Kvantifiering nivåer av HIV-1 RNA i plasma och sekvensering enstaka HIV-1-genomet från individer med virusbelastning under detektionsgränsen (50-75 kopior / ml) är svårt. Här beskriver vi hur du extraherar och kvantifiera plasma RNA med hjälp av en i realtid PCR-analys som tillförlitligt åtgärder HIV-1 RNA ner till 0,3 kopior / ml och hur man kan förstärka virus arvsmassa genom en enda genomet sekvensering, från prov med mycket låg virusnivåer.
Förstärka virala gener och kvantifiera HIV-1 RNA i HIV-1 infekterade individer med virusnivåer under gränsen för detektion av standard-analyser (under 50-75 kopior / ml) är nödvändigt för att få insikt till viral dynamik och virus interaktioner värd hos patienter som naturligt bekämpa infektionen och de som står på antiretroviral kombinationsbehandling (CART).
Här beskriver vi hur man kan förstärka virus arvsmassa genom en enda genomet sekvensering (SGS-protokollet) 13, 19 och hur exakt kvantifiera HIV-1 RNA hos patienter med låga virusnivåer (den enda kopian analys (SCA) protokoll) 12, 20.
Den enda kopian analysen är ett realtids-PCR-analys med känslighet beroende på volymen av plasma som analyseras. Om ett enda virus genomet detekteras i 7 ml plasma, då RNA antal kopior uppges vara 0,3 kopior / ml. Analysen har en intern kontroll testa effektiviteten hos RNA-extraktion och kontroller för eventuell förstärkning från DNA eller förorening. Patientprover mäts i tre exemplar.
Den enda genomsekvenseringsprojekt analys (SGS), som nu används i stor utsträckning och anses vara icke-arbetsintensiva 3, 7, 12, 14, 15, är en begränsande utspädning analys, där endpoint utspädd cDNA Produkten är spridd över ett 96-bra plattan. Enligt en Poisson-fördelning, när mindre än 1 / 3 av brunnarna ger produkten, finns det en 80% chans att PCR-produkt som resultanten av förstärkning från en enda cDNA molekyl. SGS har den fördelen framför kloning av att inte utsättas för sampla och inte vara partisk med PCR introducerade-rekombination 19. Men förstärkningen framgång SCA och SGS är beroende av primer design. Båda analyserna har utvecklats för HIV-1 subtyp B, men kan anpassas för andra subtyper och andra regioner i genomet genom att ändra grundfärg, sonder, och standarder.
HIV-1 infekterade individer på antiretroviral behandling (CART) eller som naturligtvis bekämpa infektionen har mycket låga virusnivåer, vanligen omkring 1 exemplar per ml plasma 4, 11, 12, 17, 18. Virusbelastningen hos patienter med naturlig kontroll, ofta fluktuera kring ett enskilt börvärde 1, 2, 17. Känsligheten i analyserna som beskrivs häri är starkt beroende av ingående volym plasma. Generellt har vi arbetat med 7 ml plasma, men positiva resultat kan erhållas från mindre mängder …
The authors have nothing to disclose.
Författarna vill tacka de patienter som deltog i många studier av HIV-1.
JMC var Research Professor i American Cancer Society med stöd från FM-Kirby-stiftelsen.
Name of Reagent | Company | Catalogue number | Comments |
Random hexamers (500 ug/ml) | Promega | C118A | |
Taqman buffer A | Applied Biosystems | 4304441 | |
RNAsin (40 U/ul) | Promega | N211B | |
RT enzyme (200 U/ul) | Strategene | 600107-51 | |
Amplitaq Gold DNA polymerase | Applied Biosystems | 4311814 | 6-pack |
Amplitaq 10XGold PCR buffer II | Applied Biosystems | 4311814 | comes with the enzyme |
Magnesiumcloride 25 mM | Applied Biosystems | 4311814 | comes with the enzyme |
1M Tris-HCl buffer, pH 8.0, 5 mM | Invitrogen | AM9855G | |
Superscript III reverse transcriptase enzyme, 200 U/ul | Invitrogen | 18080-044 | |
Superscript III 10X buffer | Invitrogen | comes with the enzyme | |
DTT 100 mM | Invitrogen | comes with the enzyme | |
Platinum Taq DNA polymerase High Fidelity 5 U/ul | Invitrogen | 11304-102 | |
10X High Fidelity PCR Buffer | Invitrogen | 11304-102 | comes with the enzyme |
Proteinase-K 20 mg/ml | Ambion | 2546 | |
Guanidinium Thiocyanate solution 6M | FlukaBiochemica | 50983 | |
Glycogen 20 mg/ml | Roche | 10901393001 | |
Isopropanol | Sigma-Aldrich | 19516 | |
Ethanol 70% | Sigma-Aldrich | E702-3 | |
Molecular grade water | Gibco/Invitrogen | 10977-015 | |
dNTPs (25 mmol each) | Bioline | BIO-39025 |
Name of Euipment | Company | Catalogue number | Comments |
Easy Seal Centrifuge Tubes (16x73mm) | Seaton Scientific | 6041 | |
White Delrin crowns | Seaton Scientific | 4020 | Caps for the Easy Seal Tubes |
Tube Rack for Optiseal Bell-Top Tubes, 8.9 ml | Beckman | 361642 | |
Hex driver ½ inc opening | Seaton Scientific | 4013 | |
cap removal tupe | Seaton Scientific | 4014 | |
5 ml serological pipettes | Costar | 4051 | |
Pipetboy | any | ||
15 ml Transfer pipettes | ISC Bioexpress | P-5005-7 | |
5.8 ml Dispossable transfer pipettes, fine tip | VWR | 14670-329 | |
15 ml centrifuge tubes | Falcon | ||
1 ml centrifuge tubes | any | ||
Tris buffer Saline tablets | Sigma-Aldrich | T5030-100TAB | |
Ultracentrifuge and rotor | Sorval | 90SE and T-1270 | |
96-well PCR plates | Biorad | HSS-9601 | |
50 ml Reagent reservoir | Costar | 4870 | |
Microamp optical 96-well reaction plate | Applied Biosystems | N801-0560 | |
Optical plate covers | Applied Biosystems | 4333183 | |
MicroAmp Optical Compression Pad | Applied Biosystems | 4312639 | |
Microseal A film | Biorad | MSA-5001 | |
2 ml centrifuge tubes | Any | ||
1% agarose gels (E-gel, invitrogen) | Invitrogen | G-7008-01 | |
E-base (Invitrogen) | Invitrogen | EB-M03 |
EDTA Collection tubes any brand