Ovócitos são propensas a aneuploidia devido a erros na segregação cromossômica durante a maturação meiótica. Aneuplóides ovos pode causar infertilidade, abortos espontâneos ou transtornos de desenvolvimento como a síndrome de Down. Aqui, descrevemos métodos para introduzir materiais de escolha em oócitos e métodos para estudar e avaliar a maturação meiótica ploidia.
Erros na segregação cromossômica levar a células aneuplóides. Em células somáticas, aneuploidia é associado com o câncer, mas nos gametas, aneuploidia leva à infertilidade, abortos espontâneos ou transtornos de desenvolvimento como a síndrome de Down. Gametas haplóides por meio de formulário específico da espécie programas de desenvolvimento que são acoplados a meiose. A primeira divisão meiótica (MI) é exclusivo para a meiose porque cromátides irmãs permanecem ligados enquanto cromossomos homólogos são separados. Por razões ainda não totalmente compreendidas, esta divisão reducional é propenso a erros e é mais comumente a fonte de aneuploidia do que erros na meiose II (MII) ou de erros na meiose masculina 1,2.
Nos mamíferos, os oócitos prisão em prófase da MI com um grande, vesícula intacta germinal (GV; núcleo) e só retomar a meiose quando recebem estímulos ovulatórios. Uma vez que retoma a meiose, oócitos MI completo e passar por uma divisão celular assimétrica, prendendo novamente na metáfase da MII. Ovos não completa MII até que sejam fertilizados por esperma. Oócitos também pode sofrer maturação meiótica utilizando estabelecidos em condições de cultura in vitro 3. Porque a geração de mutantes de camundongos transgênicos e gene-alvo é caro e pode demorar longos períodos de tempo, manipulação de gametas femininos in vitro é uma estratégia mais econômica e economia de tempo.
Aqui, descrevemos métodos para isolar prófase detido oócitos de camundongos e por microinjeção. Qualquer material de escolha pode ser introduzido no óvulo, mas porque meiotically-oócitos competentes são transcricionalmente silenciosos cRNA 4,5, e não DNA, deve ser injetado para estudos de expressão ectópica. Para avaliar a ploidia, descrevemos nossas condições para maturação in vitro de oócitos MII aos ovos. Historicamente, o cromossomo espalhando técnicas são usadas para contar o número de cromossomos 6. Este método é tecnicamente desafiadora e está limitado a apenas identificar hyperploidies. Aqui, descrevemos um método para determinar hipo e hyperploidies usando ovos intactos 7-8. Este método usa monastrol, um inibidor cinesina-5, que entra em colapso o eixo bipolar em um eixo monopolar cromossomos 9 separando assim de tal forma que cinetócoros individuais podem ser facilmente detectadas e contadas usando um soro anti-CREST auto-imunes. Porque este método é realizado em ovos intactos, cromossomos não são perdidos devido a erro do operador.
Microinjeção de ovócitos é um método poderoso para estudar mecanismos que regulam a maturação meiótica 10,11, 12, 13. Este método oferece um modo econômico para testar hipóteses antes de fazer um grande investimento no desenvolvimento de modelos de ratos transgênicos e orientada. Coleta de oócitos e técnicas de microinjeção exigem mais tempo para dominar do que os procedimentos típicos de biologia celular. Obstáculos específicos com a coleta de vezes incluem controlar a pipeta na boca, puxando a pipeta de vidro tamanho adequado para a coleta e remoção das células somáticas e aumentando a velocidade de coleta para minimizar o tempo em que os oócitos estão fora da incubadora. Recomendamos a prática muitas vezes antes de fazer experimentos. Transferência entre oócitos microgotas, mantendo o mesmo número de células é uma ótima maneira de tornar-se confortável com este método.
A morte celular ocorre comumente enquanto aprende microinjeção. Isso poderia ocorrer por uma série de razões, incluindo a injecção de demasiado grande de um volume de material (ou seja, a abertura de agulha é muito grande), atingindo o núcleo com a agulha de injeção, piercing no lado oposto do oócito ou que o material injetado é tóxico para o ovócito. Praticando com injeção de tampão em oócitos até a sua taxa de sobrevivência é, pelo menos, 50% é a chave para dominar esta técnica. Se oócitos maduros não é provável que a milrinona não foi diluída o suficiente. Recomendamos enxaguar os oócitos através de muitos grandes gotas de milrinona livre CZB antes da maturação.
A microinjeção seguintes ploidia análise é um dos muitos testes para avaliar a maturação meiótica. Análises de rotina que usamos no laboratório incluem o monitoramento da cinética pelo qual o progresso através de oócitos meiose, imunofluorescência para analisar a formação do fuso e alinhamento de cromossomos e ativação ovo ou a fertilização in vitro para avaliar as conseqüências do desenvolvimento da manipulação de oócitos 14,15, 16, 17.
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho foi realizado no laboratório de Richard M. Schultz 's. Os autores gostariam também de agradecer Michael Lampson para conceituar o ensaio centrômero-contagem e acesso ao seu microscópio confocal. Teresa Chiang e Francesca Duncan ajudou a otimizar o ensaio centrômero da contagem. Paula Stein é apoiada por HD022681 (para RMS) e Karen Schindler é apoiada por HD055822.
Table of specific reagents:
Name of Reagent | Company | Catalogue Number | Comments |
---|---|---|---|
Milrinone | Sigma-Aldrich | M4659 | Resuspend in DMSO at 2.5mM |
Mineral oil | Sigma-Aldrich | M5310 | Only use embryo-tested, sterile-filtered |
CREST autoserum | Immunovision | HCT-0100 | |
Sytox Green | Invitrogen | 57020 | |
Anti-human Alexa 594 | Invitrogen | A-11014 | |
Vectashield | Vector Laboratories | H-100 | |
Paraformaldehyde | Polysciences | 577773 | |
Albumin from bovine serum | Sigma-Aldrich | A3294 | |
PMSG | Calbiochem | 367222 | |
Monastrol | Sigma-Aldrich | M8515 | Resuspend in DMSO at 100mM |
Tween-20 | Sigma-Aldrich | 274348 | |
TritonX-100 | Sigma-Aldrich | X-100 |
Table of specific equipment:
Name of Equipment | Company | Catalogue Number | Comments |
---|---|---|---|
Mouthpiece | Biodiseno | MP-001-Y | |
Watchglass | Electron Microscopy Sciences | 70543-30 | |
Syringe | B-D | 309623 | 1ml, 27G1/2 |
60 mm Petri Dish | Falcon | 351007 | |
Glass Pasteur pipets | Fisher scientific | 13-678-200 | |
Side warmer | Fisher scientific | Any standard model | |
Dissection microscope | Any standard model | ||
Chamber Slide | Nunc | 177372 | |
Capillary Tubing | Drummond | 1-000-0500 | microcaps |
Pipette Puller | Flaming-Brown micropipette puller | Model P-97 | |
Inverted microscope | Nikon | Any standard model | |
Micromanipulators | Eppendorf | Any standard model | |
Picoinjector | Harvard Apparatus | Model PLI-100 | Any standard model |
CO2 tanks | For incubator | ||
N2 tank | For table and injector | ||
Anti-vibration table | Technical Manufacturing | Any standard model | |
Incubator | Any standard model | ||
Holding pipettes | Eppendorf | 930001015 | Vacutip |
Confocal microscope | Leica | Any standard model | |
Dissection tools | Fine science tools | Any standard model | |
Humidified chamber | We use tupperware | ||
Lid of 96 well plate | Nunc | 263339 | |
Microscope slides | Fisher scientific | 12-544-3 | |
Coverslips | Thomas scientific | 6663-F10 | Thickness will vary for particular microscopes |
Center well organ culture dish | Fisher scientific | 353037 | 60 X 15mm |