Summary
Nanoparticelle fluorescenti prodotte nel nostro laboratorio vengono utilizzati per concentrazioni di ioni di imaging e flussi di ioni in sistemi biologici come cellule durante la segnalazione e fluido interstiziale durante l'omeostasi fisiologica.
Abstract
Omeostasi di ioni strettamente regolata in tutto il corpo è necessario per la prevenzione di tali stati debilitanti come la disidratazione. 1, invece, i flussi di ioni rapida a livello cellulare sono necessari per l'avvio di potenziali d'azione nelle cellule eccitabili. 2 Regolamento di sodio svolge un ruolo importante in entrambi questi casi, tuttavia, attualmente non esiste alcun metodo per il monitoraggio continuo dei livelli di sodio in vivo 3 e sonde di sodio intracellulare 4 non lo prevedano simili risultati dettagliati come sonde di calcio. Nel tentativo di riempire questi due vuoti, nanosensori fluorescenti sono state sviluppate in grado di monitorare le concentrazioni di sodio in vitro e in vivo. 5,6 Questi sensori si basano sulla tecnologia agli ioni selettivi optode e sono costituiti da particelle polimeriche plastificato in cui il riconoscimento specifico di sodio elementi, pH-sensibile fluorofori, e additivi sono incorporati. Meccanicisticamente 7-9, l'elemento di riconoscimento di sodio estratti di sodio nel sensore. 10 Questo l'estrazione fa sì che il fluoroforo pH-sensibile per rilasciare uno ione idrogeno per mantenere la neutralità di carica all'interno del sensore, che provoca un cambiamento di fluorescenza. I sensori di sodio sono reversibili e selettivi per il sodio potassio oltre anche ad alte concentrazioni intracellulari. 6 Sono circa 120 nanometri di diametro e sono rivestiti con polietilene glicole di impartire biocompatibilità. Utilizzando tecniche di microiniezione, i sensori possono essere forniti nel citoplasma delle cellule dove hanno dimostrato di monitorare le dinamiche di sodio temporale e spaziale di battere miociti cardiaci. 11 Inoltre, hanno anche monitorato in tempo reale i cambiamenti nelle concentrazioni di sodio nel vivo quando iniettato per via sottocutanea in topi 3 del presente regolamento, spieghiamo in dettaglio e dimostrare la metodologia per la realizzazione di nanosensori sodio fluorescenti e brevemente dimostrare le applicazioni biologiche nostro laboratorio utilizza il nanosensori per:. la microiniezione dei sensori all'interno delle cellule, e l'iniezione sottocutanea di sensori in topi .
Protocol
1. Preparazione del optode
Prima di effettuare il optode, aliquote delle componenti sono necessità in modo che possano essere facilmente misurato e memorizzato.
- A 50 mg di sodio ionoforo X (NaIX) e una fiala da 50 mg di sodio tetrakis [3,5-bis (trifluorometil) fenil] borato (NaTFPB) sarà ogni essere educato in tetrahyrdofuran (THF) e aliquotati in provette da 1,5 ml in polistirolo centrifuga. In una cappa, sciogliere i 50 mg di NaIX in 1 ml di THF nel flaconcino di spedizione e mescolare per garantire che il solido si è completamente sciolto. Trasferire 100 ml di questa soluzione in 10 provette separate. Ripetere l'operazione per NaTFPB. Lasciare che il THF a evaporare in una cappa durante la notte, etichettare le provette da centrifuga e metterli in frigorifero 4 gradi per la conservazione. Questo crea 5 mg di aliquote secche NaIX e NaTFPB.
- Sciogliere il III Chromoionophore (CHIII) in 1 ml di THF e trasferimento in un flaconcino da 3 ml di vetro. Aggiungere un altro 1 ml di THF al flaconcino di spedizione CHIII per sciogliere ogni residua CHIII e aggiungere questo al flaconcino da 3 ml di vetro. Ci sarà un totale di 2 ml ora. Trasferire 1 ml di soluzione CHIII in THF a due fiale 1,5 ml separare vetro con un tappi teflon. Conservare la soluzione CHIII in frigorifero a 4 gradi la concentrazione finale di 5 mg / ml.
Queste aliquote e le soluzioni saranno utilizzati per rendere il materiale optode.
- Pipettare 66 ml di bis (2-etilesile) sebacato (DOS) in una fiala 1,5 ml di vetro con tappo a vite rivestiti in teflon - questa è la fiala optode. DOS è una soluzione viscosa così la cura deve essere adottate per garantire la giusta quantità di soluzione è trasferito al flaconcino. Il volume corrisponde a ~ 60 mg di DOS.
- Pesare 30 mg di alto peso molecolare poli (vinile) cloruro (PVC) e trasferire questa nella fiala optode.
- Ora aggiungere i componenti aliquotati funzionali al flaconcino optode per creare il optode desiderato. La concentrazione relativa di CHIII, NaIX e NaTFPB determinerà la risposta del sensore di sodio. Queste concentrazioni possono essere regolati per avere un sensore che risponde idealmente alle concentrazioni intracellulari, con Kd di 10 mm, o concentrazioni extracellulari, con un Kd di 150 mm. Inoltre, ci sarà probabilmente lotto a lotto variabilità delle sostanze chimiche da parte del fornitore e la calibrazione dei sensori è necessario determinare se la risposta corretta è che si verificano per ogni nuovo lotto di componenti chimici. Qui si descrive il metodo per creare un sensore con concentrazioni che sono tipicamente utilizzati per le misure di sodio intracellulare.
- In una cappa, trasferire 100 ul dei 5 mg / ml CHIII in soluzione THF al flaconcino optode.
- Sciogliere 5 mg di NaIX in 300 ml di THF e trasferire 300 ul al flaconcino optode, questo è correlato a 5 mg di NaIX.
- Sciogliere a 5 mg aliquota del NaTFPB in 500 ml di THF e trasferire 20 microlitri della soluzione nel flacone optode, questo è correlato a 0,1 mg di NaTFPB.
- Aggiungere 80 ml di THF al flaconcino optode.
- La soluzione nel flacone optode contiene 30 mg di PVC, 60 mg di DOS, 5 mg di NaIX, 0,2 mg di NaTFPB, 0,5 mg di CHIII in 500 ml di THF. Delicatamente vortice questo flaconcino fino a quando tutto il PVC è dissolta. Il optode dovrebbe essere un colore rosso. La quantità totale di THF aggiunto al flaconcino deve essere 500 microlitri indipendentemente dal rapporto dei componenti utilizzati.
- Lasciare che il THF rimanenti nel NaIX e aliquote NaTFPB evaporare durante la notte e ri-etichettare il tubo con la giusta quantità di sostanze chimiche.
2. La creazione di nanosensori
- Pipettare 100 l di 10 mg / ml 1,2-Distearoyl-sn-glicero-3-Phosphoethanolamine-N - [metossi (polietilenglicole) -550] in cloroformio (PEG-lipidi) in un flaconcino da 4 bicchierino di vetro. Lasciare che il cloroformio evaporare in una cappa. Questo processo può essere accelerato con l'essiccazione la soluzione con azoto gas o aria casa.
- Aggiungere 4 ml di soluzione acquosa desiderato nella fiala con PEG-lipidico. Posizionare il flaconcino su una presa di laboratorio sotto la punta sonicating ed aumentare il flaconcino fino a quando la punta è di circa 7 mm di profondità nella soluzione e sonicare a ultrasuoni a bassa potenza per 30 secondi. Qui usiamo un Branson digitale sonifier impostato al 15% di ampiezza con un corno ½ pollici passo diametro della punta. La soluzione acquosa può essere qualsiasi soluzione. Ad esempio, per determinare la risposta dei sensori che usiamo HEPES 10 mM pH 7,2 con base trizma.
- Mentre la soluzione viene sonicato, mescolare 50 ml di materiale optode con 50 ml di diclorometano in un tubo 0,6 ml microcentrifuga. Mescolare con la pipetta per assicurare una miscelazione uniforme.
- Regolare il controllo sonifier a ultrasuoni per 3 minuti. Avviare la sonicazione e mentre sonicating aggiungere la soluzione optode miscela al flaconcino immergendo la punta della pipetta nella soluzione e la distribuzione dei 100 ml di soluzione in una rapida, anche l'iniezione. La soluzione dovrebbe diventare blu, depeending della soluzione acquosa utilizzata.
- Lasciare che la sonicazione proseguire per circa 30 secondi, quindi abbassare la presa in modo che la punta sonicating è di circa 2 mm di profondità in soluzione. Questo dovrebbe iniziare a aerare la soluzione e la soluzione diventa opaco. Questo passaggio consente di rimuovere il residuo e THF diclorometano dalla soluzione.
- Una volta sonicazione è completa, tirare su la soluzione nanosensori in una siringa da 5 ml. Collegare un filtro da 0,2 micron siringa e dispensare la soluzione nanosensori in un flaconcino di vetro con tappo a vite in alto. La soluzione deve essere chiaro e blu se una soluzione acquosa che contiene meno di 10 mM di sodio ed ha un pH inferiore a circa 9 viene utilizzato. Altrimenti, si dovrebbe avere alcun colore o rosa.
3. Determinazione risposta nanonsensor
Questo metodo è utilizzato per determinare la risposta di nanosensori progettato per misurare sodio intracellulare. Diverse concentrazioni sono consigliati da utilizzare per nanosensori extracellulare concentrazione di sodio.
- Fai soluzioni stock di 10 HEPES mM (0 Na) e cloruro di sodio 1M (NaCl) in 10 mM HEPES (1 M Na) ed il pH ognuna di queste soluzioni a 7,2 con base trizma. Mescolare le soluzioni stock di 0 e 1 M Na Na in 50 ml provette per centrifuga coniche per creare soluzioni con: 0, 1, 5, 10, 20, 50, 100, 200, 500, 1000 le concentrazioni mM NaCl.
- Utilizzare un fondo ottico 96 pozzetti per determinare la risposta. Aggiungere 100 ml di ogni concentrazione di sodio di 3 pozzi in una colonna. Questo produrrà una serie di 3 x 10 pozzi.
- Per ogni pozzetto aggiungere 100 ml di nanosensori preparati al momento e caricare in un fluorimetro per micropiastre. Usiamo un Molecular Devices Spectramax M3.
- Leggi ogni bene con le lunghezze d'onda seguenti:
| Eccitazione (nm) | Emissione (nm) | Cut-Off (nm) |
| 488 | 570 | 530 |
| 488 | 670 | 610 |
| 639 | 680 | 665 |
L'intensità nanosensori ad ogni lunghezza d'onda dipende dalla concentrazione di sodio. L'uso della lunghezza d'onda dipende dalle applicazioni. Per le misurazioni intracellulari lenta dinamica, usiamo nm/570 488 nm (eccitazione / emissione) e 488 nm nm/670 che ci permettono di rapporto tra le due lunghezze d'onda e ridurre il rumore.
- Tradizionalmente, optode dati viene convertito in un valore che sono: α = (I - I min) / (I max - I min), dove I è l'intensità ad una concentrazione di sodio dato, I min è la più bassa intensità nelle misure di risposta , e io max è la massima intensità nelle misure di risposta. Convertire il rapporto di intensità a 570 nm divisa per l'intensità a 670 nm o l'intensità a 680 nm a α.
- Utilizzare un software tramando, Excel o origine sono tipicamente utilizzati nel nostro laboratorio, per tracciare α contro il log della concentrazione di sodio, l'impostazione del log della concentrazione di sodio zero a -1. Montare una curva sigmoidale alla risposta. Dalla curva, calcolare la concentrazione di sodio ad α = 0,5 che rappresenta la concentrazione alla quale il sensore risponde in modo ottimale.
- Regolare il rapporto di CHIII, NaIX e NaTFPB nel optode per creare nanosensori con risposta ottimale intorno alla concentrazione di sodio di interesse.
4. L'imaging intracellulare
- Per le misure intracellulari, il nanosensori sono realizzati in 5 mg / ml di glucosio in acqua e microiniezione nelle cellule.
- Crescere o trasferire le cellule di un piatto fondo di vetro o di una camera di imaging con fondo di vetro coprioggetti.
- Incubare le cellule nei media chiara o la soluzione di Tyrode. Montare la camera di immagini o un piatto su un microscopio a epifluorescenza. Usiamo un Zeiss LSM 7 microscopio confocale.
- Tirare capillare di vetro con un estrattore pipetta. Usiamo un sutter fiammeggiante marrone p-97 con 1 mm di diametro, 0,78 mm ID vetro, ad un diametro punta finale intorno a 300-500 nm.
- Backfill la pipetta con la soluzione di nanosensori usando una siringa e un ago Hamilton, o un caricatore microtip e una pipetta.
- Montare la pipetta in un supporto che è collegato a un micromanipolatore e collegato ad un sistema di controllo pressione di iniezione. Qui usiamo un Burleigh EXFO 6000 PCS micromanipolatore e un medico Systems Corporation iniettore.
- Abbassare la pipetta sulla parte superiore del cellulare e nel citoplasma, a volte è necessario "toccare" il titolare del manipolatore di perforare la membrana. Iniettare la soluzione di nanosensori e rapidamente ritirare la pipetta.
5. Imaging in vivo
Tutte le procedure sono stati esaminati e approvati da Animal Care Northeastern University e del comitato Usa.
- Nanosensoriin vivo, immagini extracellulare sono realizzati in tampone fosfato salino e regolata per avere una risposta ottimale al sodio ad una concentrazione di sodio di 135 mm.
- Per l'iniezione set-up e imaging del nanosensori fluorescenti nei topi, si usa il IVIS Lumina II e della sua unità anestesia associati. Disinfettare l'induzione e camere di imaging. Luogo CD1 topi nudi (circa 20g) nella camera di induzione e di esporli a isoflurano. La percentuale di portata isoflurano e di ossigeno somministrata varia a seconda della specie e il peso dei topi. Attendere che i topi per diventare completamente anestetizzato.
- Dopo i topi vengono anestetizzati, togliere i topi dalla camera di induzione e posto nella camera di imaging. Tenere i topi sotto anestesia. Per ogni mouse, disinfettare le zone di iniezione desiderato.
- Riempire una siringa da insulina sterile 31G con 10 ml di nanosensori avendo cura di rimuovere tutte le bolle d'aria.
- Utilizzando pinze, afferrare una piega piccola porzione di pelle lungo la parte posteriore del mouse al sito di iniezione desiderato. Afferrare la pelle, inserire la siringa nella pelle con lo smusso rivolto verso l'alto e il parallelo ago alla pelle.
- Prima di iniettare i sensori, tirare indietro lo stantuffo della siringa per assicurare l'ago non è inserito in un vaso sanguigno. Poi, con delicatezza spostare l'ago a destra e sinistra per creare una tasca all'interno della pelle. Questo ridurrà al minimo la contropressione che provoca i sensori a trapelare del sito di iniezione. Iniettare i sensori e rimuovere delicatamente la siringa.
- Esercitare una leggera pressione al sito di iniezione e spazzare via qualsiasi soluzione che potrebbe essere trapelato dal sito di iniezione. Questo ridurrà al minimo fluorescenza da sensori che non vengono iniettati nella pelle.
- Ripetere i passaggi attraverso 5,7 fino a 5,4 il numero delle aree di iniezione desiderata. Sei siti di iniezione equidistanti sul lato destro e sinistro della schiena sono raccomandati. Per ogni individuo del mouse, cambiare gli aghi se l'ago diventa difficile da inserire nella pelle. Aghi non devono essere condivisi tra i topi. Questo ridurrà al minimo la trasmissione della malattia o la contaminazione incrociata tra i topi.
- I sensori per l'imaging di sodio fluorescente, acquistiamo sia immagini campo chiaro e fluorescenza dei topi utilizzando set di filtri che meglio soddisfano le nm/680 640 nm (eccitazione / emissione) spettro della nanosensori e che anche minimizzare l'autofluorescenza della pelle.
6. Rappresentante Risultati
Figura 1. Curve di risposta di cinque set diversi nanosensori di sodio. Ogni set rappresenta nanosensori dalle formulazioni optode diversi che avevano la stessa quantità di CHIII, NaTFPB, PVC e DOS, ma quantità variabili di NaIX. I dati sono stati convertiti in valori α utilizzando l'intensità di 639/680 nm. I dati sono una media di 3, barre di errore omesso per chiarezza, con una curva sigmoidale montato utilizzando Origine. In questa curva di risposta, la massima concentrazione di sodio è stato utilizzato 500 mm. La Kd dei nanosensori sodio sodio variava da 10 mm (diamanti arancione) a circa 150 mm (quadrati neri).
Figura 2. Iniettato neonatale miociti cardiaci. Le cellule sono state coltivate su vetrino coprioggetti, montata su un microscopio e iniettati con nanosensori di sodio. Vengono mostrati fluorescenti (eccitazione 639 nm), chiaro, e di sovrapposizione. Si noti che alcune di clustering sensore si verifica, ma le cellule hanno una morfologia normale, i sensori si sono diffuse in tutto il citoplasma e non c'è carica nucleare.
Figura 3. Iniezione sottocutanea di topi con nanosensori di sodio. Nove diverse iniezioni di sodio nanosensori sono stati fatti nello spazio sottocutaneo di topi nudi. Sia del campo luminoso e immagini a fluorescenza (640/680) sono sovrapposti.
Discussion
La formazione di nanosensori non dovrebbe richiedere più di 10 minuti una volta la soluzione optode è stato fatto e il PEG secca lipidica. Optode non possono essere effettuate solo rapidamente quando necessario, ma se conservato a 4 gradi Celsius, possono essere stabile per mesi. Abbiamo dimostrato che la nansensors, una volta formate, sono stabili in soluzione per almeno una settimana. Tuttavia, occorre prestare attenzione per evitare che photobleaching tutto questo tempo, bloccando il nanosensori dalla luce 6 Mentre nanosensori di sodio sono state dimostrate qui, optodes sono stati creato per la maggior parte degli ioni biologicamente rilevanti quali potassio e cloruro. 10,12 Abbiamo anche esteso questa tecnologia per piccole molecole come il glucosio 13.
Oltre a generare nanosensori di monitorare analiti diversi, questi nanosensori sono suscettibili di altri cambiamenti che renderanno utili in esperimenti più biologica. Ad esempio, il rivestimento della superficie, in questo caso poli (glicole etilenico), può essere facilmente cambiata utilizzando qualsiasi molecola anfifiliche che è solubile in acqua. Ciò consente la possibilità di funzionalizzazione queste nanoparticelle per le diverse applicazioni o obiettivi. La dimensione delle nanoparticelle può essere regolata modificando il rivestimento di superficie, l'intensità sonicazione o il solvente utilizzato.
Indicatori di calcio fluorescenti sono stati inestimabili nella determinazione di segnalazione intracellulare di calcio, ma senza coloranti sodio disponibile sensibili hanno le stesse caratteristiche ideali. Optode nanoparticelle lo scopo di fornire un metodo alternativo per l'imaging intracellulare degli ioni sono in sviluppo da anni 14. Abbiamo costruito su questa ricerca precedente per creare nanosensori specifici per l'imaging di sodio intracellulari che si spera di fornire un mezzo per capire come segnalazione di sodio influisce sulla funzione cellulare e alterazioni nella segnalazione che portano a determinate malattie.
L'utilizzo di nanosensori a fluorescenza in vivo offre in tempo reale alternativa minimamente invasiva per analiti di monitoraggio rispetto ad altri metodi come ad esempio i prelievi di sangue. 3 di sodio e glucosio nanosensori basati sulla tecnologia sopra hanno dimostrato di tenere traccia delle modifiche di sodio e glucosio, rispettivamente in vivo. 3,13 Tuttavia, attualmente esistono limitazioni di questo metodo come uno strumento di monitoraggio. Per esempio, i sensori deve contenere un fluoroforo con uno spettro sufficientemente spostato verso il rosso vicino infrarosso in modo da minimizzare autofluorescenza sfondo dalla pelle. 15 In secondo luogo, la tecnica di iniezione di corrente non produce iniezione uniforme dei nanosensori che può essere causato da tali errori come variazione in profondità di iniezione. Nonostante questi limiti, lo sviluppo di questi nanosensori fluorescenti e la loro manifestazione di successo potrebbe rendere questi sensori uno strumento di ricerca prezioso e metodo per il monitoraggio sanitario dei pazienti.
Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
JMD e MKB sono finanziati attraverso la scienza e la nanomedicina IGERT programma Technology presso la Northeastern University (finanziamenti da NSC e NSF concedere DGE-0504331). Questo lavoro è stato finanziato dal National Institutes of Health National Institute of General Medical Sciences di Grant R01 GM084366. Ringraziamo anche Saumya Das e Anthony Rosenzweig di BIDMC a Boston per la fornitura di miociti cardiaci e Cash Kevin per il suo contributo nello sviluppo del protocollo animale.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| IVIS Lumina II Instrument Package | Caliper Life Sciences | 126273 | |
| CD-1 Nude Mice | Charles River Laboratories | Strain Code: 086 | Immunodeficient |
| Insulin syringes | BD Biosciences | 328438 | 3/10 ccmL , 8mm, 31G |
| High Molecular Weight PVC | Sigma-Aldrich | ||
| DOS | Sigma-Aldrich | ||
| CHIII | Sigma-Aldrich | ||
| NaTFPB | Sigma-Aldrich | ||
| NaIX | Sigma-Aldrich | ||
| Thin walled capillary glass | Sutter Instrument Co. | ||
| PEG lipid | Avanti Polar Lipid, Inc | ||
| Table 1. Provides a list of chemicals and equipment used in this procedure. All common chemicals not listed were purchased from Sigma. | |||
References
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