Summary

Förstärka och kvantifiera HIV-1 RNA i hiv-infekterade individer med virusnivåer under gränsen för upptäckt med vanliga kliniska analyser

Published: September 26, 2011
doi:

Summary

Kvantifiering nivåer av HIV-1 RNA i plasma och sekvensering enstaka HIV-1-genomet från individer med virusbelastning under detektionsgränsen (50-75 kopior / ml) är svårt. Här beskriver vi hur du extraherar och kvantifiera plasma RNA med hjälp av en i realtid PCR-analys som tillförlitligt åtgärder HIV-1 RNA ner till 0,3 kopior / ml och hur man kan förstärka virus arvsmassa genom en enda genomet sekvensering, från prov med mycket låg virusnivåer.

Abstract

Förstärka virala gener och kvantifiera HIV-1 RNA i HIV-1 infekterade individer med virusnivåer under gränsen för detektion av standard-analyser (under 50-75 kopior / ml) är nödvändigt för att få insikt till viral dynamik och virus interaktioner värd hos patienter som naturligt bekämpa infektionen och de som står på antiretroviral kombinationsbehandling (CART).

Här beskriver vi hur man kan förstärka virus arvsmassa genom en enda genomet sekvensering (SGS-protokollet) 13, 19 och hur exakt kvantifiera HIV-1 RNA hos patienter med låga virusnivåer (den enda kopian analys (SCA) protokoll) 12, 20.

Den enda kopian analysen är ett realtids-PCR-analys med känslighet beroende på volymen av plasma som analyseras. Om ett enda virus genomet detekteras i 7 ml plasma, då RNA antal kopior uppges vara 0,3 kopior / ml. Analysen har en intern kontroll testa effektiviteten hos RNA-extraktion och kontroller för eventuell förstärkning från DNA eller förorening. Patientprover mäts i tre exemplar.

Den enda genomsekvenseringsprojekt analys (SGS), som nu används i stor utsträckning och anses vara icke-arbetsintensiva 3, 7, 12, 14, 15, är en begränsande utspädning analys, där endpoint utspädd cDNA Produkten är spridd över ett 96-bra plattan. Enligt en Poisson-fördelning, när mindre än 1 / 3 av brunnarna ger produkten, finns det en 80% chans att PCR-produkt som resultanten av förstärkning från en enda cDNA molekyl. SGS har den fördelen framför kloning av att inte utsättas för sampla och inte vara partisk med PCR introducerade-rekombination 19. Men förstärkningen framgång SCA och SGS är beroende av primer design. Båda analyserna har utvecklats för HIV-1 subtyp B, men kan anpassas för andra subtyper och andra regioner i genomet genom att ändra grundfärg, sonder, och standarder.

Protocol

1. Utvinning av RNA från stora volymer av plasma En översikt av de exemplar analys (SCA) och det gemensamma genomet sekvensering (SGS) protokoll som finns i figur 1 och 2. För att få 7 ml plasma, snurra ca 14 ml blod samlas i 15 ml EDTA (inte heparin) samling rör vid 2600 xgi 15 minuter utan att bromsa. Pipettera plasman (var noga med att undvika buffy coat lager) till 15 ml rör. Om RNA är extraheras för den inre kopia analys (SCA), Spike plasma med 30.000 exempl…

Discussion

HIV-1 infekterade individer på antiretroviral behandling (CART) eller som naturligtvis bekämpa infektionen har mycket låga virusnivåer, vanligen omkring 1 exemplar per ml plasma 4, 11, 12, 17, 18. Virusbelastningen hos patienter med naturlig kontroll, ofta fluktuera kring ett enskilt börvärde 1, 2, 17. Känsligheten i analyserna som beskrivs häri är starkt beroende av ingående volym plasma. Generellt har vi arbetat med 7 ml plasma, men positiva resultat kan erhållas från mindre mängder …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Författarna vill tacka de patienter som deltog i många studier av HIV-1.

JMC var Research Professor i American Cancer Society med stöd från FM-Kirby-stiftelsen.

Materials

Name of Reagent Company Catalogue number Comments
Random hexamers (500 ug/ml) Promega C118A  
Taqman buffer A Applied Biosystems 4304441  
RNAsin (40 U/ul) Promega N211B  
RT enzyme (200 U/ul) Strategene 600107-51  
Amplitaq Gold DNA polymerase Applied Biosystems 4311814 6-pack
Amplitaq 10XGold PCR buffer II Applied Biosystems 4311814 comes with the enzyme
Magnesiumcloride 25 mM Applied Biosystems 4311814 comes with the enzyme
1M Tris-HCl buffer, pH 8.0, 5 mM Invitrogen AM9855G  
Superscript III reverse transcriptase enzyme, 200 U/ul Invitrogen 18080-044  
Superscript III 10X buffer Invitrogen   comes with the enzyme
DTT 100 mM Invitrogen   comes with the enzyme
Platinum Taq DNA polymerase High Fidelity 5 U/ul Invitrogen 11304-102  
10X High Fidelity PCR Buffer Invitrogen 11304-102 comes with the enzyme
Proteinase-K 20 mg/ml Ambion 2546  
Guanidinium Thiocyanate solution 6M FlukaBiochemica 50983  
Glycogen 20 mg/ml Roche 10901393001  
Isopropanol Sigma-Aldrich 19516  
Ethanol 70% Sigma-Aldrich E702-3  
Molecular grade water Gibco/Invitrogen 10977-015  
dNTPs (25 mmol each) Bioline BIO-39025  
Name of Euipment Company Catalogue number Comments
Easy Seal Centrifuge Tubes (16x73mm) Seaton Scientific 6041  
White Delrin crowns Seaton Scientific 4020 Caps for the Easy Seal Tubes
Tube Rack for Optiseal Bell-Top Tubes, 8.9 ml Beckman 361642  
Hex driver ½ inc opening Seaton Scientific 4013  
cap removal tupe Seaton Scientific 4014  
5 ml serological pipettes Costar 4051  
Pipetboy any    
15 ml Transfer pipettes ISC Bioexpress P-5005-7  
5.8 ml Dispossable transfer pipettes, fine tip VWR 14670-329  
15 ml centrifuge tubes Falcon    
1 ml centrifuge tubes any    
Tris buffer Saline tablets Sigma-Aldrich T5030-100TAB  
Ultracentrifuge and rotor Sorval 90SE and T-1270  
96-well PCR plates Biorad HSS-9601  
50 ml Reagent reservoir Costar 4870  
Microamp optical 96-well reaction plate Applied Biosystems N801-0560  
Optical plate covers Applied Biosystems 4333183  
MicroAmp Optical Compression Pad Applied Biosystems 4312639  
Microseal A film Biorad MSA-5001  
2 ml centrifuge tubes Any    
1% agarose gels (E-gel, invitrogen) Invitrogen G-7008-01  
E-base (Invitrogen) Invitrogen EB-M03  

EDTA Collection tubes any brand

References

  1. Amara, R. R., Villinger, F., Altman, J. D., Lydy, S. L., O’Neil, S. P., Staprans, S. I., Montefiori, D. C., Xu, Y., Herndon, J. G., Wyatt, L. S. Control of a mucosal challenge and prevention of AIDS by a multiprotein DNA/MVA vaccine. Vaccine. 20, 1949-1955 (2002).
  2. Dinoso, J., Kim, S., Blankson, J., Siliciano, R. F. Viral Dynamics of Elite Suppressors in HIV-1 Infection. Conference on Retroviruses and Opportunistic Infections. , (2008).
  3. Dinoso, J. B., Kim, S. Y., Wiegand, A. M., Palmer, S. E., Gange, S. J., Cranmer, L., O’Shea, A., Callender, M., Spivak, A., Brennan, T., Kearney, . Treatment intensification does not reduce residual HIV-1 viremia in patients on highly active antiretroviral therapy. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 9403-9408 (2009).
  4. Doria-Rose, N. A., Klein, R. M., Manion, M. M., O’Dell, S., Phogat, A., Chakrabarti, B., Hallahan, C. W., Migueles, S. A., Wrammert, J., Ahmed, R., Nason, M., Wyatt, R. T., Mascola, J. R., Connors, M. Frequency and phenotype of human immunodeficiency virus envelope-specific B cells from patients with broadly cross-neutralizing antibodies. J. Virol. 83, 188-199 (2009).
  5. Dornadula, G., Zhang, H., Uitert, B. V. a. n., Stern, J., Livornese, L., Ingerman, M. J., Witek, J., Kedanis, R. J., Natkin, J., DeSimone, J., Pomerantz, R. J. Residual HIV-1 RNA in blood plasma of patients taking suppressive highly active antiretroviral therapy. JAMA. 282, 1627-1632 (1999).
  6. Gandhi, R. T., Zheng, L., Bosch, R. J., Chan, E. S., Margolis, D. M., Read, S., Kallungal, B., Palmer, S., Medvik, K., Lederman, M. M., Alatrakchi, N., Jacobson, J. M., Wiegand, A., Kearney, M., Coffin, J. M., Mellors, J. W., Eron, J. J. The effect of raltegravir intensification on low-level residual viremia in HIV-infected patients on antiretroviral therapy: a randomized controlled trial. PLoS medicine. 7, (2010).
  7. Gay, C., Dibben, O., Anderson, J. A., Stacey, A., Mayo, A. J., Norris, P. J., Kuruc, J. D., Salazar-Gonzalez, J. F., Li, H., Keele, B. F., Hicks, C., Margolis, D., Ferrari, G., Haynes, B., Swanstrom, R. Cross-sectional detection of acute HIV infection: timing of transmission, inflammation and antiretroviral therapy. PLoS One. 6, 19617-19617 (2011).
  8. Hatano, H., Delwart, E. L., Norris, P. J., Lee, T. H., Dunn-Williams, J., Hunt, P. W., Hoh, R., Stramer, S. L., Linnen, J. M., McCune, J. M., Martin, J. N., Busch, M. P., Deeks, S. G. Evidence for persistent low-level viremia in individuals who control human immunodeficiency virus in the absence of antiretroviral therapy. J. Virol. 83, 329-335 (2009).
  9. Havlir, D. V., Bassett, R., Levitan, D., Gilbert, P., Tebas, P., Collier, A. C., Hirsch, M. S., Ignacio, C., Condra, J., Gunthard, H. F., Richman, D. D., Wong, J. K. Prevalence and predictive value of intermittent viremia with combination hiv therapy. JAMA. 286, 171-179 (2001).
  10. Jordan, M. R., Kearney, M., Palmer, S., Shao, W., Maldarelli, F., Coakley, E. P., Chappey, C., Wanke, C., Coffin, J. M. Comparison of standard PCR/cloning to single genome sequencing for analysis of HIV-1 populations. J Virol Methods. 168, 114-120 (2010).
  11. Kaufmann, D. E., Kavanagh, D. G., Pereyra, F., Zaunders, J. J., Mackey, E. W., Miura, T., Palmer, S., Brockman, M., Rathod, A., Piechocka-Trocha, A., Baker, B., Zhu, B., Gall, S. L. e., Waring, M. T., Ahern, R., Moss, K., Kelleher, A. D. Upregulation of CTLA-4 by HIV-specific CD4+ T cells correlates with disease progression and defines a reversible immune dysfunction. Nat Immunol. 8, 1246-1254 (2007).
  12. Kearney, M., Maldarelli, F., Shao, W., Margolick, J. B., Daar, E. S., Mellors, J. W., Rao, V., Coffin, J. M., Palmer, S. HIV-1 Population Genetics and Adaptation in Newly Infected Individuals. J. Virol. 83, 2715-2727 (2008).
  13. Kearney, M., Palmer, S., Maldarelli, F., Shao, W., Polis, M. A., Mican, J., Rock-Kress, D., Margolick, J. B., Coffin, J. M., Mellors, J. W. Frequent polymorphism at drug resistance sites in HIV-1 protease and reverse transcriptase. AIDS. 22, 497-501 (2008).
  14. Kearney, M., Spindler, J., Shao, W., Maldarelli, F., Palmer, S., Hu, S. L., Lifson, J. D., Kewal Ramani, V. N., Mellors, J. W., Coffin, J. M., Ambrose, Z. Genetic diversity of simian immunodeficiency virus encoding HIV-1 reverse transcriptase persists in macaques despite antiretroviral therapy. Journal of Virology. 85, 1067-1076 (2011).
  15. Keele, B. F., Giorgi, E. E., Salazar-Gonzalez, J. F., Decker, J. M., Pham, K. T., Salazar, M. G., Sun, C., Grayson, T., Wang, S., Li, H., Wei, X., Jiang, C., Kirchherr, J. L., Gao, F., Anderson, J. A., Ping, L. H., Swanstrom, R. Identification and characterization of transmitted and early founder virus envelopes in primary HIV-1 infection. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. , 105-7552 (2008).
  16. Liu, S. L., Rodrigo, A. G., Shankarappa, R. G., Learn, H., Hsu, L., Davidov, O., Zhao, L. P., Mullins, J. I. HIV quasispecies and resampling. Science. 273, 415-416 (1996).
  17. Mahalanabis, M., Jayaraman, P., Miura, T., Pereyra, F., Chester, E. M., Richardson, B., Walker, B., Haigwood, N. L. Continuous viral escape and selection by autologous neutralizing antibodies in drug-naive human immunodeficiency virus controllers. J. Virol. 83, 662-672 (2009).
  18. Migueles, S. A., Connors, M. The Role of CD4(+) and CD8(+) T Cells in Controlling HIV Infection. Curr. Infect. Dis. Rep. 4, 461-467 (2002).
  19. Palmer, S., Kearney, M., Maldarelli, F., Halvas, E. K., Bixby, C. J., Bazmi, H., Rock, D., Falloon, J., Davey, R. T., Dewar, R. L., Metcalf, J. A., Hammer, S., Mellors, J. W., Coffin, J. M. Multiple, linked human immunodeficiency virus type 1 drug resistance mutations in treatment-experienced patients are missed by standard genotype analysis. J. Clin. Microbiol. 43, 406-413 (2005).
  20. Palmer, S., Wiegand, A. P., Maldarelli, F., Bazmi, H., Mican, J. M., Polis, M., Dewar, R. L., Planta, A., Liu, S., Metcalf, J. A., Mellors, J. W., Coffin, J. M. New real-time reverse transcriptase-initiated PCR assay with single-copy sensitivity for human immunodeficiency virus type 1 RNA in plasma. J. Clin. Microbiol. 41, 4531-4536 (2003).

Play Video

Cite This Article
Mens, H., Kearney, M., Wiegand, A., Spindler, J., Maldarelli, F., Mellors, J. W., Coffin, J. M. Amplifying and Quantifying HIV-1 RNA in HIV Infected Individuals with Viral Loads Below the Limit of Detection by Standard Clinical Assays. J. Vis. Exp. (55), e2960, doi:10.3791/2960 (2011).

View Video