. בתאים סומטיים, aneuploidy קשורה לסרטן אך הגמטות, aneuploidy מוביל, הפלות פוריות או הפרעות התפתחותיות כמו תסמונת דאון. הגמטות הפלואידים טופס באמצעות מינים ספציפיים תוכניות התפתחותיות, כי הם מצמידים את המיוזה. החלוקה meiotic הראשון (MI) היא ייחודית כי המיוזה chromatids אחותה להישאר מחובר בזמן כרומוזומים הומולוגיים הם נפרדים. מסיבות לא מובנות לגמרי, חלוקה זו reductional נוטה שגיאות הוא הנפוץ יותר את מקור aneuploidy מאשר טעויות מיוזה II (MII) או יותר טעויות 1,2 המיוזה זכר.
אצל יונקים, ביציות מעצר בבית prophase אמ"ן עם שלפוחית גדולה נבטי שלם (GV; הגרעין) ורק קורות חיים המיוזה כאשר הם מקבלים רמזים הביוץ. לאחר המיוזה קורות חיים, ביציות MI שלם לעבור חלוקת התא סימטרית, לעצור שוב metaphase של MII. ביצים לא להשלים MII עד שהם מופרית על ידי הזרע. ביציות גם יכול לעבור התבגרות meiotic באמצעות הוקמה בשנת תנאים במבחנה תרבות 3. בגלל דור של מוטנטים עכבר מהונדס גנטי ו במיקוד יקר יכול לקחת פרקי זמן ארוכים, מניפולציה של גמטות נשים במבחנה היא אסטרטגיה חסכוני יותר חוסך זמן.
כאן אנו מתארים שיטות לבודד prophase, נעצר ביציות מעכברים עבור microinjection. כל חומר הבחירה עשויה להיות מוחדר הביצית, אלא בגלל meiotically-המוסמכת ביציות שותקות transcriptionally Crna 4,5, ולא דנ"א, חייב להיות מוזרק ללימודי ביטוי חוץ רחמי. כדי להעריך ploidy, אנו מתארים התנאים שלנו ב ההבשלה חוץ גופית של ביציות לביצים MII. מבחינה היסטורית, כרומוזום הפצת טכניקות המשמשות ספירת כרומוזום מספר 6. שיטה זו מאתגרת מבחינה טכנית מוגבלת רק לזיהוי hyperploidies. כאן אנו מתארים שיטה כדי לקבוע תת ו hyperploidies באמצעות ביצים שלמות 7-8. שיטה זו משתמשת monastrol, מעכב kinesin-5, אשר קורסת ציר דו קוטבית לתוך ציר monopolar 9 כרומוזומים ובכך להפריד כזה kinetochores אדם יכול בקלות להיות מזוהה וספר באמצעות נסיוב אנטי CREST אוטואימוניות. בגלל שיטה זו מבוצעת ביצים שלמות, הכרומוזומים לא הולכים לאיבוד בשל טעות של המפעיל.
Microinjection של ביציות היא שיטה חזקה ללמוד המנגנונים המווסתים התבגרות meiotic 10,11, 12, 13. שיטה זו מספקת דרך חסכונית לבחון השערות לפני ביצוע ההשקעה הגדולה בפיתוח מודלים עכבר מהונדס ממוקד. אוסף הביצית וטכניקות microinjection דורשים זמן רב יותר מאשר הורים נהלים ביולוגיה אופייני התא. מכשולים ספציפיים עם אוסף לעיתים קרובות כוללים שליטה על פיפטה בפה, מושך את פיפטה זכוכית בגודל מתאים לאיסוף הפשטה של תאים סומטיים והגדלת מהירות אוסף כדי לצמצם את הזמן שבו ביציות הן מחוץ לחממה. מומלץ לתרגל פעמים רבות לפני ביצוע הניסויים. העברת ביציות בין microdrops תוך שמירה על אותו מספר של תאים היא דרך מצוינת להיות נוח עם שיטה זו.
מוות של תאים נפוצה בזמן למידה microinjection. זה יכול לקרות מכמה סיבות, כולל הזרקת גדול מדי של אמצעי אחסון של חומר (כלומר פתיחת מחט הזרקה גדול מדי), להכות את הגרעין עם מחט הזריקה, פירסינג הצד הנגדי של הביצית או שהחומר המוזרק רעיל הביצית. תרגול עם הזרקה לתוך ביציות חיץ עד שיעור ההישרדות שלך היא לפחות 50% היא המפתח שליטה בטכניקה זו. אם ביציות אינם בשלים סביר להניח כי milrinone לא מדולל מספיק. אנו ממליצים על שטיפת ביציות באמצעות טיפות גדולות רבות CZB milrinone חופשי לפני ההבשלה.
Microinjection ploidy בעקבות הניתוח היא אחת מבחני רבים להעריך התבגרות meiotic. ניתוח שגרתי אחר אנו משתמשים במעבדה כוללים מעקב אחר קינטיקה שבאמצעותו התקדמות ביציות דרך המיוזה, immunofluorescence לנתח את היווצרות ציר ויישור כרומוזום והפעלה ביצה או הפריה חוץ גופית על מנת להעריך את ההשלכות התפתחותיות של מניפולציה הביצית 14,15, 16, 17.
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נערך במעבדה שולץ ריצ'רד מ 's. המחברים רוצה גם להודות מיכאל לאמפסון על המשגה של assay-centromere לספור גישה מיקרוסקופ confocal שלו. תרזה צ'אנג ופרנצ'סקה דאנקן סייע אופטימיזציה של assay centromere-הספירה. פאולה שטיין נתמך על ידי HD022681 (כדי RMS) וקארן שינדלר נתמך על ידי HD055822.
Table of specific reagents:
Name of Reagent | Company | Catalogue Number | Comments |
---|---|---|---|
Milrinone | Sigma-Aldrich | M4659 | Resuspend in DMSO at 2.5mM |
Mineral oil | Sigma-Aldrich | M5310 | Only use embryo-tested, sterile-filtered |
CREST autoserum | Immunovision | HCT-0100 | |
Sytox Green | Invitrogen | 57020 | |
Anti-human Alexa 594 | Invitrogen | A-11014 | |
Vectashield | Vector Laboratories | H-100 | |
Paraformaldehyde | Polysciences | 577773 | |
Albumin from bovine serum | Sigma-Aldrich | A3294 | |
PMSG | Calbiochem | 367222 | |
Monastrol | Sigma-Aldrich | M8515 | Resuspend in DMSO at 100mM |
Tween-20 | Sigma-Aldrich | 274348 | |
TritonX-100 | Sigma-Aldrich | X-100 |
Table of specific equipment:
Name of Equipment | Company | Catalogue Number | Comments |
---|---|---|---|
Mouthpiece | Biodiseno | MP-001-Y | |
Watchglass | Electron Microscopy Sciences | 70543-30 | |
Syringe | B-D | 309623 | 1ml, 27G1/2 |
60 mm Petri Dish | Falcon | 351007 | |
Glass Pasteur pipets | Fisher scientific | 13-678-200 | |
Side warmer | Fisher scientific | Any standard model | |
Dissection microscope | Any standard model | ||
Chamber Slide | Nunc | 177372 | |
Capillary Tubing | Drummond | 1-000-0500 | microcaps |
Pipette Puller | Flaming-Brown micropipette puller | Model P-97 | |
Inverted microscope | Nikon | Any standard model | |
Micromanipulators | Eppendorf | Any standard model | |
Picoinjector | Harvard Apparatus | Model PLI-100 | Any standard model |
CO2 tanks | For incubator | ||
N2 tank | For table and injector | ||
Anti-vibration table | Technical Manufacturing | Any standard model | |
Incubator | Any standard model | ||
Holding pipettes | Eppendorf | 930001015 | Vacutip |
Confocal microscope | Leica | Any standard model | |
Dissection tools | Fine science tools | Any standard model | |
Humidified chamber | We use tupperware | ||
Lid of 96 well plate | Nunc | 263339 | |
Microscope slides | Fisher scientific | 12-544-3 | |
Coverslips | Thomas scientific | 6663-F10 | Thickness will vary for particular microscopes |
Center well organ culture dish | Fisher scientific | 353037 | 60 X 15mm |