Summary
Fluoreszierende Nanopartikel in unserem Labor hergestellt werden, für die Bildgebung Ionenkonzentrationen und Ionenströme in biologischen Systemen wie Zellen während der Signalisierung und der interstitiellen Flüssigkeit während der physiologischen Homöostase eingesetzt.
Abstract
Streng reguliert Ionen-Homöostase im Körper ist notwendig für die Verhütung solcher schwächende Zustände wie Austrocknung. 1 In Kontrast, schnelle Ionenflüsse auf zellulärer Ebene für die Einleitung Aktionspotentiale in erregbaren Zellen erforderlich sind. 2 Natrium Regulierung spielt eine wichtige Rolle sowohl in der diesen Fällen, jedoch keine Methode derzeit für die kontinuierliche Überwachung Natrium-Werte in vivo 3 und intrazellulären Natrium-Sonden 4 nicht bereitstellen ähnlich detaillierte Ergebnisse als Calcium-Sonden. In dem Bemühen, diese beiden Hohlräume zu füllen, haben fluoreszierende Nanosensoren entwickelt, die Natrium-Konzentrationen in vitro und in vivo zu überwachen. 5,6 Diese Sensoren sind auf ionenselektive Optode Technologie und bestehen aus Weich-polymeren Teilchen in die Natrium-spezifische Erkennung Elemente, pH-sensitive Fluorophore und Zusatzstoffe eingebettet sind. 7-9 Mechanistisch extrahiert die Natrium-Anerkennung Element Natrium in den Sensor. 10 Diese Extraktion bewirkt, dass der pH-sensitive Fluorophor in einer Wasserstoff-Ionen-Freisetzung in Ladungsneutralität innerhalb des Sensors, die Ursachen zu erhalten eine Änderung in der Fluoreszenz. Die Natrium-Sensoren sind reversibel und selektiv für Natrium über Kalium auch bei hohen intrazellulären Konzentrationen. 6 Sie sind ungefähr 120 nm im Durchmesser und mit Polyethylenglykol beschichtet sind, um Biokompatibilität zu vermitteln. Mit Mikroinjektion Techniken können die Sensoren in das Zytoplasma der Zellen, wo sie gezeigt haben, die zeitliche und räumliche Dynamik Natrium schlagen Herzmuskelzellen Monitor geliefert werden. 11 Darüber hinaus haben sie auch Änderungen in Echtzeit in Natrium-Konzentrationen in vivo verfolgt, wenn sie injiziert subkutan in Mäusen 3 Im Folgenden stellen wir im Detail zu erklären und demonstrieren die Methodik für die Herstellung fluoreszierender Natrium Nanosensoren und kurz zeigen die biologische Anwendungen unserem Labor verwendet die Nanosensoren für:. die Mikroinjektion der Sensoren in die Zellen, und die subkutane Injektion der Sensoren in Mäuse .
Protocol
1. Vorbereitung der Optode
Vor der Optode werden Aliquots der Komponenten müssen so dass sie leicht gemessen und gespeichert werden.
- A 50 mg Natrium-Ionophor X (Naix) Fläschchen und eine 50 mg Natrium-Tetrakis [3,5-Bis (trifluormethyl) phenyl] borat (NaTFPB) wird jeweils bis in tetrahyrdofuran (THF) gebracht werden und aliquotiert in 1,5 ml Polystyrol Röhrchen. In einem Laborabzug lösen sich die 50 mg Naix in 1 ml THF in der Schifffahrt Fläschchen und mischen, um sicherzustellen, dass der Feststoff vollständig gelöst. Transfer 100 ul dieser Lösung in 10 separaten Zentrifugenröhrchen. Wiederholen Sie dies für NaTFPB. Lassen Sie das THF in einem Laborabzug über Nacht verdunsten, beschriften Sie die Röhrchen und legen Sie sie in einem 4-Grad-Kühlschrank für die Aufbewahrung. Dies schafft 5 mg Aliquots trocken Naix und NaTFPB.
- Lösen Sie die Chromoionophor III (CHIII) in 1 ml THF und in ein 3 ml Glasflasche. Add another 1 ml THF zu der CHIII Versand Fläschchen, um restliche CHIII auflösen und addieren sie zum 3 ml Glasflasche. Es werden insgesamt 2 ml jetzt sein. Transfer 1 ml der CHIII in THF-Lösung mit zwei separaten 1,5 ml Glasfläschchen mit einem Teflon beschichteten Kappen. Bewahren Sie die CHIII Lösung in einem 4-Grad-Kühlschrank bei einer Endkonzentration von 5 mg / ml.
Diese Aliquots und Lösungen werden benutzt, um die Optodenmaterials machen.
- Pipette 66 ul von Bis (2-ethylhexyl) sebacat (DOS) in ein 1,5 ml-Glas mit einem Teflon beschichtet Schraubverschluss - das ist die Optode Durchstechflasche. DOS ist eine zähflüssige Lösung so ist darauf zu achten, die richtige Menge der Lösung zu gewährleisten, um die Flasche übertragen wird. Das Volumen entspricht ca. 60 mg des DOS.
- Abwiegen 30 mg hochmolekularer Poly (vinyl)-Chlorid (PVC) und übertragen diese auf die Optode Durchstechflasche.
- Fügen Sie nun die aliquotiert funktionalen Komponenten, die Optode Fläschchen, um die gewünschte Optode erstellen. Die relativen Konzentrationen von CHIII, Naix und NaTFPB bestimmt die Reaktion des Sensors auf Natrium. Diese Konzentrationen können angepasst werden, um einen Sensor, der im Idealfall reagiert auf Konzentrationen intrazellulären, mit einem Kd-Wert von 10 mM oder extrazelluläre Konzentrationen, mit einer Kd von 150 mm aufweisen. Zusätzlich wird es wahrscheinlich Charge zu Charge Schwankungen der Chemikalien vom Hersteller und Kalibrierung der Sensoren ist notwendig, um festzustellen, ob die richtige Antwort für jede neue Charge von chemischen Komponenten auftritt. Hier beschreiben wir die Methode, einen Sensor mit Konzentrationen, die üblicherweise für die intrazelluläre Natrium-Messungen werden zu schaffen.
- In einem Laborabzug, Transfer 100 ul der 5 mg / ml CHIII in THF-Lösung, die Optode Durchstechflasche.
- Lösen Sie 5 mg Naix in 300 ul THF und Transfer 300 pl der Optode Fläschchen, diese korreliert mit 5 mg Naix.
- Lösen Sie eine 5 mg Aliquot der NaTFPB in 500 ul THF und Transfer 20 ul der Lösung des Optode Fläschchen, diese korreliert mit 0,1 mg NaTFPB.
- Add 80 ul THF die Optode Durchstechflasche.
- Die Lösung in der Optode Durchstechflasche enthält 30 mg PVC, 60 mg DOS, 5 mg Naix, 0,2 mg NaTFPB, 0,5 mg CHIII in 500 ul von THF. Vorsichtig vortexen diese Phiole, bis alle PVC gelöst hat. Die Optode sollte eine rote Farbe. Der Gesamtbetrag der THF hinzugefügt, um die Durchstechflasche 500 ul unabhängig von dem Verhältnis der Komponenten verwendet werden.
- Lassen Sie die restliche THF in der Naix und NaTFPB Aliquots über Nacht und re-label das Rohr mit der richtigen Menge von chemischen verdampfen.
2. Erstellen Nanosensoren
- Je 100 ul 10 mg / ml 1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-Phosphoethanolamin-N - [Methoxy (Polyethylenglykol) -550] in Chloroform (PEG-Lipid) in ein 4-DRAM-Glasflasche. Lassen Sie das Chloroform in einem Laborabzug verdampfen. Dieser Prozess kann durch Trocknen der Lösung mit Stickstoffgas oder Stallluft beschleunigt werden.
- 4 ml des gewünschten wässrigen Lösung in die Durchstechflasche mit PEG-Lipid. Legen Sie die Durchstechflasche auf einer Hebebühne unter dem Beschallung Spitze und heben Sie die Flasche, bis die Spitze ist ca. 7 mm tief in die Lösung und beschallen mit einer niedrigen Beschallung Strom für 30 Sekunden. Hier verwenden wir eine Branson digitalen sonifier auf 15% Amplitude mit einem ½-Zoll-Spitzendurchmesser Schritt Horn. Die wässrige Lösung kann eine Lösung sein. Zum Beispiel, um zu bestimmen, die Reaktion der Sensoren verwenden wir 10 mM HEPES pH 7,2 mit Trizma Basis.
- Während die Lösung wird beschallt wird, mischen 50 ul der Optodenmaterials mit 50 ul Dichlormethan in einem 0,6 ml Reaktionsgefäß. Mix mit der Pipette, um sicherzustellen, gleichmäßige Durchmischung.
- Passen Sie die sonifier Steuerung für 3 Minuten beschallt. Starten Sie die Beschallung und während Beschallung hinzufügen Optode Mischung Lösung für das Fläschchen durch Eintauchen der Pipettenspitze in die Lösung und Abgabe der 100 ul Lösung in einer schnellen, sogar Injektion. Die Lösung sollte blau, dependen auf die wässrige Lösung eingesetzt.
- Lassen Sie die Beschallung für ca. 30 Sekunden, dann weiter unten die Buchse, so dass die Beschallung Spitze ca. 2 mm tief in Lösung ist. Dies sollte damit beginnen, die Lösung zu belüften und die Lösung wird undurchsichtig. Dieser Schritt hilft, um das restliche THF und Dichlormethan aus der Lösung zu entfernen.
- Nach Beschallung abgeschlossen ist, ziehen Sie die Nanosensor Lösung in eine 5 ml Spritze. Bringen Sie eine 0,2 um Spritzenfilter und Abgeben der Nanosensor Lösung in einen Glaskolben mit Schraubverschluss Kappe. Die Lösung sollte klar und blau, wenn eine wässrige Lösung, die weniger als 10 mM Natrium enthält und einen pH-Wert weniger als 9 verwendet wird. Ansonsten sollte es keine Farb-oder rosa sein.
3. Bestimmen nanonsensor Antwort
Diese Methode wird verwendet, um die Reaktion der Nanosensoren entwickelt, um intrazelluläre Natrium-Messung zu bestimmen. Unterschiedliche Konzentrationen wird empfohlen, für die extrazelluläre Natrium-Konzentration Nanosensoren eingesetzt werden.
- Machen Stammlösungen von 10 mM HEPES (0 Na) und 1 M Natriumchlorid (NaCl) in 10 mM HEPES (1 M Na) und pH-Wert jeder dieser Lösungen auf 7,2 mit Trizma Basis. Mix Stammlösungen von 0 Na und 1 M Na in 50 ml konische Röhrchen, um Lösungen mit zu erstellen: 0, 1, 5, 10, 20, 50, 100, 200, 500, 1000 mM NaCl-Konzentrationen.
- Verwenden Sie ein optisches Boden 96-Well-Platte, um die Reaktion zu bestimmen. 100 l von jeder Konzentration von Natrium zu 3 Brunnen in einer Spalte. Dies erzeugt ein Array von 3 x 10 Brunnen.
- Zu jedem Well 100 ul der frisch zubereiteten Nanosensoren und Last in einem Mikroplatten Fluorometer. Wir verwenden eine Molecular Devices Spectramax M3.
- Lesen Sie jede auch mit den folgenden Wellenlängen:
| Speisung (nm) | Emission (nm) | Cut-Off (nm) |
| 488 | 570 | 530 |
| 488 | 670 | 610 |
| 639 | 680 | 665 |
Die Nanosensor Intensität bei jeder Wellenlänge ist abhängig von der Natrium-Konzentration. Die Verwendung der Wellenlänge hängt von den Anwendungen. Für intrazelluläre langsame Dynamik Messungen verwenden wir 488 nm/570 nm (Anregung / Emission) und 488 nm nm/670, die uns erlauben, Verhältnis der beiden Wellenlängen und Rauschen zu reduzieren.
- Traditionell wird Optode Daten zu einem Werte, die konvertiert werden: α = (I - I min) / (I max - I min), wo ich die Intensität an einem bestimmten Natrium-Konzentration, I min ist der niedrigste Intensität in der Antwort-Messungen und I max ist die höchste Intensität in der Antwort-Messungen. Convert entweder das Verhältnis der Intensität bei 570 nm durch die Intensität bei 670 nm oder die Intensität bei 680 nm zu α unterteilt.
- Verwenden Sie Plotten Software, Excel oder Origin typischerweise in unserem Labor benutzt, um α gegen den log der Natriumkonzentration Grundstück, Einstellung der log von Null-Natrium-Konzentration auf -1. Fit eine sigmoide Kurve, um die Antwort. Aus der Kurve, berechnet die Natrium-Konzentration bei α = 0,5, die die Konzentration, bei der der Sensor optimal reagiert darstellt.
- Passen Sie das Verhältnis von CHIII, Naix und NaTFPB in der Optode zu Nanosensoren mit optimaler Reaktion rund um die Natrium-Konzentration von Interesse zu erzeugen.
4. Intrazelluläre Bildgebung
- Für intrazelluläre Messungen werden die Nanosensoren in 5 mg / ml Glucose in Wasser und mikroinjiziert in die Zellen.
- Wachsen oder Übertragung Zellen zu einem Glasboden Schüssel oder ein bildgebendes Kammer mit einem Deckglas unten.
- Inkubieren Sie die Zellen in klaren Medien oder Tyrode-Lösung. Montieren Sie den Imaging-Kammer oder einen Teller auf einem Epifluoreszenzmikroskop. Wir verwenden ein Zeiss LSM 7 konfokalen Mikroskop.
- Pull Kapillare aus Glas mit einer Pipette Abzieher. Wir verwenden eine sutter flammenden braun p-97 mit 1 mm OD, 0,78 mm ID Glas, ein letzter Tipp Durchmesser rund 300-500 nm.
- Backfill die Pipette mit Nanosensor Lösung mit einer Spritze und einem Hamilton Nadel oder ein Mikrospitze Lader und eine Pipette.
- Montieren Sie die Pipette in eine Halterung, die an einem Mikromanipulator befestigt ist und mit einem Druck gesteuertes Einspritzsystem. Hier verwenden wir eine Burleigh EXFO PCS 6000 Mikromanipulator und ein Medical Systems Corporation Injektor.
- Senken Sie die Pipette auf der Zelle und in das Zytoplasma, manchmal ist es notwendig, "Tap" den Manipulator Halter zu durchdringen die Membran. Injizieren Sie die Lösung Nanosensor und schnell zurückziehen Pipette.
5. In-vivo-Bildgebung
Alle Verfahren wurden überarbeitet und durch Northeastern University Animal Care und Verwenden Committee genehmigt.
- Nanosensorsfür in vivo, extrazelluläre Bildgebung sind in Phosphat aus Kochsalzlösung und angepasst, um eine optimale Reaktion auf Natrium in einer Natrium-Konzentration von 135 mm haben.
- Für die Injektion Set-up und die Abbildung der Fluoreszenz-Nanosensoren in Mäusen, verwenden wir die IVIS Lumina II und der damit verbundenen Narkose-Einheit. Desinfizieren Sie die Induktions-und Imaging-Kammern. Legen Sie CD1 Nacktmäusen (ca. 20g) in der Induktion Kammer und schützen Sie sie vor Isofluran. Der prozentuale Anteil von Isofluran und Sauerstoff verabreicht Durchfluss variiert je nach Art und Gewicht der Mäuse. Warten Sie, bis die Mäuse voll narkotisiert.
- Nach der Mäuse betäubt sind, entfernen Sie die Mäuse aus der Induktion Kammer und Ort in der Imaging-Kammer. Halten Sie den Mäusen unter Narkose. Für jede Maus, desinfizieren Sie die gewünschte Injektion Bereichen.
- Füllen Sie eine sterile 31G Insulinspritze mit 10 ul Nanosensoren achten Sie darauf, alle Luftblasen zu entfernen.
- Mit einer Pinzette fassen Sie eine kleine Hautfalte an der Rückseite der Maus auf die gewünschte Einstichstelle. Fassen Sie die Haut, die Spritze in die Haut mit der Fase nach oben, und die Nadel parallel zur Haut.
- Vor Injektion der Sensoren, ziehen wieder an der Spritze, damit die Nadel nicht in ein Blutgefäß eingeführt. Dann vorsichtig bewegen Sie die Nadel nach rechts und links, um eine Tasche in der Haut zu schaffen. Dies minimiert den Staudruck der die Sensoren ein Austreten aus der Injektionsstelle verursacht. Spritzen Sie die Sensoren und entfernen Sie vorsichtig die Spritze.
- Durch leichten Druck auf die Injektionsstelle und wischen Sie jede Lösung, die aus der Injektionsstelle können zugespielt haben. Dies minimiert die Fluoreszenz von Sensoren, die nicht in die Haut injiziert werden.
- Wiederholen Sie die Schritte 5,4 bis 5,7, bis die Anzahl der gewünschten Einspritz Bereichen erreicht ist. Sechs Injektionen gleichmäßig auf der linken und rechten Seite des Rückens verteilt werden empfohlen. Für jede einzelne Maus, ändern Nadeln, wenn die Nadel wird schwierig, in die Haut legen. Nadeln sollten nicht zwischen Mäusen geteilt werden. Dies wird die Übertragung von Krankheiten oder Kreuzkontamination zwischen Mäusen zu minimieren.
- Für die Bildgebung der Natrium-Fluoreszenz-Sensoren, so erwerben wir sowohl Hellfeld-und Fluoreszenz-Bilder von den Mäusen mit Filter setzt, dass die meisten eng aufeinander abgestimmt die 640 nm/680 nm (Anregung / Emission) Spektrum der Nanosensoren und minimieren auch die Autofluoreszenz der Haut.
6. Repräsentative Ergebnisse
Abbildung 1. Ansprechkurven von fünf verschiedenen Nanosensor setzt auf Natrium. Jeder Satz stellt Nanosensoren aus verschiedenen Optode Formulierungen, die die gleiche Menge an CHIII, NaTFPB, PVC-und DOS, aber unterschiedliche Mengen an Naix hatte. Die Daten wurden auf α-Werte mit den 639/680 nm Intensitäten umgewandelt. Die Daten werden im Durchschnitt 3, Fehlerbalken weggelassen, mit einem ausgestattet sigmoide Kurve mit Origin. In dieser Kurve wurde die maximale Konzentration von Natrium verwendet 500 mM. Die Kd der Natrium-Nanosensoren für Natrium reichten von 10 mM (orange Diamanten) auf etwa 150 mM (schwarze Quadrate).
Abbildung 2. Neonatalen Herzmuskelzellen injiziert. Die Zellen wurden auf Deckgläsern kultiviert, montiert auf einem Mikroskop und injiziert mit Natrium Nanosensoren. Dargestellt sind fluoreszierende (639 nm Anregung), Hellfeld, und Overlay. Beachten Sie, dass einige Sensor-Clustering, tritt aber die Zellen haben eine normale Morphologie, Sensoren haben in der gesamten Cytosol verbreitet und es gibt keine nukleare loading.
Abbildung 3. Subkutane Injektion von Mäusen mit Natrium Nanosensoren. Neun verschiedene Injektionen von Natrium Nanosensoren wurden in das subkutane Raum von Nacktmäusen gemacht. Beide Hellfeld-und Fluoreszenz-Bilder (640/680) überlagert werden.
Discussion
Die Bildung von Nanosensoren sollte nicht länger als 10 Minuten nach dem Optode Lösung gemacht worden ist und die PEG Lipid getrocknet. Optode kann nicht nur schnell gemacht, wenn nötig, aber bei 4 Grad Celsius gelagert, können sie über Monate stabil. Wir haben gezeigt, dass die nansensors, einmal gebildet, stabil in Lösung für mindestens eine Woche;. Aber darauf zu achten, um zu verhindern Ausbleichen in dieser Zeit durch die Blockierung der Nanosensoren von Licht 6 Während Natrium Nanosensoren hier gezeigt wurden, haben Optoden worden erstellt für die meisten biologisch relevanten Ionen wie Kalium und Chlorid. 10,12 Wir haben auch diese Technologie, um kleine Moleküle wie Glukose erweitert haben. 13
Neben der Erzeugung von Nanosensoren auf verschiedene Analyten zu überwachen, sind diese Nanosensoren zugänglich andere Änderungen, um sie sinnvoll in den meisten biologischen Experimente werden. Zum Beispiel, der Oberflächenbeschichtung, in diesem Fall Poly (Ethylenglykol), kann leicht geändert mit jedem amphiphilen Molekül, das wasserlöslich ist. Dies ermöglicht die Möglichkeit der Funktionalisierung dieser Nanopartikel für verschiedene Anwendungen oder Ziele. Die Größe der Nanopartikel können auch durch Änderung der Oberflächenbeschichtung, die Beschallung Intensität oder das verwendete Lösungsmittel eingestellt werden.
Calcium fluoreszierenden Indikatoren wurden von unschätzbarem Wert bei der Bestimmung intrazellulären Calcium-Signalgebung, haben jedoch keine verfügbaren Natrium Farbstoffe die gleiche ideale Eigenschaften. Optode Nanopartikel sollen eine alternative Methode für die Bildgebung Ionen intrazellulär haben in der Entwicklung schon seit Jahren bieten. 14 Wir haben auf dieser vorheriger Forschungsarbeiten, um Nanosensoren spezifisch für intrazelluläre Natrium-Bildgebung, die hoffentlich wird ein Mittel zu verstehen, wie Natrium-Signalisierung zelluläre Funktion und wirkt erstellen Änderungen in der Signaltechnik, die für bestimmte Krankheiten führen.
Die Verwendung von fluoreszierenden Nanosensoren in vivo bietet eine Echtzeit-minimal-invasive Alternative zur Überwachung Analyten im Vergleich zu anderen Methoden wie Blutabnahmen. 3 Natrium und Glukose Nanosensoren auf der Technologie basiert oben wurde gezeigt, dass Veränderungen in Natrium und Glukose Track, bzw. in vivo. 3,13 Allerdings existieren derzeit Einschränkungen dieser Methode als Monitoring-Tool. Zum Beispiel die Sensoren ein Fluorophor mit einem Spektrum hinreichend auf die Nah-Infrarot-Rot verschoben, um Hintergrund-Autofluoreszenz von der Haut zu minimieren. 15 Zweitens enthalten muss, wird die aktuelle Injektionstechnik nicht produzieren einheitliche Injektion des Nanosensoren, die durch solche verursacht werden können, Fehler als Variation in Injektion Tiefe. Trotz dieser Einschränkungen könnte die Entwicklung dieser fluoreszierenden Nanosensoren und ihre erfolgreiche Demonstration machen diese Sensoren eine unschätzbare Recherche-Tool und Verfahren zur Überwachung der Gesundheit der Patienten.
Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
JMD und MKB durch die IGERT Nanomedizin Science and Technology-Programm an der Northeastern University (Finanzierung von NCI und NSF gewähren DGE-0504331) gefördert. Diese Arbeit wurde auch von den National Institutes of Health National Institute of General Medical Sciences Stipendium R01 GM084366 finanziert. Wir danken auch Saumya Das und Anthony Rosenzweig von BIDMC in Boston für die Bereitstellung von Herzmuskelzellen und Kevin Bargeld für seinen Beitrag in der Tier-Protokoll Entwicklung.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| IVIS Lumina II Instrument Package | Caliper Life Sciences | 126273 | |
| CD-1 Nude Mice | Charles River Laboratories | Strain Code: 086 | Immunodeficient |
| Insulin syringes | BD Biosciences | 328438 | 3/10 ccmL , 8mm, 31G |
| High Molecular Weight PVC | Sigma-Aldrich | ||
| DOS | Sigma-Aldrich | ||
| CHIII | Sigma-Aldrich | ||
| NaTFPB | Sigma-Aldrich | ||
| NaIX | Sigma-Aldrich | ||
| Thin walled capillary glass | Sutter Instrument Co. | ||
| PEG lipid | Avanti Polar Lipid, Inc | ||
| Table 1. Provides a list of chemicals and equipment used in this procedure. All common chemicals not listed were purchased from Sigma. | |||
References
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