Summary

تضخيم وقياس HIV - 1 الحمض النووي الريبي في الأفراد المصابين بالايدز مع الأحمال الفيروسية أقل من الحد كشفها بواسطة فحوصات السريرية القياسية

Published: September 26, 2011
doi:

Summary

قياس مستويات HIV – 1 الحمض النووي الريبي في البلازما وتسلسل واحد HIV – 1 من الجينوم الفيروسي مع الاحمال الأفراد أقل من الحد من الكشف (50-75 نسخة / مل) هو أمر صعب. نحن هنا تصف كيفية استخراج وتحديد الحمض النووي الريبي البلازما الفيروسية باستخدام PCR الوقت الحقيقي مقايسة أن التدابير موثوق HIV – 1 RNA الى 0.3 نسخة / مل ، وكيف لتضخيم الجينوم الفيروسي بواسطة تسلسل الجينوم واحدة ، من العينات مع الأحمال الفيروسية منخفضة جدا.

Abstract

تضخيم الجينات الفيروسية وقياس HIV – 1 الحمض النووي الريبي في الأفراد المصابين HIV – 1 مع الأحمال الفيروسية أقل من الحد من الكشف عن طريق فحوصات قياسية (50-75 أدناه نسخة / مل) ضروري لاكتساب المعرفة لديناميات الفيروسية والتفاعلات المضيف الفيروس لدى المرضى الذين بطبيعة الحال السيطرة على العدوى وأولئك الذين هم على العلاج المضاد للفيروسات الجمع (سلة).

نحن هنا تصف كيفية تضخيم الجينوم الفيروسي بواسطة تسلسل الجينوم واحد (بروتوكول SGS) 13 و 19 و كيفية تحديد بدقة HIV – 1 الحمض النووي الريبي في المرضى الذين يعانون من انخفاض الأحمال الفيروسية (في نسخة واحدة الرزن (SCA) بروتوكول) 12 ، 20.

وفحص واحد هو نسخة فحص PCR في الوقت الحقيقي مع حساسية اعتمادا على حجم يجري يعاير البلازما. إذا تم الكشف عن جينوم فيروس واحد في 7 مل من البلازما ، ثم يذكر أن عدد نسخ الحمض النووي الريبي لتكون 0.3 نسخة / مل. في مقايسة لديه اختبار الرقابة الداخلية للكفاءة استخراج الحمض النووي الريبي ، وضوابط لتضخيم محتمل من الحمض النووي أو التلوث. ويتم قياس عينات المرضى في ثلاث نسخ.

في واحد تسلسل الجينوم مقايسة (SGS) ، والآن تستخدم على نطاق واسع والتي تعتبر غير العمل المكثف 3 ، 7 ، 12 ، 14 ، 15 ، هو التخفيف مقايسة الحد ، في النهاية المخفف الذي ينتشر أكثر من منتج [كدنا] بئر – 96 لوحة. وفقا لتوزيع بواسون ، عندما يكون أقل من 1 / 3 من الآبار تعطي المنتج ، وهناك فرصة بنسبة 80 ٪ من الناتج منتج PCR يجري من تضخيم من [كدنا] جزيء واحد. اس جي اس لديه ميزة على استنساخ عدم التعرض للاختزال وعدم التحيز من قبل PCR – قدم تأشب 19. ومع ذلك ، فإن نجاح التضخيم من هيئة السلع التموينية وSGS تعتمد على التصميم التمهيدي. وقد وضعت على حد سواء المقايسات للفيروس B – 1 النوع الفرعي ، ولكن يمكن تكييفها لفرعية أخرى ومناطق أخرى من الخريطة الوراثية البشرية من قبل الاشعال المتغيرة ، وتحقيقات ، والمعايير.

Protocol

1. استخراج الحمض النووي الريبي من كميات كبيرة من البلازما وتقدم عرضا عاما للمقايسة نسخة واحدة (SCA) ، وبروتوكول واحد تسلسل الجينوم (SGS) في أرقام 1 و 2. للحصول على 7 مل من البلازما ، وتدور…

Discussion

HIV – 1 الأفراد المصابين على العلاج المضاد للفيروسات الجمع (سلة) ، أو الذين يسيطرون بشكل طبيعي للعدوى الفيروسية والأحمال منخفضة جدا ، وعادة حوالي 1 نسخة لكل مليلتر من البلازما 4 ، 11 ، 12 ، 17 ، 18. الأحمال الفيروسية في المرضى الذين يعانون من السيطرة الطبيعية ، وكثيرا ما …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

الكتاب نود أن ننوه المرضى الذين شاركوا في العديد من الدراسات من HIV – 1.

وكان JMC أستاذ البحوث في جمعية السرطان الاميركية بدعم من مؤسسة كيربي FM.

Materials

Name of Reagent Company Catalogue number Comments
Random hexamers (500 ug/ml) Promega C118A  
Taqman buffer A Applied Biosystems 4304441  
RNAsin (40 U/ul) Promega N211B  
RT enzyme (200 U/ul) Strategene 600107-51  
Amplitaq Gold DNA polymerase Applied Biosystems 4311814 6-pack
Amplitaq 10XGold PCR buffer II Applied Biosystems 4311814 comes with the enzyme
Magnesiumcloride 25 mM Applied Biosystems 4311814 comes with the enzyme
1M Tris-HCl buffer, pH 8.0, 5 mM Invitrogen AM9855G  
Superscript III reverse transcriptase enzyme, 200 U/ul Invitrogen 18080-044  
Superscript III 10X buffer Invitrogen   comes with the enzyme
DTT 100 mM Invitrogen   comes with the enzyme
Platinum Taq DNA polymerase High Fidelity 5 U/ul Invitrogen 11304-102  
10X High Fidelity PCR Buffer Invitrogen 11304-102 comes with the enzyme
Proteinase-K 20 mg/ml Ambion 2546  
Guanidinium Thiocyanate solution 6M FlukaBiochemica 50983  
Glycogen 20 mg/ml Roche 10901393001  
Isopropanol Sigma-Aldrich 19516  
Ethanol 70% Sigma-Aldrich E702-3  
Molecular grade water Gibco/Invitrogen 10977-015  
dNTPs (25 mmol each) Bioline BIO-39025  
Name of Euipment Company Catalogue number Comments
Easy Seal Centrifuge Tubes (16x73mm) Seaton Scientific 6041  
White Delrin crowns Seaton Scientific 4020 Caps for the Easy Seal Tubes
Tube Rack for Optiseal Bell-Top Tubes, 8.9 ml Beckman 361642  
Hex driver ½ inc opening Seaton Scientific 4013  
cap removal tupe Seaton Scientific 4014  
5 ml serological pipettes Costar 4051  
Pipetboy any    
15 ml Transfer pipettes ISC Bioexpress P-5005-7  
5.8 ml Dispossable transfer pipettes, fine tip VWR 14670-329  
15 ml centrifuge tubes Falcon    
1 ml centrifuge tubes any    
Tris buffer Saline tablets Sigma-Aldrich T5030-100TAB  
Ultracentrifuge and rotor Sorval 90SE and T-1270  
96-well PCR plates Biorad HSS-9601  
50 ml Reagent reservoir Costar 4870  
Microamp optical 96-well reaction plate Applied Biosystems N801-0560  
Optical plate covers Applied Biosystems 4333183  
MicroAmp Optical Compression Pad Applied Biosystems 4312639  
Microseal A film Biorad MSA-5001  
2 ml centrifuge tubes Any    
1% agarose gels (E-gel, invitrogen) Invitrogen G-7008-01  
E-base (Invitrogen) Invitrogen EB-M03  

EDTA Collection tubes any brand

References

  1. Amara, R. R., Villinger, F., Altman, J. D., Lydy, S. L., O’Neil, S. P., Staprans, S. I., Montefiori, D. C., Xu, Y., Herndon, J. G., Wyatt, L. S. Control of a mucosal challenge and prevention of AIDS by a multiprotein DNA/MVA vaccine. Vaccine. 20, 1949-1955 (2002).
  2. Dinoso, J., Kim, S., Blankson, J., Siliciano, R. F. Viral Dynamics of Elite Suppressors in HIV-1 Infection. Conference on Retroviruses and Opportunistic Infections. , (2008).
  3. Dinoso, J. B., Kim, S. Y., Wiegand, A. M., Palmer, S. E., Gange, S. J., Cranmer, L., O’Shea, A., Callender, M., Spivak, A., Brennan, T., Kearney, . Treatment intensification does not reduce residual HIV-1 viremia in patients on highly active antiretroviral therapy. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 9403-9408 (2009).
  4. Doria-Rose, N. A., Klein, R. M., Manion, M. M., O’Dell, S., Phogat, A., Chakrabarti, B., Hallahan, C. W., Migueles, S. A., Wrammert, J., Ahmed, R., Nason, M., Wyatt, R. T., Mascola, J. R., Connors, M. Frequency and phenotype of human immunodeficiency virus envelope-specific B cells from patients with broadly cross-neutralizing antibodies. J. Virol. 83, 188-199 (2009).
  5. Dornadula, G., Zhang, H., Uitert, B. V. a. n., Stern, J., Livornese, L., Ingerman, M. J., Witek, J., Kedanis, R. J., Natkin, J., DeSimone, J., Pomerantz, R. J. Residual HIV-1 RNA in blood plasma of patients taking suppressive highly active antiretroviral therapy. JAMA. 282, 1627-1632 (1999).
  6. Gandhi, R. T., Zheng, L., Bosch, R. J., Chan, E. S., Margolis, D. M., Read, S., Kallungal, B., Palmer, S., Medvik, K., Lederman, M. M., Alatrakchi, N., Jacobson, J. M., Wiegand, A., Kearney, M., Coffin, J. M., Mellors, J. W., Eron, J. J. The effect of raltegravir intensification on low-level residual viremia in HIV-infected patients on antiretroviral therapy: a randomized controlled trial. PLoS medicine. 7, (2010).
  7. Gay, C., Dibben, O., Anderson, J. A., Stacey, A., Mayo, A. J., Norris, P. J., Kuruc, J. D., Salazar-Gonzalez, J. F., Li, H., Keele, B. F., Hicks, C., Margolis, D., Ferrari, G., Haynes, B., Swanstrom, R. Cross-sectional detection of acute HIV infection: timing of transmission, inflammation and antiretroviral therapy. PLoS One. 6, 19617-19617 (2011).
  8. Hatano, H., Delwart, E. L., Norris, P. J., Lee, T. H., Dunn-Williams, J., Hunt, P. W., Hoh, R., Stramer, S. L., Linnen, J. M., McCune, J. M., Martin, J. N., Busch, M. P., Deeks, S. G. Evidence for persistent low-level viremia in individuals who control human immunodeficiency virus in the absence of antiretroviral therapy. J. Virol. 83, 329-335 (2009).
  9. Havlir, D. V., Bassett, R., Levitan, D., Gilbert, P., Tebas, P., Collier, A. C., Hirsch, M. S., Ignacio, C., Condra, J., Gunthard, H. F., Richman, D. D., Wong, J. K. Prevalence and predictive value of intermittent viremia with combination hiv therapy. JAMA. 286, 171-179 (2001).
  10. Jordan, M. R., Kearney, M., Palmer, S., Shao, W., Maldarelli, F., Coakley, E. P., Chappey, C., Wanke, C., Coffin, J. M. Comparison of standard PCR/cloning to single genome sequencing for analysis of HIV-1 populations. J Virol Methods. 168, 114-120 (2010).
  11. Kaufmann, D. E., Kavanagh, D. G., Pereyra, F., Zaunders, J. J., Mackey, E. W., Miura, T., Palmer, S., Brockman, M., Rathod, A., Piechocka-Trocha, A., Baker, B., Zhu, B., Gall, S. L. e., Waring, M. T., Ahern, R., Moss, K., Kelleher, A. D. Upregulation of CTLA-4 by HIV-specific CD4+ T cells correlates with disease progression and defines a reversible immune dysfunction. Nat Immunol. 8, 1246-1254 (2007).
  12. Kearney, M., Maldarelli, F., Shao, W., Margolick, J. B., Daar, E. S., Mellors, J. W., Rao, V., Coffin, J. M., Palmer, S. HIV-1 Population Genetics and Adaptation in Newly Infected Individuals. J. Virol. 83, 2715-2727 (2008).
  13. Kearney, M., Palmer, S., Maldarelli, F., Shao, W., Polis, M. A., Mican, J., Rock-Kress, D., Margolick, J. B., Coffin, J. M., Mellors, J. W. Frequent polymorphism at drug resistance sites in HIV-1 protease and reverse transcriptase. AIDS. 22, 497-501 (2008).
  14. Kearney, M., Spindler, J., Shao, W., Maldarelli, F., Palmer, S., Hu, S. L., Lifson, J. D., Kewal Ramani, V. N., Mellors, J. W., Coffin, J. M., Ambrose, Z. Genetic diversity of simian immunodeficiency virus encoding HIV-1 reverse transcriptase persists in macaques despite antiretroviral therapy. Journal of Virology. 85, 1067-1076 (2011).
  15. Keele, B. F., Giorgi, E. E., Salazar-Gonzalez, J. F., Decker, J. M., Pham, K. T., Salazar, M. G., Sun, C., Grayson, T., Wang, S., Li, H., Wei, X., Jiang, C., Kirchherr, J. L., Gao, F., Anderson, J. A., Ping, L. H., Swanstrom, R. Identification and characterization of transmitted and early founder virus envelopes in primary HIV-1 infection. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. , 105-7552 (2008).
  16. Liu, S. L., Rodrigo, A. G., Shankarappa, R. G., Learn, H., Hsu, L., Davidov, O., Zhao, L. P., Mullins, J. I. HIV quasispecies and resampling. Science. 273, 415-416 (1996).
  17. Mahalanabis, M., Jayaraman, P., Miura, T., Pereyra, F., Chester, E. M., Richardson, B., Walker, B., Haigwood, N. L. Continuous viral escape and selection by autologous neutralizing antibodies in drug-naive human immunodeficiency virus controllers. J. Virol. 83, 662-672 (2009).
  18. Migueles, S. A., Connors, M. The Role of CD4(+) and CD8(+) T Cells in Controlling HIV Infection. Curr. Infect. Dis. Rep. 4, 461-467 (2002).
  19. Palmer, S., Kearney, M., Maldarelli, F., Halvas, E. K., Bixby, C. J., Bazmi, H., Rock, D., Falloon, J., Davey, R. T., Dewar, R. L., Metcalf, J. A., Hammer, S., Mellors, J. W., Coffin, J. M. Multiple, linked human immunodeficiency virus type 1 drug resistance mutations in treatment-experienced patients are missed by standard genotype analysis. J. Clin. Microbiol. 43, 406-413 (2005).
  20. Palmer, S., Wiegand, A. P., Maldarelli, F., Bazmi, H., Mican, J. M., Polis, M., Dewar, R. L., Planta, A., Liu, S., Metcalf, J. A., Mellors, J. W., Coffin, J. M. New real-time reverse transcriptase-initiated PCR assay with single-copy sensitivity for human immunodeficiency virus type 1 RNA in plasma. J. Clin. Microbiol. 41, 4531-4536 (2003).

Play Video

Cite This Article
Mens, H., Kearney, M., Wiegand, A., Spindler, J., Maldarelli, F., Mellors, J. W., Coffin, J. M. Amplifying and Quantifying HIV-1 RNA in HIV Infected Individuals with Viral Loads Below the Limit of Detection by Standard Clinical Assays. J. Vis. Exp. (55), e2960, doi:10.3791/2960 (2011).

View Video