Oosit mayotik olgunlaşması sırasında kromozom segregasyon hataları nedeniyle anöploidi yatkındır. Anöploid yumurta, kısırlık, düşüklere veya gelişimsel bozukluklar, Down sendromu gibi neden olabilir. Burada, yumurta ve mayotik olgunlaşma incelemek ve Ploidi değerlendirmek için yöntemler seçim malzemeleri tanıtmak için yöntemler açıklanmaktadır.
Kromozom segregasyon hatalar anöploid hücrelere yol. Somatik hücre, anöploidi kanseri ile ilişkili ama gamet, anöploidi Down sendromu gibi kısırlık, düşüklere veya gelişimsel bozukluklar yol açar. Haploid gametlerin mayoz bölünme ile birleştiğinde türe özgü gelişim programları aracılığıyla oluşturur. Kromozomlar ayrı, kardeş kromatidler bağlı kalır çünkü ilk mayoz bölünme (MI) mayoz için eşsizdir. Reductional bölümü tam olarak anlaşılamamış nedenlerden dolayı, bu hataları eğilimli ve daha yaygın hataları daha mayoz II (MII) ya da erkek mayoz 1,2 hataları daha anöploidi kaynağıdır .
Memelilerde, büyük, sağlam germinal vezikül (GV; nükleus) profaz MI oosit tutuklama ve ovulatuar ipuçları aldığınızda sadece mayoz devam. Bir kez mayoz bölünme devam eder, oosit tam MI ve MII, metafaz tekrar yakalama, asimetrik hücre bölünmesi tabi. Yumurta, sperm tarafından döllenmiş kadar MII tamamlayacak. Oosit in vitro kültür koşullarında 3 kurulan mayotik olgunlaşma tabi. Ve gen-hedefli transgenik fare mutantlar üretimi pahalı ve uzun süre alabilir, çünkü in vitro dişi gamet manipülasyonu daha ekonomik ve zaman tasarrufu sağlayan bir stratejidir.
Burada, fareler ve mikroenjeksiyon için profaz-tutuklandı oosit izole etmek için yöntemler açıklanmaktadır. Herhangi bir malzeme tercih oosit içine tanıtıldı olabilir, ama yetkili meiotically-oosit 4,5 Crna değil, DNA transkripsiyonel sessiz çünkü, ektopik ifade çalışmaları için enjekte edilmelidir. Ploidi değerlendirmek için, MII yumurta oositlerin in vitro olgunlaşma için koşulların tanımlanması. Tarihsel, kromozom yayılan teknikleri, kromozom sayısı 6 saymak için kullanılır . Bu yöntem teknik olarak zordur ve sadece hyperploidies belirlenmesi amacıyla sınırlıdır. Burada, hipo-ve sağlam yumurta 7-8 kullanarak hyperploidies belirlemek için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntem, bipolar, iğsi 9 böylece ayıran kromozom bireysel eski haline döner, anti-CREST otoimmün serum kullanılarak kolayca algılanır ve sayılacaktır ki bir monopolar mili içine çöker kinesin-5 inhibitörü, monastrol kullanır . Çünkü bu yöntem sağlam yumurta, kromozomlar, operatör hatası nedeniyle kaybolmuş değildir.
Mikroenjeksiyon oositlerin mayotik olgunlaşma 10,11, 12, 13 düzenleyen mekanizmalar çalışmak için güçlü bir yöntemdir . Bu yöntem ve hedefli transgenik fare modelleri, gelişmekte olan büyük bir yatırım yapmadan önce, hipotezleri test etmek için ekonomik bir yol sağlar. Oosit toplama ve mikroenjeksiyon teknikleri tipik hücre biyolojisi prosedürleri daha master için daha fazla zaman gerektirir. Koleksiyonu ile Özel engeller genellikle koleksiyonu için uygun büyüklükte cam pipet çekerek ve somatik hücre sıyırma ve oosit inkübatör dışında olduğu zaman en aza indirmek için toplama hızını artırarak, ağız pipet kontrol içerir. Biz deneyler yapmak için önce pek çok kez pratik tavsiye ederiz. Aynı sayıda hücre korurken microdrops arasında oosit aktarma, bu yöntem ile rahat olmak için harika bir yoldur.
Mikroenjeksiyon öğrenme sırasında hücre ölümü görülür. Bu enjeksiyon iğne ile oosit karşı tarafında piercing çekirdeği isabet nedenlerle çok büyük bir malzeme hacmi (yani bir iğne açılması çok büyük) enjeksiyonu da dahil olmak üzere bir dizi,, ya da meydana gelebilir enjekte edilen malzeme oosit için zehirlidir. Hayatta kalma oranı en az% 50 kadar oosit içine enjekte tampon Uygulama mastering bu tekniğin önemli. Oosit olgunlaşması için başarısız olursa milrinon yeterince seyreltilmiş olmadığını muhtemeldir. Biz olgunlaşma önce milrinon ücretsiz CZB çok büyük damlalar yoluyla oosit durulama önerilir.
Ploidi analizi aşağıdaki mikroenjeksiyon mayotik olgunlaşma değerlendirmek için birçok testlerinin biridir. Laboratuvarda kullanan diğer rutin analizler kinetiği izleme mili oluşumu ve kromozom uyum ve yumurta aktivasyonu analiz ya da in vitro fertilizasyon oosit manipülasyon 14,15 gelişimsel sonuçları, 16 değerlendirmek için immünofloresan mayoz yoluyla oosit ilerleme, 17.
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma, Richard M. Schultz 'un laboratuvarında gerçekleştirildi. Yazarlar ayrıca sentromer sayma tahlil ve onun konfokal mikroskop erişim kavramsallaştırma Michael Lampson kabul etmek istiyorum. Teresa Çan ve Francesca Duncan sentromer sayma tahlil optimize etmede yardımcı oldu. Paula Stein HD022681 tarafından desteklenen (RMS) ve Karen Schindler HD055822 tarafından desteklenmektedir.
Table of specific reagents:
Name of Reagent | Company | Catalogue Number | Comments |
---|---|---|---|
Milrinone | Sigma-Aldrich | M4659 | Resuspend in DMSO at 2.5mM |
Mineral oil | Sigma-Aldrich | M5310 | Only use embryo-tested, sterile-filtered |
CREST autoserum | Immunovision | HCT-0100 | |
Sytox Green | Invitrogen | 57020 | |
Anti-human Alexa 594 | Invitrogen | A-11014 | |
Vectashield | Vector Laboratories | H-100 | |
Paraformaldehyde | Polysciences | 577773 | |
Albumin from bovine serum | Sigma-Aldrich | A3294 | |
PMSG | Calbiochem | 367222 | |
Monastrol | Sigma-Aldrich | M8515 | Resuspend in DMSO at 100mM |
Tween-20 | Sigma-Aldrich | 274348 | |
TritonX-100 | Sigma-Aldrich | X-100 |
Table of specific equipment:
Name of Equipment | Company | Catalogue Number | Comments |
---|---|---|---|
Mouthpiece | Biodiseno | MP-001-Y | |
Watchglass | Electron Microscopy Sciences | 70543-30 | |
Syringe | B-D | 309623 | 1ml, 27G1/2 |
60 mm Petri Dish | Falcon | 351007 | |
Glass Pasteur pipets | Fisher scientific | 13-678-200 | |
Side warmer | Fisher scientific | Any standard model | |
Dissection microscope | Any standard model | ||
Chamber Slide | Nunc | 177372 | |
Capillary Tubing | Drummond | 1-000-0500 | microcaps |
Pipette Puller | Flaming-Brown micropipette puller | Model P-97 | |
Inverted microscope | Nikon | Any standard model | |
Micromanipulators | Eppendorf | Any standard model | |
Picoinjector | Harvard Apparatus | Model PLI-100 | Any standard model |
CO2 tanks | For incubator | ||
N2 tank | For table and injector | ||
Anti-vibration table | Technical Manufacturing | Any standard model | |
Incubator | Any standard model | ||
Holding pipettes | Eppendorf | 930001015 | Vacutip |
Confocal microscope | Leica | Any standard model | |
Dissection tools | Fine science tools | Any standard model | |
Humidified chamber | We use tupperware | ||
Lid of 96 well plate | Nunc | 263339 | |
Microscope slides | Fisher scientific | 12-544-3 | |
Coverslips | Thomas scientific | 6663-F10 | Thickness will vary for particular microscopes |
Center well organ culture dish | Fisher scientific | 353037 | 60 X 15mm |