חלבונים אינטראקציה בדיקה הכרחית לנתיחה של פונקציונליות חלבון. הנה, אנחנו מציגים<em> במבחנה</em> חלבונים assay מחייב בדיקה קרום משותקת חלבון עם חלבון מסיס. Assay זה מספק שיטה אמינה לבדיקת האינטראקציה בין חלבון מסיס לבין חלבון בתמיסה.
אינטראקציות בין חלבונים שונים לאישור חיוני לחקירה של פונקציות הביולוגיים ברמה המולקולרית. ישנן מספר שיטות, הן במבחנה in vivo, כדי להעריך מחייב חלבון, לפחות שתי שיטות המשלימות את החסרונות של כל אחד אחר צריך להתנהל כדי להשיג תובנות אמין.
עבור assay ב vivo, השלמה הקרינה bimolecular (BiFC) assay מייצג את הגישה הפופולרית ביותר פולשנית לפחות המאפשרת לזהות חלבונים אינטראקציה בתוך תאים חיים, כמו גם לזהות את לוקליזציה תאיים של 1,2 החלבונים אינטראקציה. ב assay זה, אי – ניאון N-ו-C-מסוף חצאים של ה-GFP או גירסאותיה הם התמזגו חלבונים נבדק, וכאשר שני חלבונים היתוך הם הביאו יחד בשל אינטראקציות החלבונים "נבדק, האות ניאון הוא מחדש 3-6 . בגלל האות שלו ניתן לזהות בקלות על ידי מיקרוסקופיה epifluorescence או confocal, BiFC התפתחה ככלי רב עוצמה של בחירה בין ביולוגים התא ללימוד על חלבונים אינטראקציות בתאים חיים 3. Assay עם זאת, לפעמים יכול להניב תוצאות חיוביות כוזבות. לדוגמה, האות ניאון ניתן מחדש על ידי שני שברים GFP מסודרים ככל 7 ננומטר אחד מהשני בגלל קרוב אריזה בתא subcellular קטן, אלא כי בשל אינטראקציות ספציפיות 7.
בשל מגבלות אלה, התוצאות שהתקבלו טכנולוגיות הדמיה תא חי חייבת להיות מאושרת על ידי גישה עצמאית מבוססת על עיקרון שונה לאיתור אינטראקציות חלבון. Co-immunoprecipitation (Co-IP) או גלוטתיון transferase (GST) הנפתח מבחני מייצגים שיטות חלופיות כאלה משמשים בדרך כלל כדי לנתח אינטראקציות בין חלבונים במבחנה. עם זאת, אלה מבחני iIn, לעומת זאת, חלבונים נבדק חייב להיות מסיס בקלות למאגר כי supportsused עבור התגובה מחייב. לכן, אינטראקציות ספציפיות הקשורות חלבון מסיס לא ניתן להעריך על ידי טכניקות אלה.
כאן, אנו ממחישים את פרוטוקול עבור assay שכבת קרום חלבון מחייב, אשר עוקף את הקושי הזה. בטכניקה זו, האינטראקציה בין חלבונים מסיסים ובחלקם לא מסיסים ניתן לבדוק באופן מהימן כי אחד החלבונים היא משותקת על מטריצה הממברנה. שיטה זו, בשילוב עם בניסויים vivo, כגון BiFC, מספק גישה אמינה לחקור ולאפיין בנאמנות אינטראקציות בין חלבונים מסיסים ובחלקם לא מסיסים. במאמר זה, מחייב בין נגיף פסיפס הטבק (TMV) חלבון תנועה (MP), אשר מפעילה פונקציות מרובות במהלך ההובלה התא אל התא ויראלי 8-14, וכן interactor צמח זיהו לאחרונה הסלולר, טבק ankyrin לחזור המכילים חלבון (ANK ) 15, מודגמת באמצעות טכניקה זו.
גישה זו מתאימה בדיקות חלבונים אינטראקציות בין שילובים של חלבונים, כאשר לפחות אחד מהם החלבונים הוא מסיס בקלות למאגר מחייב, והוא מיושם בהצלחה שילוב של חלבונים אחרים 17,18. IInteractions בין חלבונים כי הן מסיס בתנאים אלה לא ניתן לבדוק על ידי פרוטוקול זה.
<p class="jove_content" style="…The authors have nothing to disclose.
העבודה במעבדה שלנו הוא נתמך על ידי מענקים מ-NIH, המכון הלאומי של משרד החקלאות המזון והחקלאות, NSF, בארד, DOE, ו BSF ל VC
Name of the reagent | Company | Catalog number |
Protein assay kit | Bio-Rad | 500-0001 |
Proteinase inhibitor cocktail | SIGMA | S8820 |
Mini-PROTEAN system | Bio-RAD | 165-8000 |
Semi-dry western blotting SD electrotransfer system | Bio-RAD | 170-3940 |
Anti-rabbit IgG antibody conjugated with horse radish peroxidase | GenScript | A00098 |
Anti-GST rabbit polyclonal antibody | GenScript | A00097 |
Anti-strepII | GenScript | A00626 |
BioTrace, NT nitrocellulose transfer membrane | Pall Scientific | 27377-000 |
Immobilon western chemiluminescent HRP substrate | Millipore | WBKL S0 050 |