I denna video visar vi utarbetandet av E18 kortikala Rat nervceller.
I denna video visar vi utarbetandet av E18 hjärnbarken råtta nervceller. E18 kortikala råtta neuron erhålls från E18 fostrets råtta cortex tidigare dissekeras och förberedd. E18 cortex är på dissektion, omedelbart skiljas i enskilda nervceller. Det är möjligt att lagra E18 hjärnbarken i Hibernate E buffert innehållande B27 vid 4 ° C i upp till en vecka innan dissociation utförs. Däremot kommer det att finnas en droppe i cellernas livskraft. Vanligtvis får vi vår E18 Cortex färsk. Det transporteras till labbet i iskallt Kalcium gratis Magnesium gratis dissektion buffert (CMFM). Vid ankomsten är Trypsin läggs till hjärnbarken till en slutlig koncentration av 0,125%. Cortex är sedan inkuberas vid 37 ° C i 8 minuter. DMEM innehållande 10% FBS läggs till hjärnbarken för att stoppa reaktionen. Cortex är sedan centrifugeras vid 2500 rpm i 2 minuter. Supernatanten tas bort och 2 ml av Neural Basal Media (NBM) innehållande 2% B27 (vol / vol) och 0,25% Glutamax (vol / vol) läggs till hjärnbarken som sedan resuspenderas genom att pipettera upp och ned. Därefter är cortex grov-med tidigare brand polerat glas pipetter, alla med en successiv mindre öppning. Efter finfördelande är cortex återigen centrifugeras vid 2500 rpm i 2 minuter. Supernatanten tas sedan bort och hjärnbarken pellets resuspenderas med 2 ml NBM innehåller B27 och Glutamax. Cellsuspensionen leds sedan genom ett 40 um nylon cell sil. Nästa cellerna räknas. Nervceller är nu redo för påfyllning av neuron mikroflödessystem enhet.
Cell täthet kan varieras beroende på tillämpning. Men sådd primära nervceller vid för låg med en densitet av typiskt leder till celldöd. Beroende på inkubatorn och luftfuktighet, kan media behöva ändras i enheter var 2 till 3 dagar. När du byter media är det viktigt när du har tagit materialet från reservoarer, att aldrig ta bort material från de största kanalerna. Vidare är det bra att placera nya medier i topp brunnar och tillåter lite frisk media att flödet genom enheten och i de viktigaste kanalerna innan du fyller upp alla reservoarer.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
NBM | medium | Invitrogen | 21103-049 | Neural Basal Media is obtained by Invitrogen under their Gibco line of cell culture reagents. |
E18 rat embryos | Animal | Obtained from pregnant Sprague Dawley Rats. The pregnant rat is sacrificed and the E18 fetal rat pups dissected to obtain the E18 fetal rat cortex. | ||
CMFM dissection buffer HBSS | buffer | ice-cold Calcium-free Magnesium-free dissection buffer HBSS based. | ||
15 ml Tube | Tool | BD Falcon | Falcon No. 352097 | Available through Fisher Scientific catalog number 14-959-70C |
0.25% Trypsin-EDTA | Reagent | Invitrogen | ||
37˚C water bath | ||||
Pasteur pipets | Fisher Scientific | glass | ||
DMEM | medium | Invitrogen | ||
FBS | Reagent | Invitrogen | serum, used at 10% in DMEM | |
centrifuge | set at 2500 rpm | |||
Trypan Blue | Invitrogen | for counting live/dead cells | ||
BD Falcon Cell Strainer 40 um | Tool | BD Falcon | Falcon cat# 352340 | Available through Fisher Scientific. Fisher catalog# 08-771-1 |
B27 | Reagent | Invitrogen | 17504-044 | B27 is a proprietary supplement available through Invitrogen under their Gibco line of cell culture reagents. |
Glutamax | Reagent | Invitrogen | 35050-061 | Glutamax is available through Invitrogen under their Gibco line of celll culture reagents. |