Los ovocitos son propensos a la aneuploidía debido a errores en la segregación cromosómica durante la maduración meiótica. Huevos aneuploides puede causar infertilidad, abortos involuntarios o trastornos del desarrollo como el síndrome de Down. Aquí se describen los métodos para introducir los materiales de elección en los ovocitos y los métodos para estudiar la maduración meiótica y evaluar la ploidía.
Errores en la segregación cromosómica llevar a las células aneuploides. En las células somáticas, la aneuploidía se asocia con el cáncer, pero en los gametos, la aneuploidía lleva a la infertilidad, abortos involuntarios o trastornos del desarrollo como el síndrome de Down. Gametos haploides forma a través de las especies-programas de desarrollo específicos que se acoplan a la meiosis. La primera división meiótica (MI) es único a la meiosis, porque las cromátidas hermanas permanecen unidas, mientras que los cromosomas homólogos se separan. Por razones que no se entiende, esta división reduccional es propenso a errores y es más común la fuente de aneuploidía que los errores en la meiosis II (MII), o que los errores en la meiosis masculina 1,2.
En los mamíferos, la detención ovocitos en profase de la MI con una vesícula grande, intacto germinal (GV; núcleo) y sólo reanudar la meiosis cuando se reciben señales de la ovulación. Una vez que se reanuda la meiosis, MI ovocitos completo y someterse a una división celular asimétrica, a arrestar de nuevo en la metafase de MII. Los huevos no se completará hasta MII son fertilizados por el esperma. Los ovocitos también pueden someterse a la maduración meiótica utilizando establecido en las condiciones de cultivo in vitro 3. Ya que la generación de mutantes de ratones transgénicos y de genes específicos-es costoso y puede tomar mucho tiempo, la manipulación de los gametos femeninos in vitro es una estrategia más económica y de ahorro de tiempo.
Aquí se describen los métodos para aislar la profase detenido de los ovocitos de ratón y de microinyección. Cualquier material de elección puede ser introducido en el óvulo, sino porque meiotically-competente ovocitos son transcriptionally silencio cRNA 4,5, y no el ADN, se debe inyectar para los estudios de la expresión ectópica. Para evaluar la ploidía, describimos nuestras condiciones para la maduración in vitro de ovocitos MII a los huevos. Históricamente, el cromosoma de propagación se utilizan técnicas para contar el número de cromosomas 6. Este método es técnicamente difícil y se limita a la identificación de hyperploidies. Aquí se describe un método para determinar la hipo y la hyperploidies con huevos intactos 7-8. Este método utiliza monastrol, un inhibidor de la kinesina-5, que se derrumba el huso bipolar en un huso monopolar 9 cromosomas separando así como que cinetocoros individuales pueden ser fácilmente detectados y contados mediante el uso de un suero anti-CREST autoinmunes. Debido a que este método se lleva a cabo en huevos intactos, los cromosomas no se pierden debido a errores del operador.
Microinyección de ovocitos es un poderoso método para estudiar los mecanismos que regulan la maduración meiótica 10,11, 12, 13. Este método ofrece una forma económica de probar las hipótesis antes de hacer una gran inversión en el desarrollo de modelos de ratones transgénicos y de destino. Recolección de los ovocitos y las técnicas de microinyección requieren más tiempo para dominar a los procedimientos típicos de la biología celular. Obstáculos específicos con la colección a menudo incluyen el control de la pipeta de la boca, tirando de la pipeta de vidrio de tamaño adecuado para la recolección y extracción de las células somáticas y el aumento de la velocidad de recogida para reducir al mínimo el tiempo en que los ovocitos se encuentran fuera de la incubadora. Se recomienda la práctica muchas veces antes de hacer experimentos. La transferencia de ovocitos entre microgotas, manteniendo el mismo número de células es una buena manera de sentirse cómodo con este método.
La muerte celular ocurre comúnmente mientras aprenden microinyección. Esto puede ocurrir por varias razones, incluyendo la inyección de demasiado grande de un volumen de material (es decir, la abertura de la aguja de la inyección es demasiado grande), alcanzando el núcleo con la aguja de inyección, la perforación del otro lado de los ovocitos o que el material inyectado es tóxico para el ovocito. Practicar con la inyección de buffer en oocitos hasta que su tasa de supervivencia es de al menos el 50% es la clave para dominar esta técnica. Si no maduran los ovocitos es probable que la milrinona no se diluye bastante. Se recomienda enjuagar los ovocitos a través de muchas gotas grandes de milrinona sin CZB antes de la maduración.
La microinyección siguiente análisis de ploidía es uno de los muchos ensayos para evaluar la maduración meiótica. Otros análisis de rutina que utilizamos en el laboratorio incluyen el control de la cinética en la que el progreso a través de los ovocitos de la meiosis, la inmunofluorescencia para analizar la formación del huso y la alineación de los cromosomas y la activación del huevo o la fertilización in vitro para evaluar las consecuencias del desarrollo de la manipulación de los ovocitos 14,15, 16, 17.
The authors have nothing to disclose.
Este trabajo se llevó a cabo en el laboratorio de Richard M. Schultz 's. Los autores también desean agradecer a Michael Lampson para la conceptualización de la prueba de recuento de centrómero y el acceso a su microscopio confocal. Teresa Chiang y Duncan Francesca ayuda en la optimización de la prueba de recuento de centrómero. Paula Stein con el apoyo de HD022681 (a RMS) y Karen Schindler con el apoyo de HD055822.
Table of specific reagents:
Name of Reagent | Company | Catalogue Number | Comments |
---|---|---|---|
Milrinone | Sigma-Aldrich | M4659 | Resuspend in DMSO at 2.5mM |
Mineral oil | Sigma-Aldrich | M5310 | Only use embryo-tested, sterile-filtered |
CREST autoserum | Immunovision | HCT-0100 | |
Sytox Green | Invitrogen | 57020 | |
Anti-human Alexa 594 | Invitrogen | A-11014 | |
Vectashield | Vector Laboratories | H-100 | |
Paraformaldehyde | Polysciences | 577773 | |
Albumin from bovine serum | Sigma-Aldrich | A3294 | |
PMSG | Calbiochem | 367222 | |
Monastrol | Sigma-Aldrich | M8515 | Resuspend in DMSO at 100mM |
Tween-20 | Sigma-Aldrich | 274348 | |
TritonX-100 | Sigma-Aldrich | X-100 |
Table of specific equipment:
Name of Equipment | Company | Catalogue Number | Comments |
---|---|---|---|
Mouthpiece | Biodiseno | MP-001-Y | |
Watchglass | Electron Microscopy Sciences | 70543-30 | |
Syringe | B-D | 309623 | 1ml, 27G1/2 |
60 mm Petri Dish | Falcon | 351007 | |
Glass Pasteur pipets | Fisher scientific | 13-678-200 | |
Side warmer | Fisher scientific | Any standard model | |
Dissection microscope | Any standard model | ||
Chamber Slide | Nunc | 177372 | |
Capillary Tubing | Drummond | 1-000-0500 | microcaps |
Pipette Puller | Flaming-Brown micropipette puller | Model P-97 | |
Inverted microscope | Nikon | Any standard model | |
Micromanipulators | Eppendorf | Any standard model | |
Picoinjector | Harvard Apparatus | Model PLI-100 | Any standard model |
CO2 tanks | For incubator | ||
N2 tank | For table and injector | ||
Anti-vibration table | Technical Manufacturing | Any standard model | |
Incubator | Any standard model | ||
Holding pipettes | Eppendorf | 930001015 | Vacutip |
Confocal microscope | Leica | Any standard model | |
Dissection tools | Fine science tools | Any standard model | |
Humidified chamber | We use tupperware | ||
Lid of 96 well plate | Nunc | 263339 | |
Microscope slides | Fisher scientific | 12-544-3 | |
Coverslips | Thomas scientific | 6663-F10 | Thickness will vary for particular microscopes |
Center well organ culture dish | Fisher scientific | 353037 | 60 X 15mm |