Ооциты склонны к анеуплоидии из-за ошибок в сегрегации хромосом во время мейоза созревания. Анеуплоидных яйца могут стать причиной бесплодия, выкидышей или отклонениями в развитии, как синдром Дауна. Здесь мы опишем методы представить материалы по выбору в ооциты и методы для изучения мейоза созревания и оценки плоидности.
Ошибки в сегрегации хромосом приводят к анеуплоидных клеток. В соматических клетках, анеуплоидии связано с раком, но в гаметах, анеуплоидии приводит к бесплодию, выкидышам или отклонениями в развитии, как синдром Дауна. Гаплоидное гамет форме через видоспецифические программ развития, которые связаны с мейоза. Первого деления мейоза (ИМ) является уникальным для мейоза, потому сестринские хроматиды остаются связанными в то время как гомологичные хромосомы отделяются. По причинам, не до конца понял, это разделение reductional склонен к ошибкам и чаще источником анеуплоидии, чем ошибки в мейозе II (MII) или ошибки, чем у мужчин 1,2 мейоза.
У млекопитающих, ооциты арест в профазе ИМ с крупных, нетронутых зародышевого пузырька (Г. В.; ядра), и только возобновление мейоза, когда они получают сигналы овуляции. После мейоза резюме, ооциты полный ИМ и пройти асимметричной деление клеток, арестовав снова в метафазе MII. Яйца не будет полным MII, пока они оплодотворяются спермой. Ооцитов также могут пройти мейоза созревания с использованием установленных в пробирке условия культивирования 3. Потому что поколение трансгенных и генно-целевых мутантов мыши является дорогостоящим и может занять длительное время, манипуляции с женской гамет в пробирке является более экономичным и экономии времени стратегии.
Здесь мы описываем методы, чтобы изолировать профазы арестован ооцитов от мышей и для микроинъекции. Любой материал, выбор может быть введен в яйцеклетку, а потому, meiotically-компетентных ооциты транскрипционно молчание 4,5 кРНК, а не ДНК, должен быть введен для внематочной исследования выражения. Для оценки плоидности, мы описываем наши условия для экстракорпорального созревания ооцитов в MII яйца. Исторически сложилось, что хромосомы распространяющихся методы используются для подсчета числа хромосом 6. Этот метод является технически сложным и ограничивается только выявление hyperploidies. Здесь мы опишем метод, чтобы определить гипо-и hyperploidies использованием нетронутыми яйца 7-8. Этот метод использует monastrol, кинезин-5 ингибитор, который разрушается шпинделя биполярного в монополярный шпинделя 9 отделяя хромосом, что отдельные кинетохоры может быть легко обнаружен и рассчитывал с помощью анти-CREST аутоиммунные сыворотки. Так как этот метод осуществляется в интактных яиц, хромосомы не потеряли из-за ошибки оператора.
Микроинъекция ооцитов является мощным средством для изучения механизмов, которые регулируют созревание мейоза 10,11, 12, 13. Этот метод обеспечивает экономичный способ проверки гипотез, до принятия больших инвестиций в развивающиеся трансгенных и целевых моделей мыши. Сбор яйцеклеток и микроинъекции методы требуют больше времени для освоения, чем обычные процедуры клеточной биологии. Конкретные препятствия в сборе часто включают в себя контроль рот пипеткой, потянув надлежащего размера пипетки стеклянные для сбора и удаления из соматических клеток и повышению скорости сбор чтобы свести к минимуму время, в котором ооциты находятся вне инкубатора. Мы рекомендуем практикующим много раз до делать эксперименты. Передача ооцитов между микрокапель при сохранении того же количества клеток является отличным способом привыкнуть к этому методу.
Гибель клеток обычно происходит во время обучения микроинъекции. Это могло произойти по ряду причин, в том числе введения слишком большой объем материала (то есть открытие инъекционной иглы слишком велик), попав ядра с инъекционной иглой, пирсинг противоположную сторону яйцеклетки или иной материал вводят является токсичным для яйцеклетки. Практика с потребителями инъекционных буфера в ооциты пока выживаемость составляет не менее 50% является ключом к освоению этой техники. Если ооцитов не в зрелом вполне вероятно, что милринон не разбавленный достаточно. Мы рекомендуем промывки ооцитов через многие крупные капли милринон без CZB до созревания.
Плоидности микроинъекции следующий анализ является одним из многих тестов для оценки мейоза созревания. Другие анализы рутины мы используем в лаборатории включают мониторинг кинетики которых ооциты прогресс через мейоз, иммунофлюоресценции, чтобы проанализировать формирование веретена и выравнивание хромосом и активация яйца или экстракорпоральное оплодотворение оценить последствия развития яйцеклетки манипуляции 14,15, 16, 17.
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была проведена в лаборатории Ричарда М. Шульца 'ов. Авторы также хотели бы отметить Майкла Lampson для концептуализации центромеры учета анализа и доступ к его конфокальной микроскопии. Тереза Чан и Франческа Дункан помощь в оптимизации центромеры подсчета анализа. Паула Штайн поддерживается HD022681 (для RMS) и Карен Шиндлера поддерживается HD055822.
Table of specific reagents:
Name of Reagent | Company | Catalogue Number | Comments |
---|---|---|---|
Milrinone | Sigma-Aldrich | M4659 | Resuspend in DMSO at 2.5mM |
Mineral oil | Sigma-Aldrich | M5310 | Only use embryo-tested, sterile-filtered |
CREST autoserum | Immunovision | HCT-0100 | |
Sytox Green | Invitrogen | 57020 | |
Anti-human Alexa 594 | Invitrogen | A-11014 | |
Vectashield | Vector Laboratories | H-100 | |
Paraformaldehyde | Polysciences | 577773 | |
Albumin from bovine serum | Sigma-Aldrich | A3294 | |
PMSG | Calbiochem | 367222 | |
Monastrol | Sigma-Aldrich | M8515 | Resuspend in DMSO at 100mM |
Tween-20 | Sigma-Aldrich | 274348 | |
TritonX-100 | Sigma-Aldrich | X-100 |
Table of specific equipment:
Name of Equipment | Company | Catalogue Number | Comments |
---|---|---|---|
Mouthpiece | Biodiseno | MP-001-Y | |
Watchglass | Electron Microscopy Sciences | 70543-30 | |
Syringe | B-D | 309623 | 1ml, 27G1/2 |
60 mm Petri Dish | Falcon | 351007 | |
Glass Pasteur pipets | Fisher scientific | 13-678-200 | |
Side warmer | Fisher scientific | Any standard model | |
Dissection microscope | Any standard model | ||
Chamber Slide | Nunc | 177372 | |
Capillary Tubing | Drummond | 1-000-0500 | microcaps |
Pipette Puller | Flaming-Brown micropipette puller | Model P-97 | |
Inverted microscope | Nikon | Any standard model | |
Micromanipulators | Eppendorf | Any standard model | |
Picoinjector | Harvard Apparatus | Model PLI-100 | Any standard model |
CO2 tanks | For incubator | ||
N2 tank | For table and injector | ||
Anti-vibration table | Technical Manufacturing | Any standard model | |
Incubator | Any standard model | ||
Holding pipettes | Eppendorf | 930001015 | Vacutip |
Confocal microscope | Leica | Any standard model | |
Dissection tools | Fine science tools | Any standard model | |
Humidified chamber | We use tupperware | ||
Lid of 96 well plate | Nunc | 263339 | |
Microscope slides | Fisher scientific | 12-544-3 | |
Coverslips | Thomas scientific | 6663-F10 | Thickness will vary for particular microscopes |
Center well organ culture dish | Fisher scientific | 353037 | 60 X 15mm |