Summary
시험 단백질 - 단백질 상호 작용이 단백질 기능의 해부를 위해 불가결이다. 여기서는 소개
Abstract
서로 다른 단백질 간의 상호 작용 확인은 분자 수준에서 자신의 생물 학적 기능을 조사 중요합니다. 이 단백질 바인딩을 평가하는 시험 관내 및 생체내 모두에서 여러 가지 방법,, 그리고 서로의 단점을 보완 적어도 두 가지 방법이 신뢰할 수있는 통찰력을 얻기 위해 실시한다.
생체내 분석에 bimolecular 형광 complementation (BiFC) 분석은 살아있는 세포 내에서 단백질 단백질 상호 작용을 감지 수 가장 인기있는 최소 침습적인 접근 방식을 나타냅니다뿐만 아니라 상호 작용하는 단백질의 1,2의 세포 지방화를 확인하십시오. 이 분석에서는, GFP 또는 그 변종의 비 형광 N - 및 C - 터미널 반쪽이 두 융합 단백질 인해 테스트 단백질 '상호 작용을 함께 가지고있을 때 테스트 단백질에 융합, 그리고, 형광 신호가 3-6 재구성합니다 . 그 신호가 epifluorescence이나 공촛점 현미경으로 쉽게 감지할 수 있기 때문에 BiFC은 살아있는 세포 3 단백질 단백질 상호 작용에 대한 연구를위한 세포 생물학 중에서 선택의 강력한 도구로 떠오르고있다. 이 분석은 그러나, 때로는 잘못된 긍정적인 결과를 생성할 수 있습니다. 예를 들어, 형광 신호가 오히려 그 때문에 특정 상호 작용 7, 작은 subcellular 구획의 포장 종료로 인해 서로 멀리로 7 나노미터을 배열이 GFP 조각에 의해 재구성 수 있습니다.
이러한 제한으로 인해, 라이브 셀 이미징 기술에서 얻은 결과는 단백질 상호 작용을 검출 다른 원칙에 따라 독립적인 방법으로 확인하여야한다. 공동 immunoprecipitation (CO - IP) 또는 글루타티온 transferase가 (GST) 풀다운 assays은 일반적으로 체외에서 단백질 - 단백질 상호 작용을 분석하는 데 사용되는 같은 대체 방법을 나타냅니다. 그러나 이러한 assays iIn 그러나, 테스트 단백질의 바인딩에 대한 반응 supportsused 버퍼에 쉽게 용해되어야합니다. 따라서 불용성 단백질을 포함한 구체적인 상호 작용은 이러한 방법에 의해 평가하실 수 없습니다.
여기, 우리는이 어려움을 circumvents 단백질 막 오버레이 바인딩 분석에 대한 프로토콜을 설명합니다. 단백질 중 하나가 막 매트릭스에 고정되기 때문에이 기법에서는, 가용성 및 불용성 단백질 간의 상호 작용을 안정적으로 테스트할 수 있습니다. 이 방법은 같은 BiFC 같은 생체내 실험에서와 함께, 용해와 불용성 단백질 간의 상호 작용을 충실하게 조사하고 특징에 대한 안정적인 접근을 제공합니다. 이 문서에서는 담배 모자이크 바이러스 (TMV) 사이 바이러스성 휴대 전화 전송 8-14 중 여러 기능을 미치는 운동 단백질 (MP), 그리고 최근에 확인된 식물 세포 interactor, 담배 ankyrin 반복 함유 단백질을 바인딩 (ANK ) 15,이 기술을 사용하여 증명합니다.
Protocol
1. 표현과 단백질의 추출
- Differentially 자신의 검출을위한 테스트하는 단백질에 태그를 추가하십시오. 더 큰 크기 (예를 들어, GST)의 태그와 멤브레인 (ProIM)에 고정되어야하고, unfused 태그가 고정화 대조군 (ProIMnc)로 사용할 수있는 단백질을 분류. 하나 크거나 작은 태그와 가용성 프로브 (ProSOL)로 사용되는 단백질을 분류. 적절한 대조군 수용성 단백질 (ProSOLnc)에 동일한 태그를 융합하고 감지 바인딩의 특이성을 확인하기 위해 상호 작용 분석에 포함됩니다.
- 태그 단백질을 표현할 수있는 단백질 표정 시스템, 즉, E.을 선택 대장균, baculovirus 등 단백질의 잠재적인 포스트 translational 수정 및 수율에 대한 요구 사항에 따라 다릅니다.
- proteinase 억제제 칵테일을 포함한 SDS - PAGE 로딩 버퍼 (20 % 글리세롤, 4% SDS, 20 MM 트리스 - HCL, pH6.8)을 사용하여 선택의 유기체 (단계 1.2)에서 ProIM 및 ProIM NC의 압축을 풉니다. 15 분 상온에서 세포 현탁액을 남겨, 2 - 메르 캅 토 에탄올 5 분 끓여의 0.5 %를 추가합니다.
- 표준 프로토콜 16을 사용하여 선택의 유기체 (단계 1.2)에서 ProSOL 및 ProSOL NC의 압축을 풉니다. 이러한 단백질은 단계 4.1에서 사용되는 (140 MM NaCl, 10 MM, 트리스 - HCL 산도 7.4, 2 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 2 MM DTT, 1 % BSA, 0.1 % 트윈 20) 바인딩 버퍼에 쉽게 용해한다.
- 이러한 바이오 래드 단백질 분석 키트와 같은 표준 방법을 사용하여 재조합 단백질의 농도를 결정합니다. 바이오 래드 단백질 분석 키트 등. 오히려 단백질을 정제보다 원유 추출물은, 분석을 위해 사용하는 경우, 쿠매시 브릴리언트 블루 R - 250과 SDS - polyacrylamide 젤 자국에 해당 밴드의 densitometry를 스캔하고 알려진를 사용하여이 추출에 대한 관심의 단백질의 농도를 추정 참고 BSA의 농도.
2. 멤브레인에 ProIM 및 ProIMnc의 고정
- 추출물의 두 세트의 표준 프로토콜 16에 따라 SDS - polyacrylamide 젤에 ProIM 및 ProIM NC 1 μg를 포함하는 각를 해결합니다.
- 전기 후, 전송 버퍼의 100 ML (60 MM 글리신, 10 MM 트리스, 0.0006 % SDS, 20 % MeOH)에에 전송에게 젤을 넣고 실온에서 20 분에 대한 부드러운 교반과 부화.
- 표준 프로토콜에 따라 16 nitrocellulose 막에 겔에 포함된 단백질을 Electrotransfer.
3. 멤브레인 - 바운드 단백질 다시 접는
- electrotransfer 후, 버퍼 15 ML에서 15 분 멤브레인을 품어 (30 MM 트리스 - HCL pH7.4, 0.05 % 트윈 20) 잔류 SDS를 제거하기 위해 부드러운 선동과 함께.
- 신중하게 배수 후, 변성 버퍼 (7 M 구아니딘 염산염, 2 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 50 MM DTT, 50 MM 트리스 - HCL pH는 8.3)의 25 ML에 멤브레인을 전송하기만하면됩니다. 부드러운 교반과 상온에서 2 시간 동안 부화. (참고 : 변성 버퍼에 incubated 때 nitrocellulose 막이 불투명됩니다.) 부드러운 교반과 상온에서 2 시간 동안 부화.
- 25 TBS의 ML (10 MM 트리스 - HCL, 150 MM NaCl, 산도 7.4) 5 분 부드러운 교반과 부화 막을 전송 (참고 :이 단계 동안 멤브레인는 원래 흰 색을 찾으).
- 바인딩 버퍼의 25 ML (단계 1.2 참조) 멤브레인를 전송 ° C 부드러운 교반과 함께 하루를 위해 4 알을 품다.
4. ProSOL하여 ProIM을 탐색
- 이 스트립, 모두 포함 ProIM 및 ProIM NC에 멤브레인 컷.
- 신선한 바인딩 버퍼의 10 ML에 ProSOL 또는 ProSOLnc 중 1-10 μg으로 준비를 diluting하여 ProSOL 및 ProSOLnc 하이브 리다이 제이션 솔루션을 확인하십시오. ProSOL 또는 ProSOLnc 하이브 리다이 제이션 솔루션으로 각 멤브레인를 전송하고 부드러운 교반과 함께 실온에서 1.5 H에 대해 숙고하다.
- 하이브 리다이 제이션 솔루션에서 세포막을 제거하고 15 분 TBS의 각 세 번 씻어.
5. immunoblotting하여 단백질 - 단백질 상호 작용을 떠올리
- 실온에서 1 H에 대한 TBST에 2.5 % 탈지 우유 (10 MM 트리스 - HCL, 140 MM NaCl, 0.05 % 트윈 20, 산도 7.4)와 멤브레인를 차단합니다. 제조 업체에서 권장하는 농도에서 TBST에 0.5 % 탈지 우유의 기본 항체 (안티 strepII polyclonal 토끼 항체)을 희석.
- 항체 솔루션에서 차단 막을 장소, 4 실온에서 1 H 또는 숙박에 대해 incubated ° C 부드러운 선동과 함께.
- 15 분 20 ML의 TBST에서 세포막을 린스, 두 번 부드러운 교반과 함께 실온에서 5 분.
- 제조 업체에서 권장하는 농도에서 TBST에 0.5 % 탈지 우유의 기다려봐 퍼옥시데이즈 (HRP)와 복합 보조 항체를 (안티 - 토끼 IgG 항체) 희석. 보조 항체의 세포막을 플레이스솔루션과 부드러운 교반과 함께 실온에서 1 H에 대해 숙고하다.
- 15 분 20 ML의 TBST에서 세포막을 린스, 두 번 부드러운 교반과 함께 실온에서 5 분. 최종 TBS에서 린스 후, HRP의 chemiluminescence 기판 (예를 들어, Millipore Immobilon 서부 chemiluminescent HRP 기판)를 사용하여 단백질 단백질 상호 작용을 시각화.
- 로 5.4 단계 5.1에서 설명하는 적절한 보조 항체 다음 ProIM에 융합 태그에 대한 기본 항체와 같은 세포막을 프로브. 시각화 ProIM 및 ProIMnc는 단백질 막 오버레이 분석 (단계 5.5)에서 얻은 밴드의 신원을 확인하는 단계 5.5에서 설명했다. 이 단계에서 얻은 신호 단계 5.5에서 얻은 잔여 신호보다 훨씬 강력하기 때문에 대부분의 경우, 조직들이 필요하지 않습니다.
6. 대표 결과 :
ANK - MP 상호 작용은 표피 세포 담배 (그림 1A)에 BiFC에 의해 관찰되었다. MP가 박테리아 또는 식물로 표현 매우 불용성 단백질이기 때문에 단백질 막 오버레이 분석은 체외 (그림 1B)에서이 상호 작용을 확인하기 위해 채택되었습니다. GST - MP (ProIM) 또는 unfused GST (ProIM NC) 1 μg을 포함하는 단백질 추출물은 nitrocellulose 막에 electrotransfer 다음 SDS - polyacrylamide 젤 전기 영동에 의해 해결되었다. 이러한 ProIMs가, 가용성 ANK - strepII (ProSOL), GST - MP하지만, unfused하지 GST와 탐지 구속력을 전시되었을 때 (그림 1B, 차선 1, 2, 차선 5, 6과 비교할 때). 또한, ProIMs의 동일한 세트가 추가로 ANK - MP 상호 작용의 특이성 (그림 1B를 보여주는 관련이없는 ProSOLnc 즉, strepII을 (NADH3 - strepII) 태그 Arabidopsis 세포질 NADH의 키나제, 아무 구속력이 관찰되지 아니와 읽혔어요 차선 3, 4).
그림 1. 생체내 및 시험 관내에서 TMV MP 담배 ANK의 구체적인 결합. 로 BiFC 감지 담배 표피 세포를 생활 (A) ANK - MP 상호 작용. MP와 ANK는 C - 터미널과 각각 YFP의 N - 말단 반쪽에 융합되면 강력한 YFP 신호들은 인코딩 유전자의 microbombardment 다음 담배 표피에 coexpressed 있었다 복원되었다. 이 BiFC 신호 plasmodesmata 15 진단하는 세포 주변에서 puncta에 축적. 체외에서 (B) ANK - MP 상호 작용으로 단백질 막 오버레이 분석에 의해 감지. GST - MP (ProIM) 또는 unfused GST (ProIMnc) 1 μg을 포함하는 단백질 추출물은 nitrocellulose 막에 electrotransfer 다음 15 % SDS - polyacrylamide 젤에 해결이되었습니다. GST - MPProIM과 GSTProIMnc는 ANK - strepII (ProSOL)의 0.5 μg / ML 함께 incubated했고, ANK 바인딩이에 복합 안티 - 토끼 IgG + M 이차 항체에 의해 다음, 안티 strepII 토끼 polyclonal 항체와 멤브레인을 탐색하여 검색되었습니다 HRP (레인스 1, 2). GST - MPProIM이나 GSTProIMnc 둘 다 strepII 태그 (ProSOLnc, 차선 3과 4)에 융합 관련이없는 단백질, Arabidopsis 세포질 NADH의 키나제와 교류. 이 분석에서 관찰 밴드의 정체성은 안티 GST 항체 (차선 5와 6)으로 막을 프로빙에 의해 확인되었다. GST - MP 및 GST contining 단백질 추출물에 포함된 미확인 단백질은 ANK - strepII와 반응하면서 멤브레인가 버퍼와 함께 세탁하지 않고 변성 버퍼로 처리되었을 때, ANK에 GST - MP의 바인딩은 중요성을 보여주는, 손실됩니다 단계 3.1 전 변성 과정 (차선 7 및 8).
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Discussion
이러한 접근 방식은 적어도 단백질의 바인딩을 버퍼에 쉽게 용해되는 중 하나가 성공적으로 단백질 17,18의 다른 조합에 적용했던 단백질의 조합 간의 단백질 - 단백질 상호 작용을 테스트에 적합합니다. 이러한 조건 하에서 모두 불용성의 단백질 사이의 iInteractions이 프로토콜 테스트하실 수 없습니다.
또한, ProIM의 성공적인 refolding은 분석을 위해 중요합니다. 잔여 SDS가 변성 / renaturation 과정에 악영향을 수 있기 때문에 electrotransfer 후 TBS에서 막을 Rinsing 것은 핵심 단계입니다.
마지막으로, 비 특정 바인딩을 피하기 위해, 바인딩 버퍼에 ProSOL의 농도가 1 μg / ML을 초과해서는 안됩니다. 너무 집중되어 있습니다 ProSOL는 ProIM가 아닌 특정 바인딩을 발생할 수 있습니다. 또한, 단계 4.2 동안 사용 하이브 리다이 제이션 버퍼 ProSOL, BSA에 막 고정화 단백질의 비 특정 바인딩을 차단하는 것은 탈지 우유로 대체 수 있습니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
저희 연구실의 작품은 VC에 NIH, 식품 및 농업의 국립 연구소 USDA, NSF, 바드,도 및 BSF로부터 기금을 지원합니다
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Protein assay kit | Bio-Rad | 500-0001 | |
| Proteinase inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | S8820 | |
| Mini-PROTEAN system | Bio-Rad | 165-8000 | |
| Semi-dry western blotting SD electrotransfer system | Bio-Rad | 170-3940 | |
| Anti-rabbit IgG antibody conjugated with horse radish peroxidase | GenScript | A00098 | |
| Anti-GST rabbit polyclonal antibody | GenScript | A00097 | |
| Anti-strepII | GenScript | A00626 | |
| BioTrace, NT nitrocellulose transfer membrane | Pall Corporation | 27377-000 | |
| Immobilon western chemiluminescent HRP substrate | EMD Millipore | WBKL S0 050 |
References
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