Oocytes meiotic परिपक्वता के दौरान गुणसूत्र अलगाव में त्रुटियों के कारण aneuploidy के लिए प्रवण हैं. Aneuploid अंडे बांझपन, गर्भपात, डाउन सिंड्रोम की तरह या विकासात्मक विकारों पैदा कर सकता है. यहाँ, हम विधियों का वर्णन oocytes और meiotic परिपक्वता अध्ययन और ploidy आकलन के तरीकों में पसंद की सामग्री का परिचय.
Mistakes in chromosome segregation lead to aneuploid cells. In somatic cells, aneuploidy is associated with cancer but in gametes, aneuploidy leads to infertility, miscarriages or developmental disorders like Down syndrome. Haploid gametes form through species-specific developmental programs that are coupled to meiosis. The first meiotic division (MI) is unique to meiosis because sister chromatids remain attached while homologous chromosomes are segregated. For reasons not fully understood, this reductional division is prone to errors and is more commonly the source of aneuploidy than errors in meiosis II (MII) or than errors in male meiosis 1,2.
In mammals, oocytes arrest at prophase of MI with a large, intact germinal vesicle (GV; nucleus) and only resume meiosis when they receive ovulatory cues. Once meiosis resumes, oocytes complete MI and undergo an asymmetric cell division, arresting again at metaphase of MII. Eggs will not complete MII until they are fertilized by sperm. Oocytes also can undergo meiotic maturation using established in vitro culture conditions 3. Because generation of transgenic and gene-targeted mouse mutants is costly and can take long periods of time, manipulation of female gametes in vitro is a more economical and time-saving strategy.
Here, we describe methods to isolate prophase-arrested oocytes from mice and for microinjection. Any material of choice may be introduced into the oocyte, but because meiotically-competent oocytes are transcriptionally silent 4,5 cRNA, and not DNA, must be injected for ectopic expression studies. To assess ploidy, we describe our conditions for in vitro maturation of oocytes to MII eggs. Historically, chromosome-spreading techniques are used for counting chromosome number 6. This method is technically challenging and is limited to only identifying hyperploidies. Here, we describe a method to determine hypo-and hyperploidies using intact eggs 7-8. This method uses monastrol, a kinesin-5 inhibitor, that collapses the bipolar spindle into a monopolar spindle 9 thus separating chromosomes such that individual kinetochores can readily be detected and counted by using an anti-CREST autoimmune serum. Because this method is performed in intact eggs, chromosomes are not lost due to operator error.
Oocytes की Microinjection तंत्र है कि meiotic परिपक्वता 10,11, 12, 13 को विनियमित करने के अध्ययन के लिए एक शक्तिशाली विधि है. इस विधि के लिए परिकल्पना ट्रांसजेनिक और लक्षित माउस मॉडल विकसित करने में एक बड़ा निवेश करने से पहले परीक्षण के लिए एक किफायती तरीका प्रदान करता है. Oocyte संग्रह और microinjection तकनीक ठेठ कोशिका जीव विज्ञान प्रक्रियाओं की तुलना में मास्टर और अधिक समय की आवश्यकता है. संग्रह के साथ विशिष्ट बाधाओं अक्सर मुंह विंदुक को नियंत्रित करने, संग्रह के लिए उचित आकार ग्लास विंदुक खींच और दैहिक कोशिकाओं के विपठ्ठन और संग्रह की गति बढ़ाने के लिए समय है जिसमें oocytes इनक्यूबेटर के बाहर हैं कम से कम शामिल है. हम कई बार अभ्यास करने के लिए प्रयोग कर रही करने से पहले सलाह देते हैं. Microdrops बीच oocytes स्थानांतरण जबकि कक्षों की एक ही नंबर को बनाए रखने के लिए एक शानदार तरीका है इस विधि के साथ सहज हो.
कोशिका मृत्यु सामान्यतः होता है, जबकि microinjection सीखने. यह भी सामग्री की मात्रा (यानी इंजेक्शन सुई उद्घाटन भी बड़ा है) की बड़ी इंजेक्शन सहित कारणों की एक संख्या, इंजेक्शन की सुई के साथ नाभिक मार oocyte के विपरीत पक्ष भेदी के लिए या कि हो सकता है इंजेक्शन सामग्री oocyte के लिए विषैला होता है. Oocytes में बफर इंजेक्शन के साथ अभ्यास जब तक आपके जीवित रहने की दर कम से कम 50% है इस तकनीक mastering के लिए महत्वपूर्ण है. यदि oocytes परिपक्व असफल यह संभावना है कि milrinone पर्याप्त नहीं पतला था. हम milrinone मुक्त CZB के कई बड़े बूंदों के माध्यम से परिपक्वता के पहले oocytes rinsing सलाह देते हैं.
ploidy विश्लेषण निम्नलिखित microinjection कई assays के meiotic परिपक्वता का आकलन है. अन्य दिनचर्या विश्लेषण हम प्रयोगशाला में प्रयोग है जिसके द्वारा अर्धसूत्रीविभाजन के माध्यम से oocytes प्रगति, धुरी गठन और गुणसूत्र संरेखण और अंडे सक्रियण विश्लेषण या इन विट्रो निषेचन में oocyte 14,15 हेरफेर के विकास परिणाम, 16 का आकलन करने के लिए immunofluorescence , कैनेटीक्स निगरानी 17.
The authors have nothing to disclose.
इस काम रिचर्ड एम. एस Schultz प्रयोगशाला में आयोजित किया गया. लेखकों को भी परख centromere गिनती और अपने confocal खुर्दबीन उपयोग conceptualizing के लिए माइकल Lampson स्वीकार करते हैं करना चाहते हैं. टेरेसा चियांग और फ्रांसिस्का डंकन centromere – गिनती परख के अनुकूलन में सहायता प्रदान की. पाउला स्टीन HD022681 द्वारा समर्थित है (आरएमएस के लिए) और करेन Schindler HD055822 द्वारा समर्थित है.
Table of specific reagents:
Name of Reagent | Company | Catalogue Number | Comments |
---|---|---|---|
Milrinone | Sigma-Aldrich | M4659 | Resuspend in DMSO at 2.5mM |
Mineral oil | Sigma-Aldrich | M5310 | Only use embryo-tested, sterile-filtered |
CREST autoserum | Immunovision | HCT-0100 | |
Sytox Green | Invitrogen | 57020 | |
Anti-human Alexa 594 | Invitrogen | A-11014 | |
Vectashield | Vector Laboratories | H-100 | |
Paraformaldehyde | Polysciences | 577773 | |
Albumin from bovine serum | Sigma-Aldrich | A3294 | |
PMSG | Calbiochem | 367222 | |
Monastrol | Sigma-Aldrich | M8515 | Resuspend in DMSO at 100mM |
Tween-20 | Sigma-Aldrich | 274348 | |
TritonX-100 | Sigma-Aldrich | X-100 |
Table of specific equipment:
Name of Equipment | Company | Catalogue Number | Comments |
---|---|---|---|
Mouthpiece | Biodiseno | MP-001-Y | |
Watchglass | Electron Microscopy Sciences | 70543-30 | |
Syringe | B-D | 309623 | 1ml, 27G1/2 |
60 mm Petri Dish | Falcon | 351007 | |
Glass Pasteur pipets | Fisher scientific | 13-678-200 | |
Side warmer | Fisher scientific | Any standard model | |
Dissection microscope | Any standard model | ||
Chamber Slide | Nunc | 177372 | |
Capillary Tubing | Drummond | 1-000-0500 | microcaps |
Pipette Puller | Flaming-Brown micropipette puller | Model P-97 | |
Inverted microscope | Nikon | Any standard model | |
Micromanipulators | Eppendorf | Any standard model | |
Picoinjector | Harvard Apparatus | Model PLI-100 | Any standard model |
CO2 tanks | For incubator | ||
N2 tank | For table and injector | ||
Anti-vibration table | Technical Manufacturing | Any standard model | |
Incubator | Any standard model | ||
Holding pipettes | Eppendorf | 930001015 | Vacutip |
Confocal microscope | Leica | Any standard model | |
Dissection tools | Fine science tools | Any standard model | |
Humidified chamber | We use tupperware | ||
Lid of 96 well plate | Nunc | 263339 | |
Microscope slides | Fisher scientific | 12-544-3 | |
Coverslips | Thomas scientific | 6663-F10 | Thickness will vary for particular microscopes |
Center well organ culture dish | Fisher scientific | 353037 | 60 X 15mm |