Summary
Il intraluminale occlusione dell'arteria cerebrale media (MCAO) modello è il modello più frequente tra i modelli sperimentali utilizzati ictus ischemico. Qui dimostrerà tutto il modello in dettaglio con la guida di flussimetria laser Doppler, ed i suoi risultati rappresentativi.
Abstract
L'ictus è la terza causa di morte e la principale causa di disabilità nel mondo, con un costo stimato di quasi 70 miliardi dollari negli Stati Uniti nel 2009 1,2. Il intraluminale occlusione dell'arteria cerebrale media (MCAO) il modello è stato sviluppato da Koizumi 4 nel 1986 per simulare questa patologia di forte impatto umano nel ratto. Una modifica del metodo di MCAO è stato poi presentato dalla Longa 3. Entrambe le tecniche sono stati ampiamente utilizzati per identificare i meccanismi molecolari delle lesioni cerebrali da ictus ischemico e potenziali modalità terapeutiche 5. Questo metodo relativamente non invasivo nei ratti è stata estesa da utilizzare nei topi per sfruttare ceppi transgenici e knockout 6,7. Per modello di ischemia cerebrale focale, una sutura intraluminale è avanzato attraverso l'arteria carotide interna per occludere la base del MCA. Ritraendo la sutura dopo un determinato periodo di tempo imita riperfusione spontanea, ma la sutura può essere mantenuto in permanenza. Questo video sarà dimostrare i due principali approcci per l'esecuzione di intraluminale procedura MCAO nei topi in modo graduale, oltre a fornire spunti per potenziali svantaggi e le insidie. Il tessuto cerebrale ischemico sarà successivamente colorate con 2,3,5-trifeniltetrazolio cloruro (TTC) per valutare il grado di infarto cerebrale 8.
Protocol
Questo protocollo è stato approvato dalla cura degli animali e utilizzo Comitato Istituzionale (IACUC) presso l'Università della Florida ed è conforme con il "Principio di prodotti per animali da laboratorio" (NIH pubblicazione n ° 86-23, riveduta 1985).
1. Materiale
- Animali: maschio topi C57BL / 6 (Laboratori di Harlan, Indianapolis, IN, USA) pesa 20-26 grammi al momento della chirurgia.
- Anestesia:
- Anestesia macchina: sistema di inalazione VetEquip anestesia (VetEquip Inc., Pleasanton, CA, USA).
- Inalazione anestetico: isoflurano (Farmaceutica Baxter, Deerfield, IL).
- Strumenti chirurgici: SuperCut forbici Iris, diritto (Strumenti di precisione del Mondo, Inc., Sarasota, FL, USA); Vännäs micro-forbici, diritto (Strumenti di precisione del Mondo, Inc., Sarasota, FL, USA); Dumont pinze (punta fine, 45 ° punte piegate, strumenti di precisione del Mondo, Inc., Sarasota, FL, USA), unità di coagulazione bipolare (Essiccatore ad alta frequenza 900, Strumenti di precisione del Mondo, Inc., Sarasota, FL, USA), clip nave micro (Strumenti di precisione mondiale, Inc., Sarasota, FL, USA)
- Attrezzature chirurgiche: punte sterili di cotone; Panni, spugne garza; sutura (7-0 sutura Seta, Ethicon, Inc., Somerville, NJ, USA); adesivo tissutale (Vetbond, 3M Company, St. Paul, MN, USA); scrub chirurgico : Bethadine, 70% di etanolo, e sterile, soluzione fisiologica allo 0,9%; unguento oculare (Unguento Vet Puralube, Pharmaderm, Melville, NY, USA).
- Occlusione sutura preparazione MCAO:
- Filamento per la MCA occlusione: 7-0 chirurgica sutura monofilo di nylon (Ethicon, Inc., Somerville, NJ, USA).
- Fonte di calore per ottundimento punta sutura (Unità Cauterio termica, World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL).
- Gomma siliconica liquida (silicone RTV adesivo, World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, USA).
- Chirurgico / dissezione microscopio (Microscopio stereo Leica MZ6).
- Illuminatore in fibra ottica (Fiber Optic illuminatore FO1-150, TechniQuip Corp., Livermore, CA, USA).
- Flussimetria laser Doppler (PeriFlux System 5000, Perimed, Stoccolma, Svezia).
- Flessibile microtip (MT Microtip B500-0 Etero, Perimed, Stoccolma, Svezia)
- Temperatura di parametri:
- Rettale temperature monitor (BAT-12, strumenti di precisione del Mondo, Inc., Sarasota, FL).
- Coperta termica (T / POMPA, TP600, Gaymar, NY, USA).
- Colorazione e la misurazione quantitativa di infarto del volume:
- Soluzione al 2% 2,3,5-trifeniltetrazolio cloruro (2% TTC, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA).
- I topi cervello matrice affettatrice (Zivic Miller-Lab. Inc., Allison Park, PA, USA).
- Fotocamera digitale (V1253, Kodak Co., Rochester, NY, USA).
- Immagine J software (ImageJ 1.42q software, US National Institutes of Health, Bethesda, MA, USA).
2. Pre-chirurgica passi
- Prima dell'intervento, i topi sono alloggiati sotto una 12:12 ciclo luce / buio con libero accesso all'acqua e roditori chow.
- Punti di sutura per MCAO sono preparati da ottundimento 1-2mm della punta sutura con il calore e rivestimento 3-4mm dell'albero sutura dalla sua punta in gomma silicone liquido, che permette ad asciugare (7-0, diametro punta, 0,20, 0,25 millimetri, rivestimento lunghezza, 3-4mm, lunghezza sutura 11-13mm). Sterilità devono essere conservati in tutte le fasi di cui sopra.
- Dopo aver soppesato il mouse, l'anestesia viene indotta con il 4% isoflurano in una camera di induzione e mantenuta durante la procedura con 1,5-2% isoflurano nel 30% O 2 e 70% N 2 O miscela di gas tramite una maschera facciale.
- Il mouse è posto in posizione prona su un tampone di garza disteso su una superficie a temperatura controllata operativa (coperta termica), la pelliccia testa rasata.
- Pomata oftalmica lubrificante viene applicato in entrambi gli occhi, e le palpebre sono chiuse per prevenire l'essiccamento occhio durante il processo chirurgico.
- Una linea mediana incisione (1 cm) è effettuata sulla cute sovrastante la calotta cranica dalla linea nucale superiore al nasion e la pelle è tirata lateralmente di apporre un microtip flessibile (MT B500-0 Microtip Etero, diametro 0,5 mm). Il microtip è posto perpendicolarmente alla superficie del cranio parietale destra (1 mm posteriormente e 5 mm lateralmente al bregma) per monitorare il flusso di sangue nel territorio MCA flussimetria laser Doppler.
- Assicurarsi che il microtip flessibile è collegato al cranio saldamente prima che l'animale è rivolto a una posizione supina. Collo dell'animale è posto su un tappetino morbido e il suo naso è tenuto a cono dei sistemi per anestesia. Questo sarà il risultato di avere spazio sufficiente per il microtip flessibile.
- Una sonda di temperatura rettale è inserito per mantenere costante la temperatura interna degli animali di 37 ± 0,5 ° C.
- Entrambe le zampe anteriori e hindpaws sono nastrate per la superficie di piattaforma operativa, e la coda è registrato al tubo rettale. </ Ol>
- Sotto il microscopio operatorio, una incisione del collo linea mediana è fatto con le forbici tra il manubrio e la mascella sollevando delicatamente la pelle flaccida.
- La coppia ghiandole sottomandibolari sono alla base senza mezzi termini divisi, con la ghiandola sinistra lasciato in situ. La ghiandola sottomandibolare destra è ritratto cranialmente e fissato con il muscolo sternocleidomastoideo.
- La divisione esposto del muscolo omo-ioideo che copre la guaina carotidea è accuratamente diviso con pickup.
- Il diritto arteria carotide comune (CCA) è accuratamente separati e isolati dal nervo vago e la sua guaina (situato lateralmente al CCA).
- D'ora in poi, i 2 metodi chirurgici che sono stati utilizzati di frequente per eseguire MCA occlusione divergono:
- Tre punti di sutura collare sciolti (7-0 seta) sono disposte intorno alla destra CCA.
- L'arteria carotide esterna (ECA) è identificato, isolato e cauterizzato (2-3mm distale di biforcazione). Essa può essere successivamente suddiviso con micro-forbici. Per evitare involontari danni periferici nel sito cauterizzazione, la potenza dovrebbe essere impostato a 1 con la manopola di alimentazione. Ciò è coerente per tutti i cauterizzazioni.
- Tensione sufficiente è applicata al collare di sutura più prossimale del CCA per occludere il flusso di sangue (legatura permanente). L'occlusione del flusso sia verificata da un calo ~ 50% dei valori basali perfusione corticale.
- Poi una clip nave si trova appena prima della biforcazione CCA per evitare il flusso retrogrado al momento della arteriotomia.
- Un arteriotomia viene eseguita tra la sutura prossimale legati e la clip sulla nave CCA con micro-forbici (più vicino alla legatura).
- Il calore smussato e siliconato 7-0 sutura in nylon viene introdotto attraverso il arteriotomia e avanzate fino a raggiungere la clip nave. I 2 punti di sutura rimanenti collare sciolti sono delicatamente serrate intorno al CCA tra il arteriotomia e il clip nave per evitare perdite di nuovo il flusso attraverso CCA, con attenzione a non traumatizzare la parete arteriosa, poi la clip nave è ritirata.
- L'ECA è identificato, si disgregano per quanto possibile (nei pressi della sua biforcazione nelle arterie linguale e mascellare), cauterizzato (con potenza impostata a 1), e diviso con micro-forbici.
- Due punti di sutura collare sciolti (7-0 seta) sono disposte intorno alla ICA prossimale appena sopra la biforcazione CCA.
- Il CCA è temporaneamente chiuso con una clip nave. L'occlusione del flusso sia verificata da un calo ~ 50% dei valori basali perfusione corticale.
- Poi l'ICA è temporaneamente chiuso con una clip nave al di sopra dei due punti di sutura perdere collare per evitare il flusso retrogrado al momento della arteriotomia.
- Un arteriotomia viene eseguita utilizzando micro-forbici nella vicina Corte dei conti riflette al moncone.
- Il calore smussato e siliconato 7-0 sutura in nylon viene introdotto attraverso il arteriotomia in Corte dei conti e avanzate fino a raggiungere la clip nave applicata in ICA. I 2 punti di sutura collare sciolto in prossimale ICA sono delicatamente serrate intorno al prossimale ICA per evitare il flusso riflusso sanguigno attraverso ICA, con sufficiente attenzione a non traumatizzare la parete arteriosa, poi la clip nave è ritirata.
- La sutura occlusione è avanzato lentamente attraverso l'arteria carotide interna (ICA) verso la base cranica fino alla resistenza mite si fa sentire. Una goccia concorrenti in termini di valore del flusso ematico cerebrale in percentuale (= 80%) rispetto al basale è confermato dalla flussimetria laser Doppler. I 2 punti di sutura collare sono stretti attorno al filamento inseriti.
- Per esperimenti di ischemia cerebrale transitoria, la sutura occlusione viene ritirata delicatamente dopo 45 minuti. Questo punto di tempo può essere modificato per vari scopi sperimentali.
- Dopo aver estratto il filo di sutura, il sito arteriotomia è chiuso per evitare di sanguinamento post-operatorio. Nel metodo di Koizumi, si tratta di serraggio in modo sicuro le suture collare intorno al CCA. Nella tecnica Longa, il sito arteriotomia alla base della ECA è cauterizzato, poi i punti di sutura al colletto prossimale ICA sono allentati e rimossi per ripristinare il flusso carotideo.
- Per chiudere l'incisione, la ghiandola sottomandibolare e SCM sono disposti sopra il campo operatorio. I bordi della ferita sono poi approssimato con l'adesivo in tessuto cervicale e nelle aree del cuoio capelluto. In alternativa, una graffetta sutura assorbibile o metallo potrebbe essere usato per chiudere la ferita soprattutto quando sopravvivenza a lungo termine degli animali è destinato.
- Dopo la chiusura incisione, l'animale riceve 1 salina calda ml per via sottocutanea come riempimento del volume. Una dose di analgesici appropriati (cioè Buprenorfina a 0,05-0,1 mg / kg) deve essere utilizzato per minimizzare il dolore dell'animale e il disagio durante il periodo di recupero. L'animal è rimosso dalla sala operatoria e messo in una gabbia di recupero zona calda / per prevenire l'ipotermia, con libero e facile accesso al cibo e di acqua dolce.
- nessun deficit osservabili
- mancata estensione zampa controlaterale (lieve deficit neurologico focale)
- girando in una direzione controlaterale per infarto (moderato deficit neurologici focali)
- cadendo in una direzione controlaterale a infarto (grave deficit neurologici focali)
- depressione del livello di coscienza senza movimento spontaneo
- Dopo 24 ore di riperfusione MCA, il topo sopravvissuto viene pesato, profondamente anestetizzati con il 4% isoflorane, e sacrificato secondo il protocollo approvato.
- Il cervello è accuratamente rimosso e collocato in una affettatrice cervello di topo matrice, e il cervello intero coronale sezionati a intervalli di 2 mm.
- Le sezioni sono immersi nel 2% TTC in tampone fosfato (PBS) a 37 ° C per 20 minuti. Dopo la colorazione TTC, zona infracted viene mostrato come (non colorate) tessuto bianco adiacente al rosso mattone (vitali) del tessuto (Figura 1).
- Sezioni seriali vengono fotografati con una macchina fotografica digitale e la zona di infarto viene misurata con il programma J immagine.
- L'area di infarto (bianco, senza macchia), la zona dell'emisfero ipsilaterale (bianco e rosso mattone, macchiato), e la zona dell'emisfero controlaterale (rosso mattone, macchiato) sono misurati per ogni sezione. Il volume è calcolato sommando le aree di rappresentanza in tutte le sezioni e moltiplicando per lo spessore della fetta. Dopo aver corretto per l'edema, il volume di infarto è calcolato come segue 9:
Volume dell'infarto corretta (CIV),% = [volume nell'emisfero controlaterale - (volume emisfero ipsilaterale - volume dell'infarto)] volume emisfero / controlaterale x 100
3. MCA occlusione chirurgia:
Koizumi 4 Metodo
Longa di 3 Metodo
Il resto della procedura è ampiamente convergenti:
4. Post-Op valutazione neurologica
Dopo che l'animale riprenda coscienza totale, deficit neurologici possono essere valutati da una scala semplice (scala a cinque punti) come segue 3:
5. Colorazione e la misurazione quantitativa del volume cerebrale infarto
6. Rappresentante Risultati
Dopo l'occlusione e riperfusione del MCA tramite sinistra CCA per stabilire transitoria ischemia cerebrale, gli animali sono sacrificati ed i loro cervelli sezionati coronale sono colorati con TTC per valutare il volume di infarto (Figura 1).
Figura 1. Sezioni di serie TTC-macchiato cervello coronale (2 mm) di topi sottoposti a MCA occlusione.
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Discussion
Il modello MCAO è un modello stabilito che replica ischemia cerebrale in specie murina. Questo modello è stato utilizzato nel ratto e successivamente adattato alle topi. Evitare craniectomia per eliminare l'influenza di manipolazione chirurgica sulla permeabilità della barriera emato-encefalica e della pressione intracranica è un vantaggio di questa tecnica. Tuttavia, molte variabili, come il ceppo differenze legate al 10, dimensioni della punta di sutura 11, durata dell'occlusione 6, temperatura corporea 12, l'anestesia 13, e altri fattori possono portare a inconsistenza dei volumi infarto in questo modello.
Ci sono dettagli tecnici specifici che meritano di essere:
- Rivestimento fine di sutura creerà una sutura liscia e gestibile per occludere la MCA con rischio di perforazione diminuito.
- Delicatamente separati e ben il nervo vago dalle arterie adiacenti in modo che non venga inavvertitamente ristretta in un collare di sutura. Assicurarsi di utilizzare due punti di sutura collare per evitare emorragie retrograda attraverso il arteriotomia in salita la sutura occlusione e stringere delicatamente per evitare di traumatizzare la parete arteriosa.
- L'arteria pterigopalatina diverge dalla ICA dopo CCA biforcazione. Per evitare di deviare la punta di sutura ascendente nell'arteria pterigopalatina invece della ICA, impostare la piattaforma chirurgico per mantenere la testa e il collo del mouse in una direzione diritta. Questa deviazione è comune ad entrambe le Koizumi e la tecnica Longa, così la cura deve essere presa in entrambe le procedure.
- Flussimetria laser Doppler è un metodo di monitoraggio in tempo reale del flusso sanguigno nelle diverse regioni anatomiche, ed è applicata nel nostro esperimento per misurare il flusso sanguigno nella zona del cervello fornito tramite MCA. Aumenta sensibilmente la precisione del posizionamento sutura e, quindi, assicura ottenere risultati coerenti. Questo è un vantaggio rispetto alle tecniche notato meno preciso di misurare la lunghezza della sutura da inserire, che è suscettibile alle interferenze di variazioni anatomiche.
- Un aumento temporaneo flussimetria laser Doppler, mentre inserendo la tua sutura attraverso CCA e ICA assicura che si stanno muovendo nella giusta direzione e vicino al ostium MCA.
- L'arteria occipitale più spesso nasce dalla Corte dei conti prossimale (anche se a volte dalla ICA) in una direzione postero-laterale. Dovrebbe essere identificato (in alcuni casi legatura) per evitare confusione in seguito durante l'inserimento della sutura.
- Per diminuire la variabilità di infarto, mantenere la temperatura corporea costante del mouse durante l'intervento ed evitare l'ipotermia dopo l'intervento chirurgico.
- Usa TTC colorazione fino a 72 ore dopo l'intervento MCAO per analizzare il volume dell'infarto in modo appropriato. Per più punti il tempo di sopravvivenza utilizzare altri metodi di colorazione, come colorazione violetto cresolo per determinare la dimensione dell'infarto.
| Metodo di Koizumi | Metodo di longa | |
| Sito di inserimento sutura | Ipsilaterale carotide comune | Ipsilaterale arteria carotide esterna |
| Permanente sacrificio arteriosa | Comune arterie carotidee e carotide esterna | Dell'arteria carotide esterna |
| Pericolo di morte per rottura intraoperatoria arteriosa / emorragia | Meno preoccupazione | Maggiore preoccupazione |
| Possibilità di deviazione sutura in arteria pterigopalatina | Sì | Sì |
| Tempi procedurali | Generalmente più veloce | Generalmente più |
| Flussimetria laser Doppler: calo percentuale dal basale | > = 80% | > = 80% |
| Flussimetria laser Doppler: occlusione / riperfusione tendenza |
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Tabella 1. Confronto fra due metodi di intraluminale occlusione dell'arteria cerebrale media (MCAO) nei topi
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere alcun conflitto di interessi.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Male C57BL/6 mice | Animal | Harlan Laboratories | 20-26 grs | |
| Dissection microscope | Microscope | Leica Microsystems | 6.3:1 zoom | |
| Fiber optic illuminator | Illuminator | TechniQuip Corp., Livermore, CA, USA | FO1–-150 | |
| Isoflurane | Anesthesia | Baxter Internationl Inc. | 1001936060 | |
| SuperCut Iris scissor, straight | Surgical tool | World Precision Instruments, Inc. | 14218 | |
| Vannas micro-scissor, straight | Surgical tool | World Precision Instruments, Inc. | 14003 | |
| Dumont fine tip forceps | Surgical tool | World Precision Instruments, Inc. | 503290 | |
| Vessel clip | Surgical tool | World Precision Instruments, Inc. | 14120 | |
| High Frequency Desiccator 900 | Surgical tool | World Precision Instruments, Inc. | 500397 | |
| 7-0 surgical Nylon monofilament suture | Suture | Ethicon Inc. | 1647G | Suture for occlusion |
| 7-0 surgical Silk suture | Suture | Ethicon Inc. | 7733G | Suture for ligation |
| Silicone RTV adhesive | Silicone rubber | World Precision Instruments, Inc. | 1571 | |
| Vetbond | Tissue adhesive | 3M | 70200746587 | |
| Puralube Vet Ointment | Eye ointment | Pharmaderm Animal Health | ||
| Buprenorphine hydrochlorode | Analgesics | Hospira Inc. | NDC 0409-2012-32 | |
| Thermal Cautery Unit | World Precision Instruments, Inc. | 501292 | ||
| PeriFlux System 5000 | TCD flowmetry | Perimed | ||
| BAT-12 | Rectal thermometer | World Precision Instruments, Inc. | BAT-12R | |
| T/PUMP, TP600 | Thermal blanket | Gaymar Industries | ||
| 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride | Reagent | Sigma-Aldrich | T8877 | |
| Mice brain matrix slicer | Brain slicer | Zivic Instruments | BSMAS001-1 |
References
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