Förstärka och kvantifiera HIV-1 RNA i hiv-infekterade individer med virusnivåer under gränsen för upptäckt med vanliga kliniska analyser

Summary

Kvantifiering nivåer av HIV-1 RNA i plasma och sekvensering enstaka HIV-1-genomet från individer med virusbelastning under detektionsgränsen (50-75 kopior / ml) är svårt. Här beskriver vi hur du extraherar och kvantifiera plasma RNA med hjälp av en i realtid PCR-analys som tillförlitligt åtgärder HIV-1 RNA ner till 0,3 kopior / ml och hur man kan förstärka virus arvsmassa genom en enda genomet sekvensering, från prov med mycket låg virusnivåer.

Abstract

Förstärka virala gener och kvantifiera HIV-1 RNA i HIV-1 infekterade individer med virusnivåer under gränsen för detektion av standard-analyser (under 50-75 kopior / ml) är nödvändigt för att få insikt till viral dynamik och virus interaktioner värd hos patienter som naturligt bekämpa infektionen och de som står på antiretroviral kombinationsbehandling (CART).

Här beskriver vi hur man kan förstärka virus arvsmassa genom en enda genomet sekvensering (SGS-protokollet) ^{13, 19} och hur exakt kvantifiera HIV-1 RNA hos patienter med låga virusnivåer (den enda kopian analys (SCA) protokoll) ^{12, 20.}

Den enda kopian analysen är ett realtids-PCR-analys med känslighet beroende på volymen av plasma som analyseras. Om ett enda virus genomet detekteras i 7 ml plasma, då RNA antal kopior uppges vara 0,3 kopior / ml. Analysen har en intern kontroll testa effektiviteten hos RNA-extraktion och kontroller för eventuell förstärkning från DNA eller förorening. Patientprover mäts i tre exemplar.

Den enda genomsekvenseringsprojekt analys (SGS), som nu används i stor utsträckning och anses vara icke-arbetsintensiva ^{3, 7, 12, 14, 15,} är en begränsande utspädning analys, där endpoint utspädd cDNA Produkten är spridd över ett 96-bra plattan. Enligt en Poisson-fördelning, när mindre än 1 / 3 av brunnarna ger produkten, finns det en 80% chans att PCR-produkt som resultanten av förstärkning från en enda cDNA molekyl. SGS har den fördelen framför kloning av att inte utsättas för sampla och inte vara partisk med PCR introducerade-rekombination ^19. Men förstärkningen framgång SCA och SGS är beroende av primer design. Båda analyserna har utvecklats för HIV-1 subtyp B, men kan anpassas för andra subtyper och andra regioner i genomet genom att ändra grundfärg, sonder, och standarder.

Protocol

1. Utvinning av RNA från stora volymer av plasma En översikt av de exemplar analys (SCA) och det gemensamma genomet sekvensering (SGS) protokoll som finns i figur 1 och 2. För att få 7 ml plasma, snurra ca 14 ml blod samlas i 15 ml EDTA (inte heparin) samling rör vid 2600 xgi 15 minuter utan att bromsa. Pipettera plasman (var noga med att undvika buffy coat lager) till 15 ml rör. Om RNA är extraheras för den inre kopia analys (SCA), Spike plasma med 30.000 exempl…

Discussion

HIV-1 infekterade individer på antiretroviral behandling (CART) eller som naturligtvis bekämpa infektionen har mycket låga virusnivåer, vanligen omkring 1 exemplar per ml plasma ^{4, 11, 12, 17, 18.} Virusbelastningen hos patienter med naturlig kontroll, ofta fluktuera kring ett enskilt börvärde ^{1, 2, 17.} Känsligheten i analyserna som beskrivs häri är starkt beroende av ingående volym plasma. Generellt har vi arbetat med 7 ml plasma, men positiva resultat kan erhållas från mindre mängder …

Materials

Name of Reagent	Company	Catalogue number	Comments
Random hexamers (500 ug/ml)	Promega	C118A
Taqman buffer A	Applied Biosystems	4304441
RNAsin (40 U/ul)	Promega	N211B
RT enzyme (200 U/ul)	Strategene	600107-51
Amplitaq Gold DNA polymerase	Applied Biosystems	4311814	6-pack
Amplitaq 10XGold PCR buffer II	Applied Biosystems	4311814	comes with the enzyme
Magnesiumcloride 25 mM	Applied Biosystems	4311814	comes with the enzyme
1M Tris-HCl buffer, pH 8.0, 5 mM	Invitrogen	AM9855G
Superscript III reverse transcriptase enzyme, 200 U/ul	Invitrogen	18080-044
Superscript III 10X buffer	Invitrogen		comes with the enzyme
DTT 100 mM	Invitrogen		comes with the enzyme
Platinum Taq DNA polymerase High Fidelity 5 U/ul	Invitrogen	11304-102
10X High Fidelity PCR Buffer	Invitrogen	11304-102	comes with the enzyme
Proteinase-K 20 mg/ml	Ambion	2546
Guanidinium Thiocyanate solution 6M	FlukaBiochemica	50983
Glycogen 20 mg/ml	Roche	10901393001
Isopropanol	Sigma-Aldrich	19516
Ethanol 70%	Sigma-Aldrich	E702-3
Molecular grade water	Gibco/Invitrogen	10977-015
dNTPs (25 mmol each)	Bioline	BIO-39025

Name of Euipment	Company	Catalogue number	Comments
Easy Seal Centrifuge Tubes (16x73mm)	Seaton Scientific	6041
White Delrin crowns	Seaton Scientific	4020	Caps for the Easy Seal Tubes
Tube Rack for Optiseal Bell-Top Tubes, 8.9 ml	Beckman	361642
Hex driver ½ inc opening	Seaton Scientific	4013
cap removal tupe	Seaton Scientific	4014
5 ml serological pipettes	Costar	4051
Pipetboy	any
15 ml Transfer pipettes	ISC Bioexpress	P-5005-7
5.8 ml Dispossable transfer pipettes, fine tip	VWR	14670-329
15 ml centrifuge tubes	Falcon
1 ml centrifuge tubes	any
Tris buffer Saline tablets	Sigma-Aldrich	T5030-100TAB
Ultracentrifuge and rotor	Sorval	90SE and T-1270
96-well PCR plates	Biorad	HSS-9601
50 ml Reagent reservoir	Costar	4870
Microamp optical 96-well reaction plate	Applied Biosystems	N801-0560
Optical plate covers	Applied Biosystems	4333183
MicroAmp Optical Compression Pad	Applied Biosystems	4312639
Microseal A film	Biorad	MSA-5001
2 ml centrifuge tubes	Any
1% agarose gels (E-gel, invitrogen)	Invitrogen	G-7008-01
E-base (Invitrogen)	Invitrogen	EB-M03

EDTA Collection tubes any brand