Summary
Fluorescerende nanodeeltjes geproduceerd in ons lab wordt gebruikt voor beeldvorming ion concentraties en fluxen ion in biologische systemen zoals cellen tijdens de signalering en interstitiële vloeistof tijdens fysiologische homeostase.
Abstract
Streng gereguleerd ion homeostase door het gehele lichaam noodzakelijk is voor het voorkomen van dergelijke slopende staten als uitdroging. 1 In tegenstelling, een snelle ion fluxen op cellulair niveau zijn nodig voor het starten actiepotentialen in exciteerbare cellen. 2 Natrium regelgeving speelt een belangrijke rol in beide deze gevallen, maar er geen methode bestaat op dit moment om toezicht te houden hoeveelheden natrium in vivo 3 en intracellulaire natrium-sondes 4 voorzien niet in dezelfde gedetailleerde resultaten als calcium sondes. In een poging om beide holten op te vullen, zijn fluorescerende nanosensoren ontwikkeld die kan natrium concentraties monitor in vitro en in vivo. 5,6 Deze sensoren zijn gebaseerd op de ion-selectieve optode technologie en bestaat uit geplastificeerd polymere deeltjes waarin natrium specifieke erkenning elementen, pH-gevoelige fluoroforen, en additieven zijn ingebed. 7-9 Adapaleen de natrium-erkenning element extracten natrium in de sensor. 10 Deze extractie zorgt ervoor dat de pH-gevoelige fluorofoor naar een waterstof-ion vrij te laden neutraliteit te handhaven binnen de sensor waardoor een verandering in de fluorescentie. De natrium-sensoren zijn reversibele en selectieve natrium voor meer dan kalium, zelfs bij hoge intracellulaire concentraties. 6 Ze zijn ongeveer 120 nm in diameter en zijn gecoat met polyethyleen glycol op biocompatibiliteit geven. Met behulp van micro-injectie technieken, kunnen de sensoren worden geleverd in het cytoplasma van de cellen, waar ze is aangetoond dat de temporele en ruimtelijke dynamiek van natrium kloppende hartspiercellen te controleren. 11 Bovendien hebben zij ook gevolgd in real-time veranderingen in de natrium-concentratie in vivo bij injectie subcutaan in muizen 3 Hierin we in detail uitleggen en demonstreren van de methodologie voor het vervaardigen van TL-natrium nanosensoren en in het kort tonen de biologische toepassingen ons lab de nanosensoren gebruikt voor:. de micro-injectie van de sensoren in cellen, en de subcutane injectie van de sensoren in muizen .
Protocol
1. Voorbereiding van de optode
Alvorens de optode, fracties van de componenten zijn nodig, zodat ze gemakkelijk kunnen worden gemeten en opgeslagen.
- Een 50 mg natrium ionofoor X (Naix) flacon en een 50 mg natrium tetrakis [3,5-bis (trifluormethyl) fenyl] boraat (NaTFPB) zullen elk worden opgevoed in tetrahyrdofuran (THF) en in hoeveelheden verdeeld in 1,5 ml polystyreen centrifugebuizen. In een chemische dampkap, los de 50 mg Naix in 1 ml van THF in de scheepvaart flacon en mix om ervoor te zorgen dat de vaste volledig is opgelost. Breng 100 ul van deze oplossing in 10 aparte centrifuge buizen. Herhaal dit voor NaTFPB. Laat de THF een nacht verdampen in een chemische zuurkast, de centrifugebuizen label en plaats ze in een 4 graden koelkast voor opslag. Dit leidt tot 5 mg aliquots van droge Naix en NaTFPB.
- Los van de Chromoionophore III (CHIII) in 1 ml van THF en transfer naar een 3 ml glazen flacon. Voeg nog een 1 ml van THF aan de CHIII scheepvaart flacon om eventuele resten van CHIII te ontbinden en dit toe te voegen aan de 3 ml glazen flacon. Er zal een totaal van 2 ml nu. Breng 1 ml van de CHIII in THF oplossing om twee afzonderlijke 1,5 ml glazen flacons met een Teflon coating caps. Bewaar de CHIII oplossing in een koelkast 4 graden op de uiteindelijke concentratie van 5 mg / ml.
Deze monsters en oplossingen zullen worden gebruikt om de optode materiaal te maken.
- Pipetteer 66 ul van bis (2-ethylhexyl) sebacaat (DOS) in een 1,5 ml glazen flacon met een teflon coating schroefdop - dit is de optode flacon. DOS is een viskeuze oplossing dus zorg moeten worden genomen om de juiste hoeveelheid oplossing te garanderen wordt overgebracht naar de flacon. Het volume komt overeen met ~ 60 mg van DOS.
- Weeg 30 mg met een hoog molecuulgewicht poly (vinyl) chloride (PVC) en breng dit aan de optode flacon.
- Nu is de hoeveelheden verdeeld functionele componenten toe te voegen aan de optode flacon om de gewenste optode te creëren. De relatieve concentraties van CHIII, Naix, en NaTFPB is bepalend voor de reactie van de sensor natrium. Deze concentraties kunnen worden aangepast aan een sensor die perfect reageert op de intracellulaire concentraties, met een Kd van 10 mm, of extracellulaire concentraties, met een Kd van 150 mm hebben. Daarnaast zal er waarschijnlijk partij tot partij variabiliteit van de chemicaliën uit de verkoper en kalibratie van de sensoren is noodzakelijk om te bepalen of de juiste reactie is zich van elke nieuwe partij van chemische componenten. Hier beschrijven we de methode om een sensor te maken met de concentratie die doorgaans worden gebruikt voor intracellulaire natrium-metingen.
- In een chemische dampkap, overdracht 100 ul van de 5 mg / ml CHIII in THF oplossing voor de optode flacon.
- Los 5 mg Naix in 300 ul van THF en overdracht 300 ul van de optode flesje, dit correleert met 5 mg Naix.
- Los een 5 mg hoeveelheid van de NaTFPB in 500 pi van THF en overdracht 20 ul van de oplossing voor de optode flesje, dit correspondeert met 0,1 mg NaTFPB.
- Voeg 80 ul van THF aan de optode flacon.
- De oplossing in de optode flacon bevat 30 mg van PVC, 60 mg van DOS, 5 mg Naix, 0,2 mg NaTFPB, 0,5 mg CHIII in 500 pi van THF. Voorzichtig vortex deze flacon totdat al het PVC is opgelost. De optode moet een rode kleur. Het totale bedrag van de THF toegevoegd aan de flacon moet 500 pL worden, ongeacht de verhouding van de gebruikte componenten.
- Laat de rest van THF in de Naix en NaTFPB aliquots om 's nachts en re-label van de buis met de juiste hoeveelheid van de chemische verdampen.
2. Het creëren van nanosensoren
- Pipetteer 100 ul van 10 mg / ml 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-Phosphoethanolamine-N - [Methoxy (polyethyleenglycol) -550] in chloroform (PEG-lipide) in een 4 dram glazen flacon. Laat de chloroform te verdampen in een chemische dampkap. Dit proces kan worden versneld door het drogen van de oplossing met stikstofgas of huis lucht.
- Voeg 4 ml van de gewenste waterige oplossing aan de flacon met PEG-lipide. Plaats de flacon op een laboratorium krik onder de sonicating tip en verhogen de flacon totdat de punt is ongeveer 7 mm diep in de oplossing en ultrasone trillingen op een laag sonicatie vermogen voor 30 seconden. Hier gebruiken we een digitaal Branson sonifier ingesteld op 15% amplitude met een ½ inch tip diameter stap hoorn. De waterige oplossing kan een oplossing zijn. Bijvoorbeeld, om de reactie van de sensoren we 10 mM HEPES pH 7.2 te gebruiken met trizma grondslag vast te stellen.
- Terwijl de oplossing wordt gesoniceerd, mix 50 ul van de optode materiaal met 50 ul van dichloormethaan in een 0,6 ml microcentrifugebuis. Meng met de pipet om ervoor te zorgen, zelfs mengen.
- Stel de sonifier controle om ultrasone trillingen gedurende 3 minuten. Start de sonicatie en terwijl sonicating de optode mengsel oplossing toe te voegen aan de flacon door onderdompeling van de pipet tip in de oplossing en het afgeven van de 100 pi van de oplossing in een snelle, zelfs injectie. De oplossing moet blauw, Depending op de gebruikte waterige oplossing.
- Laat de sonicatie om dan verder gedurende ongeveer 30 seconden van de aansluiting, zodat het sonicating tip is ongeveer 2 mm diep in oplossing te verlagen. Dit moet beginnen om de oplossing te beluchten en de oplossing zal worden ondoorzichtig. Deze stap helpt om de resterende THF en dichloormethaan te verwijderen uit de oplossing.
- Zodra sonicatie is voltooid, trekt u de nanosensor oplossing in een 5 ml spuit. Bevestig een 0,2 um spuitfilter en afzien van de nanosensor oplossing in een glazen flacon met schroef dop. De oplossing moet helder en blauw als een waterige oplossing die minder dan 10 mM natrium bevat en heeft een pH van minder dan ongeveer 9 wordt gebruikt. Anders, moet het geen kleur of roze.
3. Het bepalen van nanonsensor reactie
Deze methode wordt gebruikt om de reactie van nanosensoren ontworpen voor intracellulaire natrium te meten te bepalen. Verschillende concentraties worden aanbevolen om te worden gebruikt voor het extracellulaire natriumconcentratie nanosensoren.
- Maak voorraad oplossingen van 10 mM HEPES (0 Na) en 1M natriumchloride (NaCl) in 10 mM HEPES (1 M Na) en pH elk van deze oplossingen met behulp van 7,2 trizma basis. Mix voorraad oplossingen van 0 Na en een M Na in 50 ml conische centrifugebuizen om oplossingen te creëren met: 0, 1, 5, 10, 20, 50, 100, 200, 500, 1000 mM NaCl concentraties.
- Gebruik een optische onderste 96 wells plaat om de respons te bepalen. Voeg 100 ul van elke concentratie van natrium tot drie putten in een kolom. Dit levert een serie van 3 x 10 putten.
- Aan elk putje toe te voegen 100 ul vers bereide nanosensoren en laden in een microplaat fluorometer. We maken gebruik van een Molecular Devices Spectramax M3.
- Lees elke goed aan bij de volgende golflengten:
| Excitatie (nm) | Emissie (nm) | Cut-Off (nm) |
| 488 | 570 | 530 |
| 488 | 670 | 610 |
| 639 | 680 | 665 |
De nanosensor intensiteit bij elke golflengte is afhankelijk van de natriumconcentratie. Het gebruik van de golflengte afhankelijk van de toepassingen. Voor intracellulaire trage dynamiek metingen maken we gebruik van 488 nm/570 nm (excitatie / emissie) en 488 nm nm/670 die ons laten verhouding tussen de twee golflengten en minder lawaai.
- Traditioneel wordt optode data omgezet naar een waarden die zijn: α = (I - I min) / (I max - I min), waar ik is de intensiteit bij een gegeven natriumgehalte, ik min is de laagste intensiteit in het antwoord metingen , en I max is de hoogste intensiteit in het antwoord metingen. Converteren hetzij de verhouding van de intensiteit bij 570 nm gedeeld door de intensiteit op 670 nm of de intensiteit bij 680 nm aan α.
- Gebruik het plotten van software, zowel Excel of Origin doorgaans worden gebruikt in ons lab, om α perceel ten opzichte van de log van de natrium-concentratie, waarin de log van nul natriumgehalte op -1. Plaats een sigmoïdale bocht naar de respons. Van de curve, het berekenen van de natrium-concentratie bij α = 0.5, die de concentratie waarbij de sensor optimaal reageert vertegenwoordigt.
- Pas de verhouding van CHIII, Naix, en NaTFPB in de optode om nanosensoren te creëren met een optimale respons rond de natriumconcentratie van belang.
4. Intracellulaire imaging
- Voor intracellulaire metingen, zijn de nanosensoren gemaakt in 5 mg / ml glucose in water en gemicroinjecteerd in de cellen.
- Groeien of overdracht cellen een glazen bodem schaal of een imaging kamer met een glazen dekglaasje bodem.
- Incubeer de cellen in heldere media of Tyrode's oplossing. Monteer de beeldvorming kamer of schotel op een epifluorescentiemicroscoop. We maken gebruik van een Zeiss LSM 7 confocale microscoop.
- Trek capillair glas met een pipet trekker. We maken gebruik van een Sutter vlammende bruine p-97 met 1 mm OD, 0,78 mm ID glas, om een laatste tip diameter van rond 300 tot 500 nm.
- Backfill de pipet met nanosensor oplossing met behulp van een spuit en een naald Hamilton, of een microtip lader en een pipet.
- Monteer de pipet in een houder die is aangesloten op een micromanipulator en aangesloten op een druk gestuurde injectiesysteem. Hier gebruiken we een Burleigh Exfo PCS 6000 micromanipulator en een Medical Systems Corporation injector.
- Laat de pipet op de top van de cel en in het cytoplasma, soms is het nodig om "tap" de manipulator houder te doorboren het membraan. Injecteer de oplossing nanosensor en snel terugtrekken van de pipet.
5. In vivo beeldvorming
Alle procedures zijn beoordeeld en goedgekeurd door Animal Northeastern University's Care en gebruik Comite.
- Nanosensorenvoor in vivo, extracellulaire beeldvorming worden gemaakt in fosfaat gebufferde zoutoplossing en aangepast aan een optimale reactie op natrium in een natrium-concentratie van 135 mM.
- Voor de injectie set-up en de beeldvorming van de fluorescerende nanosensoren in muizen, gebruiken we de IVIS Lumina II en de bijbehorende anesthesie-eenheid. Ontsmet de inductie en imaging kamers. Plaats CD1 naakt muizen (ongeveer 20g) in de inductie kamer en hen blootstellen aan isofluraan. Het percentage van de toegediende isofluraan en zuurstof debiet zal variëren afhankelijk van de soort en het gewicht van muizen. Wacht tot de muizen om volledig onder narcose.
- Nadat de muizen zijn verdoofd, verwijder dan de muizen uit de inductie kamer en plaats in de beeldvorming kamer. Houd de muizen onder narcose. Voor elke muis, ontsmet de gewenste injectie gebieden.
- Vul een steriele 31G insuline spuit met 10 pi van nanosensoren zorg ervoor dat alle luchtbellen te verwijderen.
- Met behulp van een tang, pakt een kleine huidplooi langs de achterkant van de muis op de gewenste plaats van injectie. Pak de huid, plaatst u de spuit in de huid met de schuine naar boven en de naald parallel aan de huid.
- Voorafgaand aan het injecteren van de sensoren, terug te trekken op de zuiger om ervoor te zorgen de naald niet is geplaatst in een bloedvat. Vervolgens beweeg de naald rechts en links om een zak in de huid te creëren. Dit zal de tegendruk waardoor de sensoren om lekken van de plaats van injectie. Injecteer de sensoren en verwijder voorzichtig de spuit.
- Voorzichtig druk op de injectieplaats en veeg elke oplossing die kunnen hebben gelekt van de plaats van injectie. Dit zal minimaliseren fluorescentie van sensoren die niet worden geïnjecteerd in de huid.
- Herhaal de stappen 5,4 tot 5,7 totdat het gewenste aantal injectie gebieden is bereikt. Zes injectieplaatsen gelijkmatig verdeeld over het linker-en rechterkant van de rug worden aanbevolen. Voor elke individuele muis veranderen naalden of de naald wordt het moeilijk om in te voegen in de huid. Naalden mogen niet worden gedeeld tussen de muizen. Hierdoor wordt de overdracht van ziekten of kruisbesmetting tussen de muizen te minimaliseren.
- Voor beeldvorming van de natrium-tl-sensoren, we krijgen zowel helderveld en fluorescerende beelden van de muizen met behulp van filter sets die het meest overeenkwamen met de 640 nm/680 nm (excitatie / emissie) spectrum van de nanosensoren en dat ook het minimaliseren van de autofluorescentie van de huid.
6. Representatieve resultaten
Figuur 1. Response rondingen van vijf verschillende nanosensor sets natrium. Elke set vertegenwoordigt nanosensoren uit verschillende optode formuleringen die dezelfde hoeveelheid CHIII, NaTFPB, PVC en DOS, maar variërende hoeveelheden Naix had. De gegevens werden omgezet in α waarden met behulp van de 639 / 680 nm intensiteiten. De gegevens zijn een gemiddelde van 3, foutbalken weggelaten voor de duidelijkheid, van een ingericht sigmoïdale curve met behulp van Origin. In deze reactie curve, de maximale concentratie van de gebruikte natrium was 500 mm. De Kd van de natrium nanosensoren voor natrium varieerde van 10 mM (oranje ruiten) tot ongeveer 150 mm (zwarte vierkantjes).
Figuur 2. Ingespoten neonatale cardiale myocyten. Cellen werden gekweekt op dekglaasje, gemonteerd op een microscoop en geïnjecteerd met natrium nanosensoren. Getoond worden fluorescent (639 nm excitatie), helderveld, en overlay. Merk op dat sommige sensor clustering plaatsvindt, maar de cellen hebben een normale morfologie, sensoren hebben verspreid in de cytosol en er is geen nucleair geladen.
Figuur 3. Subcutane injectie van muizen met natrium nanosensoren. Negen verschillende injecties van natrium nanosensoren werden gemaakt in het subcutane ruimte van naakt muizen. Zowel de lichte veld en fluorescerende beelden (640/680) zijn bedekt.
Discussion
De vorming van nanosensoren mag niet langer duren dan 10 minuten nadat de optode oplossing is gemaakt en de PEG lipide gedroogd. Optode kan niet alleen worden gemaakt wanneer nodig snel, maar wanneer bewaard bij 4 graden Celsius, kunnen ze stabiel zijn voor maanden. We hebben aangetoond dat de nansensors, eenmaal gevormd, stabiel zijn in oplossing voor minstens een week,. Maar, zorg moeten worden genomen om fotobleken ook na deze periode te voorkomen door het blokkeren van de nanosensoren tegen licht 6 Terwijl natrium nanosensoren hier waren aangetoond, zijn optodes zijn gemaakt voor de meeste biologisch relevante ionen zoals kalium en chloride. 10,12 We hebben ook uitgebreid deze technologie naar kleine moleculen, zoals glucose. 13
In aanvulling op het genereren van nanosensoren naar verschillende analyten te controleren, zijn deze nanosensoren vatbaar zijn voor andere wijzigingen die ervoor zorgt dat ze nuttig in de meeste biologische experimenten. Bijvoorbeeld, de oppervlaktelaag, in dit geval poly (ethyleenglycol), kunnen eenvoudig worden gewijzigd met behulp van een amfifiele molecuul dat is oplosbaar in water. Dit maakt de mogelijkheid van functionaliseren deze nanodeeltjes voor verschillende toepassingen of doelen. De grootte van de nanodeeltjes kunnen ook worden aangepast door het veranderen van de oppervlaktelaag, de sonicatie intensiteit of het gebruikte oplosmiddel.
Calcium fluorescerende indicatoren zijn van onschatbare waarde bij het bepalen van intracellulaire calcium signaaloverdracht, maar, we zijn natrium-gevoelige kleurstoffen hebben dezelfde ideale eigenschappen. Optode nanodeeltjes bedoeld om een alternatieve methode voor beeldvorming ionen intracellulair zijn in ontwikkeling voor jaren te geven. 14 Wij hebben op deze eerder onderzoek naar nanosensoren die specifiek zijn voor intracellulaire natrium-imaging, dat hopelijk zal zorgen voor een middel om te begrijpen hoe natrium signalering cellulaire functie en invloed te creëren wijzigingen in de signalering die leiden tot bepaalde ziekten.
Het gebruik van fluorescerende nanosensoren in vivo biedt een real-time minimaal-invasief alternatief voor de bewaking analyten opzichte van andere methoden, zoals bloed trekt. 3 Natrium en glucose nanosensoren gebaseerd op de technologie hiervoor is aangetoond dat veranderingen in het natrium en glucose track, respectievelijk in vivo. 3,13 Echter, er bestaan momenteel beperkingen aan deze methode als een controle-instrument. Bijvoorbeeld, de sensoren moeten een fluorofoor met een spectrum voldoende verschoven naar de nabij-infrarood rode om achtergrond te minimaliseren autofluorescentie van de huid. 15 In de tweede bevat, is de huidige injectie techniek produceert geen uniform injectie van de nanosensoren die kunnen worden veroorzaakt door deze fouten als variatie in injectie diepte. Ondanks deze beperkingen, kan de ontwikkeling van deze fluorescerende nanosensoren en hun succesvolle demonstratie maken van deze sensoren een waardevol onderzoeksinstrument en de methode voor de controle gezondheid van de patiënt.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
JMD en MKB worden gefinancierd via de IGERT Nanomedicine Wetenschap en Technologie programma van Northeastern University (financiering van de NCI-en NSF verlenen DGE-0504331). Dit werk werd ook gefinancierd door National Institutes of Health Nationale Instituut van Algemene Medische Wetenschappen Grant R01 GM084366. We danken ook Saumya Das en Anthony Rosenzweig van BIDMC in Boston voor het aanbieden van cardiale myocyten en Kevin Cash voor zijn bijdrage in het dier protocol ontwikkeling.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| IVIS Lumina II Instrument Package | Caliper Life Sciences | 126273 | |
| CD-1 Nude Mice | Charles River Laboratories | Strain Code: 086 | Immunodeficient |
| Insulin syringes | BD Biosciences | 328438 | 3/10 ccmL , 8mm, 31G |
| High Molecular Weight PVC | Sigma-Aldrich | ||
| DOS | Sigma-Aldrich | ||
| CHIII | Sigma-Aldrich | ||
| NaTFPB | Sigma-Aldrich | ||
| NaIX | Sigma-Aldrich | ||
| Thin walled capillary glass | Sutter Instrument Co. | ||
| PEG lipid | Avanti Polar Lipid, Inc | ||
| Table 1. Provides a list of chemicals and equipment used in this procedure. All common chemicals not listed were purchased from Sigma. | |||
References
- Adrogue, H. J., Madias, N. E.
- Kim, D. Y. BACE1 regulates voltage-gated sodium channels and neuronal activity. Nat Cell Biol. 9, 755-764 (2007).
- Dubach, J. M., Lim, E., Zhang, N., Francis, K. P., Clark, H. in vivo sodium concentration continuously monitored with fluorescent sensors. Integr Biol (Camb). , (2010).
- Minta, A., Tsien, R. Y. Fluorescent indicators for cytosolic sodium. J Biol Chem. 264, 19449-19457 (1989).
- Dubach, J. M., Harjes, D. I., Clark, H. A. Ion-selective nano-optodes incorporating quantum dots. Journal of the American Chemical Society. 129, 8418-8418 (2007).
- Dubach, J. M., Harjes, D. I., Clark, H. A. Fluorescent ion-selective nanosensors for intracellular analysis with improved lifetime and size. Nano Letters. 7, 1827-1831 (1021).
- Schaffar, B., Wolfbeis, O.
- Seiler, K. Characterization of sodium-selective optode membranes based on neutral ionophores and assay of sodium in plasma. Clin Chem. 37, 1350-1355 (1991).
- Zhujun, Z., Mullin, J., Seitz, W. Optical sensor for sodium based on ion-pair extraction and fluorescence. Anal Chim Acta. 184, 251-251 (1986).
- Bakker, E., Buhlmann, P., Pretsch, E. Carrier-Based Ion-Selective Electrodes and Bulk Optodes. 1. General Characteristics. Chem Rev. 97, 3083-3132 (1997).
- Dubach, J. M., Das, S., Rosenzweig, A., Clark, H. A. Visualizing sodium dynamics in isolated cardiomyocytes using fluorescent nanosensors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 16145-16150 (2009).
- Harjes, D. I., Dubach, J. M., Rosenzweig, A., Das, S., Clark, H. A. Ion-Selective Optodes Measure Extracellular Potassium Flux in Excitable Cells. Macromolecular Rapid Communications. 31, 217-221 (2010).
- Balaconis, M. K., Billingsley, K. L., Dubach, J. M., Clark, H. A. Pittsburgh Conference on Analytical Chemistry and Applied, , Forthcoming.
- Park, E. J., Brasuel, M., Behrend, C., Philbert, M. A., Kopelman, R. Ratiometric optical PEBBLE nanosensors for real-time magnesium ion concentrations inside viable cells. Anal Chem. 75, 3784-3791 (2003).
- Frangioni, J. V.
