Essai de superposition des protéines membranaires: Un protocole pour tester l'interaction entre les protéines solubles et insolubles In vitro</em
Summary
Test interaction protéine-protéine est indispensable pour la dissection de la fonctionnalité des protéines. Ici, nous introduisons une<em> In vitro</em> Protéine-protéine test de liaison de sonder une membrane immobilisée protéine avec une protéine soluble. Ce test fournit une méthode fiable pour tester l'interaction entre une protéine insoluble et une protéine en solution.
Abstract
Validation des interactions entre différentes protéines est essentielle pour l'étude de leurs fonctions biologiques au niveau moléculaire. Il existe plusieurs méthodes, à la fois in vitro et in vivo, pour évaluer la liaison aux protéines, et au moins deux méthodes qui se complètent les lacunes de l'autre devrait être menée afin d'obtenir des données fiables.
Pour un essai in vivo, la complémentation bimoléculaires de fluorescence (BiFC) test représente l'approche la plus populaire et la moins invasive qui permet de détecter les interactions protéine-protéine dans les cellules vivantes, ainsi que d'identifier la localisation intracellulaire de l'interaction des protéines 1,2. Dans cet essai, non fluorescent moitiés N-et C-terminale de la GFP ou ses variantes sont fusionnés aux protéines testées, et quand les deux protéines de fusion sont réunies en raison des interactions des protéines testées », le signal fluorescent est reconstitué 3-6 . Parce que son signal est facilement détectable par microscopie à épifluorescence ou confocale, BiFC a émergé comme un puissant outil de choix parmi les biologistes cellulaires pour étudier à propos interactions protéine-protéine dans 3 cellules vivantes. Ce test, cependant, peuvent parfois produire des résultats faux positifs. Par exemple, le signal fluorescent peut être reconstituée par deux fragments GFP réglée autant que 7 nm de l'autre en raison de fermer l'emballage dans un petit compartiment subcellulaire, plutôt qu'en raison d'interactions spécifiques 7.
En raison de ces limitations, les résultats obtenus à partir des technologies d'imagerie cellulaire direct doit être confirmé par une approche indépendante basée sur un principe différent pour détecter les interactions entre protéines. Co-immunoprécipitation (Co-IP) ou le glutathion transférase (GST) déroulant tests représentent ces méthodes alternatives qui sont couramment utilisées pour analyser les interactions protéine-protéine in vitro. Toutefois, dDans ces essais, cependant, les protéines doivent être testés facilement soluble dans le tampon qui supportsused pour la réaction de liaison. Par conséquent, des interactions spécifiques impliquant une protéine insoluble ne peut être évaluée par ces techniques.
Ici, nous illustrons le protocole pour l'essai de superposition protéine membranaire contraignant, qui contourne cette difficulté. Dans cette technique, l'interaction entre les protéines solubles et insolubles peuvent être testés de manière fiable, car l'une des protéines est immobilisé sur une matrice de la membrane. Cette méthode, en combinaison avec les expériences in vivo, comme BiFC, offre une approche fiable pour étudier et caractériser les interactions entre les protéines fidèlement solubles et insolubles. Dans cet article, liant entre le virus de la mosaïque du tabac (TMV) protéine de mouvement (MP), qui exerce de multiples fonctions au cours virale de cellule à cellule de transport 8-14, et un interacteur usine récemment identifié cellulaires, tabac ankyrine répétées contenant des protéines (ANK ) 15, est démontrée en utilisant cette technique.
Protocol
Discussion
Cette approche est appropriée pour les tests interactions protéine-protéine entre les combinaisons des protéines, quand au moins un dont les protéines est facilement soluble dans le tampon de liaison, et a été appliquée avec succès à une autre combinaison de protéines 17,18. Le iInteractions entre les protéines qui sont insolubles dans ces deux conditions ne peuvent pas être testés par ce protocole.
Aussi, le repliement de la réussite ProIM est critique pour le dosa…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Le travail de notre laboratoire est soutenu par des subventions du NIH, Institut national de l'USDA pour l'alimentation et l'agriculture, de la NSF, BARD, le DOE, et BSF au VC
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalog number |
| Protein assay kit | Bio-Rad | 500-0001 |
| Proteinase inhibitor cocktail | SIGMA | S8820 |
| Mini-PROTEAN system | Bio-RAD | 165-8000 |
| Semi-dry western blotting SD electrotransfer system | Bio-RAD | 170-3940 |
| Anti-rabbit IgG antibody conjugated with horse radish peroxidase | GenScript | A00098 |
| Anti-GST rabbit polyclonal antibody | GenScript | A00097 |
| Anti-strepII | GenScript | A00626 |
| BioTrace, NT nitrocellulose transfer membrane | Pall Scientific | 27377-000 |
| Immobilon western chemiluminescent HRP substrate | Millipore | WBKL S0 050 |
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