इस वीडियो में हम E18 cortical चूहा न्यूरॉन्स की तैयारी को प्रदर्शित करता है.
इस वीडियो में, हम E18 cortical चूहा न्यूरॉन्स की तैयारी को प्रदर्शित करता है. E18 cortical चूहा न्यूरॉन्स E18 भ्रूण चूहे पहले dissected और तैयार प्रांतस्था से प्राप्त कर रहे हैं. E18 प्रांतस्था विच्छेदन पर उपलब्ध है, तुरंत व्यक्तिगत न्यूरॉन्स में अलग है. यह संभव है सीतनिद्रा में होना ई 4 में B27 युक्त बफर ° सी में एक सप्ताह तक के लिए E18 प्रांतस्था पहले हदबंदी प्रदर्शन है दुकान. हालांकि, वहाँ सेल व्यवहार्यता में एक बूंद हो जाएगा. आमतौर पर हम हमारे E18 प्रांतस्था ताजा प्राप्त करते हैं. यह बर्फ के ठंडे कैल्शियम मुक्त मैगनीशियम मुक्त विच्छेदन बफर (CMFM) में प्रयोगशाला में ले जाया जाता है. आगमन पर, trypsin 0.125% की एक अंतिम एकाग्रता के लिए प्रांतस्था के लिए जोड़ा जाता है. प्रांतस्था तो 8 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर incubated. 10% FBS युक्त DMEM प्रांतस्था करने के लिए जोड़ा जाता है की प्रतिक्रिया को रोकने के. प्रांतस्था तो 2 मिनट के लिए 2500 rpm पर centrifuged है. सतह पर तैरनेवाला हटा दिया है और तंत्रिका बेसल मीडिया के 2 मिलीलीटर (NBM) 2 B27% (/ खंड खंड) और 0.25% Glutamax (खंड खंड /) प्रांतस्था है जो है तो फिर से ऊपर और नीचे pipetting द्वारा निलंबित करने के लिए जोड़ा जाता है युक्त. अगले, प्रांतस्था पहले आग पॉलिश कांच लगातार छोटे खोलने के साथ, pipettes प्रत्येक के साथ है triturated है. Triturating के बाद, प्रांतस्था एक बार फिर 2 मिनट के लिए 2500 rpm पर centrifuged है. सतह पर तैरनेवाला और फिर हटा दिया जाता है प्रांतस्था गोली NBM के 2 मिलीलीटर B27 और Glutamax युक्त के साथ फिर से निलंबित कर दिया. सेल निलंबन तो एक 40 उम नायलॉन सेल झरनी के माध्यम से पारित कर दिया है. अगला कोशिकाओं गिना रहे हैं. न्यूरॉन्स अब कर रहे हैं न्यूरॉन microfluidic डिवाइस में लोड करने के लिए तैयार है.
सेल घनत्व आवेदन के आधार पर अलग किया जा सकता है. हालांकि, भी कम घनत्व के प्राथमिक न्यूरॉन्स बोने आम तौर पर कोशिका मृत्यु की ओर जाता है है. इनक्यूबेटर और नमी के स्तर पर निर्भर करता है, मीडिया के लिए हर 2 से 3 दिनों के उपकरणों में परिवर्तित किया जा आवश्यकता हो सकती है. जब बदलते मीडिया, जलाशयों से मीडिया को हटाने के बाद यह महत्वपूर्ण है, मुख्य चैनल से हटाने के लिए कभी नहीं मीडिया. इसके अलावा, यह अच्छा अभ्यास है शीर्ष कुओं में ताजा मीडिया जगह और कुछ ताजा मीडिया डिवाइस के माध्यम से और सभी जलाशयों को भरने से पहले मुख्य चैनल में प्रवाह करने के लिए अनुमति देते हैं.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
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NBM | medium | Invitrogen | 21103-049 | Neural Basal Media is obtained by Invitrogen under their Gibco line of cell culture reagents. |
E18 rat embryos | Animal | Obtained from pregnant Sprague Dawley Rats. The pregnant rat is sacrificed and the E18 fetal rat pups dissected to obtain the E18 fetal rat cortex. | ||
CMFM dissection buffer HBSS | buffer | ice-cold Calcium-free Magnesium-free dissection buffer HBSS based. | ||
15 ml Tube | Tool | BD Falcon | Falcon No. 352097 | Available through Fisher Scientific catalog number 14-959-70C |
0.25% Trypsin-EDTA | Reagent | Invitrogen | ||
37˚C water bath | ||||
Pasteur pipets | Fisher Scientific | glass | ||
DMEM | medium | Invitrogen | ||
FBS | Reagent | Invitrogen | serum, used at 10% in DMEM | |
centrifuge | set at 2500 rpm | |||
Trypan Blue | Invitrogen | for counting live/dead cells | ||
BD Falcon Cell Strainer 40 um | Tool | BD Falcon | Falcon cat# 352340 | Available through Fisher Scientific. Fisher catalog# 08-771-1 |
B27 | Reagent | Invitrogen | 17504-044 | B27 is a proprietary supplement available through Invitrogen under their Gibco line of cell culture reagents. |
Glutamax | Reagent | Invitrogen | 35050-061 | Glutamax is available through Invitrogen under their Gibco line of celll culture reagents. |