マイクロ流体デバイスでコンパートメントのためのE18脳ラットのニューロンの準備

Summary

このビデオでは、E18皮質ラットニューロンの準備を示しています。

Abstract

このビデオでは、我々はE18皮質ラットの神経細胞の準備を示しています。 E18皮質ラットの神経細胞は、以前は切開し準備E18胎児ラットの大脳皮質から得られる。 E18皮質は、解剖時に、個々のニューロンにすぐに解離している。それは、解離が実行される前までの週までは4でB27が含まれているHibernateのEバッファ° CでE18皮質を格納することが可能です。しかし、細胞の生存率の低下が生じます。一般的に我々はE18のCortex新鮮を得る。それは氷冷カルシウムフリーマグネシウムフリー解剖バッファー（CMFM）に研究室に運ばれる。到着時に、トリプシンは0.125％の最終濃度に皮質に追加されます。皮質は、その後8分間37℃でインキュベートする。 10％FBSを含むDMEMして反応を停止する皮質に追加されます。皮質は、その後2分間2500rpmで遠心分離される。上清を除去し、2％B27（vol / vol）のおよび0.25％を含むニューラル基礎培地（NBM）を2mlさグルタミン（体積/体積）はその後、ピペッティングにより再懸濁している皮質に追加されます。次に、皮質は、以前に研磨したガラスピペット、連続する小さな開口部をそれぞれ発射で摩砕しています。摩砕した後、皮質は再び2分間2500rpmで遠心分離される。上清を除去し、皮質ペレットB27とグルタミンを含むNBM 2mlで再懸濁されている。細胞懸濁液を40ミクロ​​ンのナイロンセルストレーナーを通過させる。次に、細胞がカウントされます。ニューロンはニューロンマイクロ流体デバイスにロードするのに準備が整いました。

Protocol

コンパートメントのためのE18胎児ラット皮質ニューロンの準備

出開始する前に、それは37℃に必要なすべての培地および試薬を温めることが重要です。

70％エタノールでダウン拭いて、ボンネットに配置されている細胞（例えば、ゴムの球根、チューブラック、メディアのボトルなど）、およびその調製のために使用されるすべてのものを殺菌することも重要です。

1. 1ミリリットルの氷冷カルシウムフリーマグネシウムフリー解剖のバッファを含む15 mlのチューブに場所E18胎児ラット皮質の2つ（一つの脳、以前に解剖して）。
2. 2mlと0.125％、最終的なトリプシン濃度に最終的なボリュームをもたらし、解剖バッファ内の皮質に0.25％トリプシン- EDTA 1 mlの。
3. 8分間37℃の水浴中に15 mlのチューブを置きます。
4. この時間の間に、火災研磨3ガラスパスツールピペットは、無菌性を維持するために生物学的安全キャビネット内で、連続して小さな開口部を形成する。
5. 皮質の8分間のインキュベーションの後、DMEM 10 mlのトリプシンの反応を阻止するために皮質に10％FBSを含む追加。
6. 2分間2500rpmで皮質とDMEM/10％FBSを含む15 mlチューブを遠心します。
7. バイオセーフティキャビネットでは、接続された真空吸引によるガラスパスツールピペットを用いて皮質から上清を取り除く。妨害またはペレットが剥がれないよう注意してください。
8. 皮質ペレットと静かにピペット上下にNMBの1 mlの。それは空気の気泡が酸化によって細胞を損傷することができるように、上下にペッティングしながら、気泡を作らないように非常に重要です。
9. 気泡を導入しないように注意して、再度、5回を最後に滅菌ゴム球を取り付け、最大ペッティングやダウンによって皮質をひいて粉にするために広い開口部とファイアーポリッシュパスツールピペットを使用してください。減少した開口部のサイズと、それぞれ、他の2つのガラスピペットでこのプロセスを続けます。
10. 粉砕した後、2分間、2500rpmで再び細胞を遠心分離。
11. 遠心分離後、再び上清を除去し、NBMの2mlに細胞ペレットを再懸濁します。
12. 45 UMセルストレイナーを通して再懸濁した細胞溶液をフィルタ。
13. 、トリパンブルーで細胞を染色カウント、およびデバイスにロードされます。我々は通常、デバイスごとに細胞の20 ulを読み込みます。

注 ：細胞の最終濃度が250万細胞/ mlと800万細胞/ mlの間に典型的である

細胞のロード

細胞がカウントされた後、それはデバイス内のセルをロードする時間です。

1. 無菌性を維持するために生物学的安全キャビネットにNBMを含む事前に準備したデバイスをもたらす。
2. 真空吸引により井戸から余分なメディアを取り出します。しかし、メディアのすべてを削除しないように注意してください - メインチ​​ャネル内の一部のメディアが存在している必要があります。
3. デバイスの上部左側のリザーバー（必要に応じて図を参照）への細胞の20 ulを適用します。細胞はデバイスに流れ込むとPLL処理面に付着する。
4. ロード後に、細胞がアタッチできるように10分間インキュベーターに戻し、細胞を含むデバイスに置く。
5. 10分後、戻ってインキュベーター内のメディアと場所のデバイスとの貯水池を埋める。

Discussion

細胞密度は、用途に応じて変化させることができる。しかし、密度の低すぎる時に一次ニューロンのシードを設定すると、通常は細胞死につながる。インキュベーターと湿度のレベルに応じて、メディアがデバイスに2〜3日おきに変更する必要がある場合があります。メディアを変更する場合、それはメインチャンネルからメディアを削除しないように、貯水池からメディアを削除した後に重要です。さらに、それはトップの井戸で、新鮮な培地を配置し、いくつかの新鮮なメディアがデバイスを通過し、すべての貯水池を満杯にする前に、メインチャンネルに流れるようにすることをお勧めします。

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
NBM	medium	Invitrogen	21103-049	Neural Basal Media is obtained by Invitrogen under their Gibco line of cell culture reagents.
E18 rat embryos	Animal			Obtained from pregnant Sprague Dawley Rats. The pregnant rat is sacrificed and the E18 fetal rat pups dissected to obtain the E18 fetal rat cortex.
CMFM dissection buffer HBSS	buffer			ice-cold Calcium-free Magnesium-free dissection buffer HBSS based.
15 ml Tube	Tool	BD Biosciences	Falcon No. 352097	Available through Fisher Scientific catalog number 14-959-70C
0.25% Trypsin-EDTA	Reagent	Invitrogen
37˚C water bath
Pasteur pipets		Fisher Scientific		glass
DMEM	medium	Invitrogen
FBS	Reagent	Invitrogen		serum, used at 10% in DMEM
centrifuge				set at 2500 rpm
Trypan Blue		Invitrogen		for counting live/dead cells
BD Falcon Cell Strainer 40 um	Tool	BD Biosciences	Falcon cat# 352340	Available through Fisher Scientific. Fisher catalog# 08-771-1
B27	Reagent	Invitrogen	17504-044	B27 is a proprietary supplement available through Invitrogen under their Gibco line of cell culture reagents.
Glutamax	Reagent	Invitrogen	35050-061	Glutamax is available through Invitrogen under their Gibco line of celll culture reagents.