Summary
Тестирование белок-белковые взаимодействия является необходимым условием для вскрытия белка функциональности. Здесь мы вводим
Protocol
1. Выражение и извлечения белков
- Дифференциально теги белки должны быть проверены на их обнаружение. Этикетка белка для иммобилизованных на мембране (ProIM) с тегом больших размеров (например, стоимость), а неконденсированное тег может быть использован в качестве иммобилизованных отрицательного контроля (ProIMnc). Этикетка белков для использования в качестве растворимых зонд (ProSol) либо с большим или небольшим тегов. Предохранитель же тег в соответствующий негативный контроль растворимого белка (ProSOLnc) и включить в анализ взаимодействия для подтверждения специфичности обнаружены обязательными.
- Выбор системы экспрессии белка, чтобы выразить меткой белки, то есть, Е. палочка, бакуловирус и т.д., в зависимости от требований потенциальных сообщение поступательные изменения и урожайность белков.
- Извлечение ProIM и ProIM пс из организма выбора (шаг 1,2) с помощью SDS-PAGE загрузки буфера (20% глицерина, 4% SDS, 20 мМ Трис-HCl, pH6.8), содержащий протеиназы коктейль ингибитора. Оставьте клеточной суспензии при комнатной температуре в течение 15 мин, добавить 0,5% 2-меркаптоэтанола и кипятите в течение 5 мин.
- Извлечение ProSol и ProSol пс из организма выбора (шаг 1,2), используя стандартные протоколы 16. Эти белки должны быть хорошо растворимы в связывающем буфере (140 мМ NaCl, 10 мМ Трис-HCl, рН 7,4, 2 мМ ЭДТА, 2 мМ DTT, 1% БСА, 0,1% Твин-20), используемых в шаге 4.1.
- Определить концентрацию рекомбинантных белков с использованием стандартного метода, например, Bio-Rad комплект анализа белка. такие как Bio-Rad комплект анализа белка. Если сырой экстракт, а не очищенный белок, используется для анализа, оценки концентрации белка интерес в этом экстракте методом сканирующей денситометрии соответствующей зоны на SDS-полиакриламидном геле окрашивали Кумасси Brilliant Blue R-250 и с помощью известных концентрации БСА в качестве справочных.
2. Иммобилизация ProIM и ProIMnc на мембране
- Resolve два набора экстрактов, каждый из которых содержит 1 мкг ProIM и ProIM пс на SDS-полиакриламидном геле в соответствии со стандартным протоколом 16.
- После электрофореза, место передачи геля в 100 мл буфера передачи (60 мМ глицина, 10 мМ Трис, 0,0006% SDS, 20% метанола) и инкубировать при легком помешивании в течение 20 мин при комнатной температуре.
- Электропереноса белки, содержащиеся в геле для нитроцеллюлозы мембраны в соответствии со стандартным протоколом 16.
3. Re-складывания мембраной белков
- После электропереноса, инкубировать мембраны в течение 15 минут в 15 мл буфера (30 мМ Трис-HCl pH7.4, 0,05% Твин-20) с нежным агитацию, чтобы удалить остатки SDS.
- После слива тщательно, передача мембраны до 25 мл буфера денатурации (7 М гуанидина гидрохлорида, 2 мМ EDTA, 50 мМ DTT, 50 мМ Трис-HCl, рН 8,3). и инкубировать в течение 2 часов при комнатной температуре при легком помешивании. (Примечание: нитроцеллюлозные мембраны становится непрозрачной, когда инкубировали в денатурации буфера). и инкубировать в течение 2 часов при комнатной температуре при легком помешивании.
- Передача мембраны до 25 мл TBS (10 мМ Трис-HCl, 150 мМ NaCl, рН 7,4) и инкубировать при легком помешивании в течение 5 мин (Примечание: На этом этапе, мембрана восстанавливает свою первоначальную белого цвета).
- Передача мембраны до 25 мл буфера для связывания (см. шаг 1.2) и инкубируют при 4 ° С с нежным агитацией за одну ночь.
4. Зондирование ProIM по ProSol
- Вырезать мембраны на две полосы, каждая из которых содержит ProIM и ProIM пс.
- Сделать ProSol и ProSOLnc решения гибридизации путем разведения препарата с 1-10 мкг либо ProSol или ProSOLnc в 10 мл свежего буфера для связывания. Передача каждого мембрану в ProSol или ProSOLnc гибридизации раствора и инкубировать в течение 1,5 ч при комнатной температуре при легком помешивании.
- Удалить мембраны от гибридизации решений и промыть три раза в течение 15 минут в каждом из TBS.
5. Визуализация белок-белковых взаимодействий с помощью метода иммуноблоттинга
- Блок мембраны с 2,5% обезжиренного молока в TBST (10 мМ Трис-HCl, 140 мМ NaCl, 0,05% Твин-20, рН 7,4) в течение 1 часа при комнатной температуре. Развести первичного антитела (анти-strepII поликлональных антител кролика) в 0,5% обезжиренного молока в TBST при концентрации, рекомендованные производителем.
- Место заблокированный мембраны в раствор антител и инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре или в течение ночи при 4 ° С при легком помешивании.
- Промыть мембраны в 20 мл TBST в течение 15 минут, и дважды в течение 5 мин при комнатной температуре с нежным агитации.
- Развести вторичные антитела (анти-IgG антитела кролика), сопряженных с пероксидазой хрена (HRP) в 0,5% обезжиренного молока в TBST при концентрации, рекомендованные производителем. Место мембран в вторичными антителамиРешение и инкубировать в течение 1 часа при комнатной температуре с нежным агитации.
- Промыть мембраны в 20 мл TBST в течение 15 минут, и дважды в течение 5 мин при комнатной температуре с нежным агитации. После окончательного полоскания в TBS, визуализировать белок-белковые взаимодействия с использованием субстрата ПХ хемилюминесценции (например, Millipore Immobilon западной хемилюминесцентный HRP подложки).
- Зонд же мембран с первичными антителами для тега, слитый с ProIM, после чего соответствующие вторичные антитела, как описано в шагах 5,1 до 5,4. Визуализируйте ProIM и ProIMnc как описано в шаге от 5,5 до проверки личности полосы, полученные в наложения мембранного белка анализа (шаг 5.5). В большинстве случаев, зачистки не нужно, потому что сигнал получен этот шаг гораздо сильнее, чем остаточная сигнала, полученного на шаге 5.5.
6. Представитель Результаты:
АНК-MP взаимодействия наблюдался BiFC в табачных клеток эпидермиса (рис. 1А). Потому что депутат высоко нерастворимый белок, выраженных в бактерии или в растениях, наложения мембранного белка анализа было принято для проверки этого взаимодействия в пробирке (рис. 1В). Белки экстракты, содержащие 1 мкг GST-MP (ProIM) или неконденсированное GST (ProIM пс) решались путем SDS-электрофореза в полиакриламидном геле, а затем электропереноса на нитроцеллюлозные мембраны. Когда эти ProIMs были исследованы с растворимыми АНК-strepII (ProSol), GST-MP, но не неконденсированное GST, выставлены обязательными (рис. 1Б, дорожки 1, 2, по сравнению с полосы 5, 6). Более того, когда же набор ProIMs были исследованы с несвязанными ProSOLnc, т.е. Arabidopsis цитоплазматической киназы NADH меткой strepII (NADH3-strepII), нет привязки не наблюдалось, дальнейшие демонстрации специфики АНК-MP взаимодействия (рис. 1Б, дорожки 3, 4).
Рисунок 1. Специфическое связывание табака АНК к ВТМ МП в естественных условиях и в пробирке. () АНК-MP взаимодействия в живых табака клеток эпидермиса, обнаруженных BiFC. Сильный сигнал YFP был реконструирован, когда депутат и АНК, слитый с С-концевым и N-терминал половинки YFP, соответственно, были coexpressed в табачных эпидермиса следующие microbombardment их гены, кодирующие. Это BiFC сигнал, накопленный в puncta на периферии клетки, которые являются диагностика плазмодесмами 15. (B), АНК-MP взаимодействия в пробирке, обнаруженных белков анализ наложения оболочки. Белки экстракты, содержащие 1 мкг GST-MP (ProIM) или неконденсированное GST (ProIMnc) были решены на 15% SDS-полиакриламидном геле с последующей электропереноса на нитроцеллюлозные мембраны. GST-MPProIM и GSTProIMnc инкубировали с 0,5 мкг / мл АНК-strepII (ProSol) и АНК обязательным был обнаружен с помощью зондирования мембраны с анти-strepII кролик поликлональных антител, а затем анти-IgG кролика + М вторичными антителами конъюгированных с HRP (дорожки 1 и 2). Ни GST-MPProIM ни GSTProIMnc взаимодействовали с несвязанными белка, Arabidopsis цитоплазматической киназы NADH, слитый с strepII тегом (ProSOLnc, полосы 3 и 4). Идентичность группы наблюдалось в данном исследовании было подтверждено с помощью зондирования мембраны с анти-GST антител (полосы 5 и 6). Когда мембраны обрабатывали денатурации буфера без промывают буфером, связывание GST-депутата АНК потеряно, в то время как неизвестные белки, содержащиеся в GST-МП и GST contining экстракты белка взаимодействует с АНК-strepII, что свидетельствует о важности от 3,1 до шаг процесса денатурации (дорожки 7 и 8).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Этот подход подходит для тестирования белок-белковых взаимодействий между комбинациями белков, когда по крайней мере один из которых белки хорошо растворим в связывающем буфере, и была успешно применена к другим сочетанием белков 17,18. IInteractions между белками, которые являются нерастворимыми в этих условиях не может быть проверено этим протоколом.
Кроме того, успешное рефолдинг ProIM имеет решающее значение для анализа. Промывка мембран в TBS после электропереноса является ключевым шагом, потому что остаточная SDS может нарушить денатурации / ренатурации процесса.
Наконец, во избежание неспецифического связывания, концентрация ProSol в связывании буфера не должен превышать 1 мкг / мл. ProSol который слишком сосредоточены могут проявлять не-специфического связывания с ProIM. Кроме того, для блокирования неспецифического связывания мембранных белков иммобилизованных ProSol, BSA в гибридизации буфер, используемый на шаге 4.2 можно заменить на обезжиренное молоко.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Работа в нашей лаборатории проводится при поддержке грантов от NIH, Министерство сельского хозяйства США Национального института сельского хозяйства и продовольствия, NSF, BARD, Министерство энергетики и Черноморского флота к VC
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Protein assay kit | Bio-Rad | 500-0001 | |
| Proteinase inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | S8820 | |
| Mini-PROTEAN system | Bio-Rad | 165-8000 | |
| Semi-dry western blotting SD electrotransfer system | Bio-Rad | 170-3940 | |
| Anti-rabbit IgG antibody conjugated with horse radish peroxidase | GenScript | A00098 | |
| Anti-GST rabbit polyclonal antibody | GenScript | A00097 | |
| Anti-strepII | GenScript | A00626 | |
| BioTrace, NT nitrocellulose transfer membrane | Pall Corporation | 27377-000 | |
| Immobilon western chemiluminescent HRP substrate | EMD Millipore | WBKL S0 050 |
References
- Hu, C. D., Chinenov, Y., Kerppola, T. K. Visualization of interactions among bZIP and Rel family proteins in living cells using bimolecular fluorescence complementation. Mol Cell. 9, 789-798 (2002).
- Citovsky, V. Subcellular localization of interacting proteins by bimolecular fluorescence complementation in planta. J Mol Biol. 362, 1120-1131 (2006).
- Kerppola, T. K. Design and implementation of bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assays for the visualization of protein interactions in living cells. Nat Protoc. 1, 1278-1286 (2006).
- Shyu, Y. J. Visualization of protein interactions in living Caenorhabditis elegans using bimolecular fluorescence complementation analysis. Nat Protoc. 3, 588-596 (2008).
- Citovsky, V., Gafni, Y., Tzfira, T. Localizing protein-protein interactions by bimolecular fluorescence complementation in planta. Methods. 45, 196-206 (2008).
- Ohad, N., Shichrur, K., Yalovsky, S. The analysis of protein-protein interactions in plants by bimolecular fluorescence complementation. Plant Physiol. 145, 1090-1099 (2007).
- Zamyatnin, A. A. Assessment of the integral membrane protein topology in living cells. Plant J. 46, 145-154 (2006).
- Citovsky, V., Knorr, D., Schuster, G., Zambryski, P. C. The P30 movement protein of tobacco mosaic virus is a single-strand nucleic acid binding protein. Cell. 60, 637-647 (1990).
- Heinlein, M., Epel, B. L., Padgett, H. S., Beachy, R. N. Interaction of tobamovirus movement proteins with the plant cytoskeleton. Science. 270, 1983-1985 (1995).
- Tomenius, K., Clapham, D., Meshi, T. Localization by immunogold cytochemistry of the virus coded 30 K protein in plasmodesmata of leaves infected with tobacco mosaic virus. Virology. 160, 363-371 (1987).
- Ding, B. Secondary plasmodesmata are specific sites of localization of the tobacco mosaic virus movement protein in transgenic tobacco plants. Plant Cell. 4, 915-928 (1992).
- Meshi, T. Function of the 30 kd protein of tobacco mosaic virus: involvement in cell-to-cell movement and dispensability for replication. EMBO J. 6, 2557-2563 (1987).
- Wolf, S., Deom, C. M., Beachy, R. N., Lucas, W. J. Movement protein of tobacco mosaic virus modifies plasmodesmatal size exclusion limit. Science. 246, 377-379 (1989).
- Waigmann, E., Lucas, W. J., Citovsky, V., Zambryski, P. C. Direct functional assay for tobacco mosaic virus cell-to-cell movement protein and identification of a domain involved in increasing plasmodesmal permeability. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 91, 1433-1437 (1994).
- Ueki, S., Spektor, R., Natale, D. M., Citovsky, V. ANK, a host cytoplasmic receptor for the Tobacco mosaic virus cell-to-cell movement protein, facilitates intercellular transport through plasmodesmata. PLoS Pathog. 6, e1001201-e1001201 (2010).
- Coligan, J. E., Dunn, B. M., Ploegh, H. L., Speicher, D. W., Wingfield, P. T. Taylor, G. , John Wiley & Sons, Inc. (2011).
- Tzfira, T., Vaidya, M., Citovsky, V. VIP1, an Arabidopsis protein that interacts with Agrobacterium VirE2, is involved in VirE2 nuclear import and Agrobacterium infectivity. EMBO J. 20, 3596-3607 (2001).
- Chen, M. H., Sheng, J., Hind, G., Handa, A., Citovsky, V. Interaction between the tobacco mosaic virus movement protein and host cell pectin methylesterases is required for viral cell-to-cell movement. EMBO J. 19, 913-920 (2000).
