Summary
प्रतिदीप्त हमारी प्रयोगशाला में उत्पादित नैनोकणों इमेजिंग आयन संकेत और मध्य द्रव के दौरान शारीरिक homeostasis के दौरान कोशिकाओं के रूप में जैविक प्रणालियों में सांद्रता और आयन अपशिष्टों के लिए उपयोग किया जाता है.
Abstract
कसकर विनियमित शरीर भर आयन homeostasis निर्जलीकरण जैसे दुर्बल राज्यों की रोकथाम के लिए आवश्यक है 1 इसके विपरीत, सेलुलर स्तर पर तेजी से आयन अपशिष्टों उत्तेजनीय कोशिकाओं में कार्रवाई क्षमता की शुरुआत करने के लिए आवश्यक हैं. 2 सोडियम विनियमन दोनों में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है. इन मामलों में, तथापि, वर्तमान में कोई विधि लगातार vivo में 3 और 4 कैल्शियम जांच के रूप में इसी तरह के विस्तृत परिणाम प्रदान नहीं करते हैं intracellular सोडियम जांच में सोडियम के स्तर की निगरानी के लिए मौजूद है. दोनों इन voids भरने के लिए प्रयास में, फ्लोरोसेंट nanosensors विकसित किया गया है कि इन विट्रो में और vivo में सोडियम सांद्रता की निगरानी कर सकते हैं 5,6 इन सेंसरों आयन चयनात्मक optode प्रौद्योगिकी पर आधारित है और plasticized polymeric जिसमें सोडियम विशिष्ट मान्यता कणों से मिलकर तत्वों, पीएच संवेदनशील fluorophores, और additives एम्बेडेड रहे हैं 7-9 Mechanistically, सोडियम मान्यता तत्व सेंसर में सोडियम अर्क 10 निष्कर्षण पीएच - संवेदनशील fluorophore का कारण बनता है एक हाइड्रोजन आयन सेंसर जो कारण बनता है के भीतर प्रभारी तटस्थता बनाए रखने जारी प्रतिदीप्ति में एक परिवर्तन. पोटेशियम अधिक सोडियम सेंसर प्रतिवर्ती और सोडियम के लिए चुनिंदा उच्च intracellular सांद्रता में भी 6 रहे हैं. वे व्यास में लगभग 120 एनएम कर रहे हैं और polyethylene glycol के साथ लेपित हैं biocompatibility प्रदान करने के लिए. Microinjection तकनीकों का प्रयोग, सेंसर, जहां वे हृदय myocytes पिटाई के अस्थायी और स्थानिक सोडियम गतिशीलता की निगरानी करने के लिए दिखाया गया है कोशिकाओं के cytoplasm में दिया जा सकता है है 11 इसके अतिरिक्त, वे भी सोडियम सांद्रता में vivo में वास्तविक समय में परिवर्तन पर नज़र रखी है जब इंजेक्शन. subcutaneously चूहों में 3 के साथ साथ, हम विस्तार से समझाने और फ्लोरोसेंट सोडियम nanosensors fabricating के लिए पद्धति का प्रदर्शन और संक्षिप्त जैविक अनुप्रयोगों हमारी प्रयोगशाला के लिए nanosensors का उपयोग करता है प्रदर्शित: कोशिकाओं में सेंसर के microinjection, और उपचर्म इंजेक्शन चूहों में सेंसर के. .
Protocol
1. Optode की तैयारी
Optode बनाने से पहले, घटकों के aliquots की जरूरत है ताकि है कि वे आसानी से हो सकता है और मापा जा सकता है संग्रहित कर रहे हैं.
- एक 50 मिलीग्राम सोडियम Ionophore एक्स (NaIX) शीशी और एक 50 मिलीग्राम सोडियम tetrakis [3,5 - बिस (trifluoromethyl) फिनाइल] borate NaTFPB () प्रत्येक tetrahyrdofuran (THF) में होगा लाया जा और 1.5 मिलीलीटर polystyrene अपकेंद्रित्र ट्यूबों में aliquoted. एक रासायनिक धूआं हुड, THF की मिलीलीटर में 1 शिपिंग शीशी में NaIX के 50 मिलीग्राम और भंग करने के लिए सुनिश्चित करें कि ठोस पूरी तरह भंग है मिश्रण. 10 अलग अपकेंद्रित्र ट्यूबों में इस समाधान के 100 μl स्थानांतरण. NaTFPB के लिए दोहराएँ. THF में लुप्त हो जाना एक रासायनिक धूआं हुड रातोंरात, अपकेंद्रित्र ट्यूबों लेबल और उन्हें भंडारण के लिए एक 4 डिग्री रेफ्रिजरेटर में जगह दें. यह सूखी NaIX और NaTFPB 5 मिलीग्राम aliquots बनाता है.
- भंग THF के 1 मिलीलीटर में Chromoionophore III (CHIII) और एक 3 मिलीलीटर गिलास शीशी करने के लिए स्थानांतरण. किसी भी अवशिष्ट CHIII भंग करने और 3 मिलीलीटर गिलास शीशी को जोड़ने CHIII शिपिंग शीशी THF का एक और 1 मिलीलीटर जोड़ें. वहाँ अब 2 मिलीलीटर की कुल किया जाएगा. दो अलग - अलग एक Teflon लेपित टोपी के साथ 1.5 मिलीलीटर कांच की शीशियों THF समाधान में CHIII के 1 मिलीलीटर स्थानांतरण. 4 5 मिलीग्राम / एमएल के अंतिम एकाग्रता में डिग्री फ्रिज में स्टोर CHIII समाधान.
इन aliquots और समाधान करने के लिए optode सामग्री बनाने के उपयोग किया जाएगा.
- पिपेट बीआईएस के 66 μl (2 ethylhexyl) एक Teflon लेपित पेंच टोपी के साथ एक 1.5 मिलीलीटर गिलास शीशी में sebacate (डॉस) - इस optode शीशी है. डॉस एक चिपचिपा समाधान है, तो देखभाल करने के लिए समाधान की उचित मात्रा सुनिश्चित करने के लिए लिया जाना चाहिए शीशी को हस्तांतरित है. मात्रा ~ डॉस के 60 मिलीग्राम से मेल खाती है है.
- उच्च आणविक भार पाली (vinyl) क्लोराइड (पीवीसी) के 30 मिलीग्राम वजन और optode शीशी इस हस्तांतरण.
- अब optode शीशी aliquoted कार्यात्मक घटकों को जोड़ने के लिए वांछित optode बनाने. CHIII, NaIX, और NaTFPB के रिश्तेदार सांद्रता सेंसर की सोडियम के जवाब का निर्धारण करेगा. इन सांद्रता के एक संवेदक है कि आदर्श सांद्रता intracellular जवाब, 10 मिमी, या बाह्य सांद्रता के केडी के साथ 150 मिमी की एक केडी के साथ समायोजित किया जा सकता है. इसके अतिरिक्त, वहाँ होने की संभावना है और सेंसर के विक्रेता अंशांकन से रसायनों के बैच परिवर्तनशीलता के बैच अगर सही जवाब रासायनिक घटकों में से प्रत्येक के नए बैच के लिए होने वाली है यह निर्धारित करने के लिए आवश्यक है. यहाँ हम सांद्रता है कि आम तौर पर intracellular सोडियम मापन के लिए उपयोग किया जाता है के साथ एक संवेदक बनाने की विधि का वर्णन.
- एक रासायनिक धूआं हुड में 5 मिलीग्राम / एमएल THF optode शीशी के लिए समाधान में CHIII के 100 μl हस्तांतरण.
- THF के 300 μl में NaIX के 5 मिलीग्राम भंग और optode शीशी 300 μl हस्तांतरण NaIX के 5 मिलीग्राम के लिए इस संबद्ध.
- THF के 500 μl में NaTFPB के 5 मिलीग्राम विभाज्य भंग और optode शीशी, इस संबद्ध NaTFPB के 0.1 मिलीग्राम के लिए समाधान का 20 μl हस्तांतरण.
- Optode शीशी THF की 80 μl जोड़ें.
- optode शीशी में समाधान परमवीर चक्र, डॉस के 60 मिलीग्राम, NaIX NaTFPB, THF के 500 μl में 0.5 मिलीग्राम CHIII के 0.2 मिलीग्राम के 5 मिलीग्राम के 30 मिलीग्राम शामिल हैं. धीरे भंवर परमवीर चक्र के सभी जब तक इस शीशी को भंग कर दिया है. optode एक लाल रंग का होना चाहिए. THF की कुल राशि शीशी को जोडी गयी 500 μL उपयोग घटकों के अनुपात की परवाह किए बिना किया जाना चाहिए.
- NaIX और NaTFPB aliquots में शेष THF रातोंरात और पुनः लेबल रसायन की सही मात्रा के साथ ट्यूब लुप्त हो जाना करने की अनुमति दें.
2. Nanosensors बनाना
- पिपेट 100 μl से 10 मिलीग्राम / एमएल 1,2 - Distearoyl - एस.एन. Glycero-3-Phosphoethanolamine - एन - [(Polyethyleneglycol) Methoxy -550] क्लोरोफॉर्म में एक 4 घूंट कांच की शीशी में (खूंटी लिपिड) . क्लोरोफॉर्म एक रासायनिक धूआं हुड में लुप्त हो जाना करने की अनुमति दें. नाइट्रोजन गैस या घर हवा के साथ समाधान सुखाने के द्वारा इस प्रक्रिया में तेजी लाई जा सकते हैं.
- वांछित खूंटी - लिपिड साथ शीशी के जलीय घोल का 4 मिलीलीटर जोड़ें. Sonicating टिप नीचे एक प्रयोगशाला जैक पर शीशी प्लेस और बढ़ा शीशी जब तक समाधान में 7 गहरी मिमी टिप के बारे में है और 30 सेकंड के लिए एक कम sonication शक्ति पर sonicate. यहाँ हम एक Branson डिजिटल एक आधा इंच टिप व्यास कदम सींग के साथ 15% के आयाम करने के लिए सेट sonifier का उपयोग करें. जलीय घोल किसी भी समाधान किया जा सकता है. उदाहरण के लिए, हम trizma आधार के साथ 10 मिमी HEPES पीएच 7.2 का उपयोग सेंसर की प्रतिक्रिया को निर्धारित करने के लिए.
- जबकि समाधान sonicated जा रहा है, एक 0.6 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में 50 μl dichloromethane के साथ optode सामग्री के 50 μl मिश्रण. विंदुक के साथ मिक्स मिश्रण भी सुनिश्चित.
- Sonifier नियंत्रण समायोजित करने के लिए 3 मिनट के लिए sonicate के लिए. Sonication आरंभ और जबकि sonicating समाधान में पिपेट टिप डुबो और समाधान का एक त्वरित, यहां तक कि इंजेक्शन में 100 μl वितरण शीशी optode मिश्रण समाधान जोड़ने. समाधान नीले, depe बारी चाहिएजलीय समाधान पर इस्तेमाल किया nding.
- Sonication के बारे में 30 सेकंड के लिए जारी रखने के लिए तब कम जैक ताकि sonicating टिप 2 समाधान में गहरी मिमी के बारे में है की अनुमति दें. यह समाधान aerate शुरू समाधान और अपारदर्शी हो जाएगा चाहिए. इस कदम के लिए समाधान से अवशिष्ट THF और dichloromethane हटाने में मदद करता है.
- एक बार sonication पूरा हो गया है, एक 5 मिलीलीटर सिरिंज में nanosensor समाधान खींच. एक 0.2 सुक्ष्ममापी सिरिंज फिल्टर संलग्न और पेंच शीर्ष टोपी के साथ एक कांच की शीशी में nanosensor समाधान के बग़ैर. स्पष्ट और नीले समाधान हो सकता है अगर एक जलीय समाधान है कि कम से कम 10 मिमी सोडियम होता है और के बारे में 9 से कम पीएच है प्रयोग किया जाता है चाहिए. अन्यथा, यह कोई रंग है या गुलाबी होना चाहिए.
3. Nanonsensor प्रतिक्रिया निर्धारण
इस विधि intracellular सोडियम को मापने के लिए डिज़ाइन nanosensors की प्रतिक्रिया को निर्धारित करने के लिए प्रयोग किया जाता है. विभिन्न सांद्रता के कोशिकी सोडियम एकाग्रता nanosensors के लिए इस्तेमाल किया जा सिफारिश कर रहे हैं.
- 10 मिमी (ना 0) HEPES और 10 मिमी (1 एम ना) HEPES और इन समाधानों में से प्रत्येक 7.2 trizma आधार का उपयोग कर पीएच में 1M सोडियम क्लोराइड (NaCl) के शेयर समाधान करें. मिश्रण 50 मिलीलीटर शंक्वाकार अपकेंद्रित्र ट्यूबों में ना 0 और 1 एम ना के शेयर समाधान के साथ समाधान बनाने: 0, 1, 5, 10, 20, 50, 100, 200, 500, 1000 मिमी NaCl सांद्रता.
- एक ऑप्टिकल नीचे 96 अच्छी तरह से थाली का उपयोग करने के लिए प्रतिक्रिया निर्धारित. एक स्तंभ में 3 कुओं सोडियम की प्रत्येक एकाग्रता की 100 μl जोड़ें. यह 3 एक्स 10 कुओं की एक सरणी का उत्पादन होगा.
- प्रत्येक के लिए अच्छी तरह से हौसले से तैयार nanosensors के 100 μl और एक microplate fluorometer में लोड जोड़ें. हम एक आण्विक उपकरणों Spectramax एम 3 का उपयोग करें.
- निम्नलिखित तरंग दैर्ध्य के साथ एक अच्छी तरह से पढ़ें:
| उत्तेजना (एनएम) | उत्सर्जन (एनएम) | कट - ऑफ (एनएम) |
| 488 | 570 | 530 |
| 488 | 670 | 610 |
| 639 | 680 | 665 |
प्रत्येक तरंग दैर्ध्य में nanosensor तीव्रता सोडियम एकाग्रता पर निर्भर है. तरंग दैर्ध्य के प्रयोग के आवेदन पर निर्भर करता है. Intracellular धीमी गतिशीलता माप के लिए, हम 488 nm/570 (उत्तेजना उत्सर्जन /) एनएम और 488 एनएम nm/670 जो हमें दो तरंगदैर्य अनुपात और शोर को कम करने की अनुमति का उपयोग करें.
- परंपरागत रूप से, optode डेटा एक मान जो कर रहे हैं के लिए बदल जाती है: α = (मैं - मैं मिनट) / (मैं अधिकतम - मैं मिनट), जहाँ मैं एक दिया सोडियम एकाग्रता में तीव्रता है, मैं मिनट प्रतिक्रिया माप में सबसे कम तीव्रता है और मैं अधिकतम प्रतिक्रिया माप में उच्चतम तीव्रता है. या तो 570 एनएम पर तीव्रता 670 एनएम या 680 एनएम के लिए α पर तीव्रता से विभाजित पर तीव्रता के अनुपात में कनवर्ट करें.
- साजिश रचने के सॉफ्टवेयर का प्रयोग करें, या तो Excel या उत्पत्ति हमारी प्रयोगशाला में आमतौर पर इस्तेमाल कर रहे हैं, सोडियम एकाग्रता की लॉग बनाम α साजिश, -1 के लिए शून्य सोडियम एकाग्रता के लॉग सेटिंग. प्रतिक्रिया के लिए एक sigmoidal वक्र फ़िट. वक्र से, α = 0.5 सोडियम एकाग्रता है जो एकाग्रता, जिस पर सेंसर बेहतर जवाब का प्रतिनिधित्व करता है की गणना.
- ब्याज की सोडियम एकाग्रता के आसपास इष्टतम प्रतिक्रिया के साथ nanosensors बनाने optode में CHIII, NaIX, और NaTFPB के अनुपात को समायोजित करें.
4. Intracellular इमेजिंग
- माप के लिए intracellular nanosensors पानी में 5 ग्लूकोज मिलीग्राम / एमएल में बना रहे हैं और कोशिकाओं में microinjected.
- बढ़ने या एक गिलास नीचे डिश या एक गिलास coverslip नीचे के साथ एक इमेजिंग कक्ष कोशिकाओं हस्तांतरण है.
- स्पष्ट मीडिया या Tyrode समाधान में कोशिकाओं को सेते हैं. एक epifluorescence खुर्दबीन पर माउंट इमेजिंग कक्ष या पकवान. हम एक Zeiss LSM 7 confocal खुर्दबीन का उपयोग करें.
- केशिका गिलास एक विंदुक खींचने के साथ खींचो. हम एक 1 मिमी आयुध डिपो, 0.78 मिमी आईडी गिलास के साथ भूरे रंग पी 97 ज्वलंत 300-500 एनएम के चारों ओर एक अंतिम टिप व्यास, Sutter का उपयोग करें.
- विंदुक backfill nanosensor एक सिरिंज और एक हैमिल्टन सुई का उपयोग कर समाधान है, या एक microtip लोडर और एक विंदुक के साथ.
- एक धारक है कि एक micromanipulator से जुड़ी है और एक दबाव नियंत्रित इंजेक्शन प्रणाली से जुड़े में पिपेट माउंट. यहाँ हम एक Burleigh EXFO पीसीएस 6000 micromanipulator और चिकित्सा प्रणालियों निगम सुई लगानेवाला का उपयोग करें.
- सेल के शीर्ष पर विंदुक लोअर और cytoplasm में, कभी कभी यह आवश्यक है पियर्स जोड़तोड़ धारक झिल्ली "नल". Nanosensor समाधान इंजेक्षन और जल्दी वापस लेने विंदुक.
5. Vivo इमेजिंग में
सभी प्रक्रियाओं की समीक्षा किया गया है और नॉर्थईस्टर्न विश्वविद्यालय के पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा मंजूरी दे दी.
- Nanosensorsके लिए vivo में, कोशिकी इमेजिंग फॉस्फेट में बना रहे हैं खारा buffered और 135 मिमी की एक सोडियम एकाग्रता में सोडियम के लिए एक इष्टतम प्रतिक्रिया है समायोजित .
- सेट अप इंजेक्शन और चूहों में फ्लोरोसेंट nanosensors के इमेजिंग के लिए, हम IVIS Lumina द्वितीय और इसके संबद्ध संज्ञाहरण इकाई का उपयोग करें. प्रेरण और इमेजिंग कक्षों कीटाणुरहित. प्रेरण कक्ष में CD1 नग्न चूहों (लगभग 20g) प्लेस और उन्हें isoflurane बेनकाब. Isoflurane और ऑक्सीजन प्रशासित flowrate के प्रतिशत प्रजातियों और चूहों के वजन पर निर्भर करता है अलग अलग होंगे, चूहों के लिए प्रतीक्षा करने के लिए पूरी तरह से anesthetized बन.
- बाद चूहों anesthetized हैं, प्रेरण कक्ष और जगह से इमेजिंग कक्ष में चूहों को हटा दें. संज्ञाहरण के तहत चूहों रखें. प्रत्येक माउस के लिए, वांछित इंजेक्शन क्षेत्रों कीटाणुरहित.
- सभी हवाई बुलबुले को दूर करने के लिए सुनिश्चित बनाने nanosensors के 10 μL के साथ एक बाँझ 31G इंसुलिन सिरिंज भरें.
- संदंश का प्रयोग, माउस के पीछे के साथ वांछित इंजेक्शन स्थल पर त्वचा के एक छोटे गुना समझ. जबकि लोभी त्वचा, त्वचा में बेवल का सामना करना पड़ रहा है और सुई त्वचा के लिए समानांतर के साथ सिरिंज सम्मिलित.
- पहले सेंसर इंजेक्शन, सिरिंज सवार पर वापस खींचने के लिए सुनिश्चित करें सुई एक रक्त वाहिका में नहीं डाला जाता है. फिर, धीरे से सुई सही कदम है और त्वचा के भीतर एक जेब बनाने के लिए छोड़ दिया. यह वापस दबाव है जो सेंसर इंजेक्शन साइट के रिसाव के कारण कम कर देंगे. सेंसर इंजेक्षन और धीरे सिरिंज हटायें.
- धीरे इंजेक्शन साइट के लिए दबाव लागू और दूर पोंछ किसी भी समाधान है कि इंजेक्शन साइट के बाहर लीक कर सकते हैं. यह सेंसर कि त्वचा में अंतःक्षिप्त रहे हैं से प्रतिदीप्ति कम कर देंगे.
- दोहराता 5.4 5.7 के माध्यम से कदम जब तक वांछित इंजेक्शन क्षेत्रों की संख्या तक पहुँच जाता है. छह इंजेक्शन पीठ के बाएँ और दाएँ पक्ष पर समान रूप से दूरी साइटों की सिफारिश कर रहे हैं. प्रत्येक व्यक्ति के माउस के लिए, सुइयों बदल अगर सुई त्वचा में डालने के लिए मुश्किल हो जाता है सुई चूहों के बीच साझा नहीं किया जाना चाहिए. यह रोग या चूहों के बीच पार संदूषण संचरण को कम कर देंगे.
- सोडियम फ्लोरोसेंट सेंसर इमेजिंग के लिए, हम दोनों फिल्टर सेट का उपयोग सबसे निकट 640 nm/680 एनएम (/ उत्तेजना और उत्सर्जन) nanosensors के स्पेक्ट्रम मिलान और कहा कि यह भी त्वचा की autofluorescence कम से कम चूहों के brightfield और फ्लोरोसेंट छवियों का अधिग्रहण.
6. प्रतिनिधि परिणाम
चित्रा 1 पांच सोडियम के लिए विभिन्न nanosensor सेट के रिस्पांस घटता. प्रत्येक सेट अलग optode योगों कि CHIII, NaTFPB, पीवीसी और DOS के एक ही राशि लेकिन NaIX की मात्रा बदलती था से nanosensors का प्रतिनिधित्व करता है. α 639/680 एनएम तीव्रता का उपयोग कर मूल्यों के लिए डेटा परिवर्तित किया गया. डेटा 3, त्रुटि स्पष्टता के लिए छोड़े गए सलाखों के एक औसत एक फिट sigmoidal उत्पत्ति का उपयोग वक्र के साथ कर रहे हैं. इस प्रतिक्रिया वक्र में प्रयुक्त सोडियम की अधिकतम एकाग्रता 500 मिमी था. सोडियम के लिए सोडियम nanosensors के केडी 10 मिमी (नारंगी हीरे) के बारे में 150 मिमी (काले वर्गों) को लेकर.
चित्रा 2. नवजात हृदय myocytes इंजेक्शन. कक्ष coverglass पर सुसंस्कृत थे, एक खुर्दबीन पर घुड़सवार और सोडियम nanosensors इंजेक्शन के साथ है. दिखाए जाते हैं फ्लोरोसेंट (639 एनएम उत्तेजना), brightfield, और उपरिशायी. ध्यान दें कि कुछ सेंसर क्लस्टरिंग होता है, लेकिन कोशिकाओं सामान्य आकारिकी, सेंसर cytosol भर में दूर तक फैला हुआ है और वहाँ कोई परमाणु लोड कर रहा है.
चित्रा 3. सोडियम nanosensors साथ चूहों के चमड़े के नीचे इंजेक्शन. सोडियम nanosensors के नौ अलग इंजेक्शन नग्न चूहों के चमड़े के नीचे अंतरिक्ष में किए गए थे. दोनों उज्ज्वल क्षेत्र और फ्लोरोसेंट छवियों (640/680) मढ़ा हैं.
Discussion
nanosensors के गठन के 10 मिनट से अधिक नहीं रह ले एक बार optode समाधान किया गया है चाहिए और खूंटी लिपिड सूखे. Optode ही नहीं किया जा सकता है जल्दी जब जरूरत कर सकते हैं, लेकिन जब 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत है, वे महीने के लिए स्थिर किया जा सकता है. हम पता चला है कि nansensors, एक बार का गठन, समाधान में कम से कम एक सप्ताह के लिए स्थिर रहे हैं, तथापि, ध्यान प्रकाश से nanosensors अवरुद्ध द्वारा इस समय अधिक photobleaching रोकने के लिया जाना चाहिए 6 जबकि सोडियम nanosensors यहाँ प्रदर्शन किया गया, optodes गया है जैसे पोटेशियम और क्लोराइड. 10,12 सबसे biologically प्रासंगिक आयनों के लिए हम भी ग्लूकोज जैसे छोटे अणुओं के लिए इस तकनीक का विस्तार बनाया 13.
Nanosensors पैदा करने के लिए अलग analytes की निगरानी के अलावा, इन nanosensors अन्य बदलाव है कि उन्हें सबसे जैविक प्रयोगों में उपयोगी बनाना होगा करने के लिए उत्तरदायी हैं. उदाहरण के लिए, सतह कोटिंग, इस मामले में पाली (ethylene glycol), आसानी से किसी भी amphiphilic अणु है कि पानी में घुलनशील है का उपयोग बदला जा सकता है. यह अलग अलग अनुप्रयोगों या लक्ष्य के लिए इन नैनोकणों functionalizing की संभावना सक्षम बनाता है. नैनोकणों के आकार भी सतह कोटिंग, sonication तीव्रता या विलायक इस्तेमाल किया बदलकर समायोजित किया जा सकता है.
कैल्शियम फ्लोरोसेंट संकेतक intracellular कैल्शियम संकेतन का निर्धारण करने में अमूल्य किया गया है, लेकिन उपलब्ध नहीं सोडियम संवेदनशील रंगों को एक ही आदर्श विशेषताओं है. Optode इमेजिंग आयनों intracellularly विकास में वर्षों के लिए किया गया है के लिए एक वैकल्पिक तरीका प्रदान करना नैनोकणों 14. हम यह पिछले अनुसंधान पर बनाया है intracellular सोडियम इमेजिंग कि उम्मीद है कि समझने के लिए कैसे सोडियम संकेतन सेलुलर समारोह और को प्रभावित करता है का मतलब प्रदान करेगा के लिए विशिष्ट nanosensors बनाने के लिए संकेतन जो कुछ बीमारियों के लिए नेतृत्व में परिवर्तन.
vivo में फ्लोरोसेंट nanosensors का उपयोग जैसे रक्त खींचता है. 3 सोडियम और ग्लूकोज ऊपर प्रौद्योगिकी पर आधारित nanosensors सोडियम और ग्लूकोज में परिवर्तनों को ट्रैक करने के लिए दिखाया गया है, क्रमशः में अन्य तरीकों पर निगरानी analytes के लिए न्यूनतम इनवेसिव विकल्प वास्तविक समय प्रदान करता है vivo में. 3,13 हालांकि, वहाँ वर्तमान में एक निगरानी उपकरण के रूप में इस विधि के लिए सीमाओं मौजूद है. उदाहरण के लिए, सेंसर पर्याप्त निकट अवरक्त लाल की ओर स्थानांतरित क्रम में त्वचा से पृष्ठभूमि autofluorescence कम से कम 15 द्वितीय. स्पेक्ट्रम के साथ एक fluorophore शामिल होना चाहिए, वर्तमान इंजेक्शन तकनीक nanosensors है जो इस तरह की वजह से हो सकता है की वर्दी इंजेक्शन का उत्पादन नहीं करता इंजेक्शन गहराई में भिन्नता के रूप में त्रुटियों. इन सीमाओं के बावजूद, इन फ्लोरोसेंट nanosensors और उनके सफल प्रदर्शन के विकास के इन सेंसरों एक अमूल्य अनुसंधान और रोगी के स्वास्थ्य की निगरानी के लिए उपकरण विधि बना सकता है.
Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
JMD और MKB नॉर्थईस्टर्न विश्वविद्यालय (NCI और NSF डीजीई +०५०४३३१ अनुदान से धन) IGERT Nanomedicine के विज्ञान और प्रौद्योगिकी कार्यक्रम के माध्यम से वित्त पोषित कर रहे हैं. यह काम भी जनरल मेडिकल साइंसेज अनुदान R01 GM084366 के स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान के राष्ट्रीय संस्थानों द्वारा वित्त पोषित किया गया था. हम भी सौम्या दास और बोस्टन में BIDMC एंथोनी Rosenzweig पशु प्रोटोकॉल के विकास में उनके योगदान के लिए हृदय myocytes और केविन नकद प्रदान करने के लिए धन्यवाद.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| IVIS Lumina II Instrument Package | Caliper Life Sciences | 126273 | |
| CD-1 Nude Mice | Charles River Laboratories | Strain Code: 086 | Immunodeficient |
| Insulin syringes | BD Biosciences | 328438 | 3/10 ccmL , 8mm, 31G |
| High Molecular Weight PVC | Sigma-Aldrich | ||
| DOS | Sigma-Aldrich | ||
| CHIII | Sigma-Aldrich | ||
| NaTFPB | Sigma-Aldrich | ||
| NaIX | Sigma-Aldrich | ||
| Thin walled capillary glass | Sutter Instrument Co. | ||
| PEG lipid | Avanti Polar Lipid, Inc | ||
| Table 1. Provides a list of chemicals and equipment used in this procedure. All common chemicals not listed were purchased from Sigma. | |||
References
- Adrogue, H. J., Madias, N. E.
- Kim, D. Y. BACE1 regulates voltage-gated sodium channels and neuronal activity. Nat Cell Biol. 9, 755-764 (2007).
- Dubach, J. M., Lim, E., Zhang, N., Francis, K. P., Clark, H. in vivo sodium concentration continuously monitored with fluorescent sensors. Integr Biol (Camb). , (2010).
- Minta, A., Tsien, R. Y. Fluorescent indicators for cytosolic sodium. J Biol Chem. 264, 19449-19457 (1989).
- Dubach, J. M., Harjes, D. I., Clark, H. A. Ion-selective nano-optodes incorporating quantum dots. Journal of the American Chemical Society. 129, 8418-8418 (2007).
- Dubach, J. M., Harjes, D. I., Clark, H. A. Fluorescent ion-selective nanosensors for intracellular analysis with improved lifetime and size. Nano Letters. 7, 1827-1831 (1021).
- Schaffar, B., Wolfbeis, O.
- Seiler, K. Characterization of sodium-selective optode membranes based on neutral ionophores and assay of sodium in plasma. Clin Chem. 37, 1350-1355 (1991).
- Zhujun, Z., Mullin, J., Seitz, W. Optical sensor for sodium based on ion-pair extraction and fluorescence. Anal Chim Acta. 184, 251-251 (1986).
- Bakker, E., Buhlmann, P., Pretsch, E. Carrier-Based Ion-Selective Electrodes and Bulk Optodes. 1. General Characteristics. Chem Rev. 97, 3083-3132 (1997).
- Dubach, J. M., Das, S., Rosenzweig, A., Clark, H. A. Visualizing sodium dynamics in isolated cardiomyocytes using fluorescent nanosensors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 16145-16150 (2009).
- Harjes, D. I., Dubach, J. M., Rosenzweig, A., Das, S., Clark, H. A. Ion-Selective Optodes Measure Extracellular Potassium Flux in Excitable Cells. Macromolecular Rapid Communications. 31, 217-221 (2010).
- Balaconis, M. K., Billingsley, K. L., Dubach, J. M., Clark, H. A. Pittsburgh Conference on Analytical Chemistry and Applied, , Forthcoming.
- Park, E. J., Brasuel, M., Behrend, C., Philbert, M. A., Kopelman, R. Ratiometric optical PEBBLE nanosensors for real-time magnesium ion concentrations inside viable cells. Anal Chem. 75, 3784-3791 (2003).
- Frangioni, J. V.
