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स्टेरॉयड रिसेप्टर की बायोकेमिकल पुनर्गठन • HSP90 प्रोटीन ligand के परिसर और पुनर्सक्रियण बंधन

Published: September 21, 2011 doi: 10.3791/3059
Automatic Translation
1, 2, 3
1College of Nursing, Interdisciplinary Life Sciences Research Laboratory, Seattle University, 2College of Science and Engineering, Interdisciplinary Life Sciences Research Laboratory, Seattle University, 3School of Medicine, University of Washington

Summary

एक

Protocol

1. सेल कार्यात्मक जीआर युक्त cytosol की तैयारी

  1. तकनीकी नोट: सभी बफ़र्स प्रशीतित हो और centrifugations और ऊष्मायन सहित प्रोटोकॉल, के प्रत्येक चरण बर्फ पर या 4 में प्रदर्शन किया जाना चाहिए चाहिए डिग्री सेल्सियस, जब तक अन्यथा नोट. कम तापमान जीआर और प्रोटीन परिसरों की गिरावट को रोकने के लिए आवश्यक है.
  2. एक प्रशीतित अपकेंद्रित्र का प्रयोग, कक्षों की एक ~ 1-5 मिलीलीटर गोली है कि कार्यात्मक जीआर के एक उच्च एकाग्रता व्यक्त प्राप्त करते हैं. सेल जीआर में अमीर सूत्रों के उदाहरण माउस fibroblast कोशिकाओं L929, जो अंतर्जात जीआर के एक उच्च एकाग्रता व्यक्त और Sf9 कोशिकाओं है कि पुनः संयोजक जीआर baculovirus (जैसे p2Bac एमजीआर baculovirus 12) के साथ संक्रमित किया गया है शामिल हैं . पैक कोशिकाओं के लगभग 15-20 मिलीलीटर Sf9 baculovirus सेल संस्कृति के प्रति लीटर प्राप्त की है. कक्ष से पहले कटाई करने के लिए तेजी से बढ़ चाहिए. +५००० × छ पर 5 मिनट के लिए सेल निलंबन अपकेंद्रित्र.
  3. हैंक्स buffered खारा समाधान के 15 मिलीलीटर के साथ सेल गोली तीन बार धोएं. Washes के बीच, धीरे से 5 मिनट के लिए गोली, ५,००० पर centrifuging द्वारा पीछा × छ resuspend. पिछले धोने के बाद, पूरी तरह से सतह पर तैरनेवाला हटायें.
  4. एक homogenization हेम बफर (10 मिमी HEPES, 1 मिमी EDTA, 20 मिमी सोडियम molybdate, 7.4 पीएच), 1 मिमी phenylmethylsulfonyl फ्लोराइड (PMSF), और 3 पूर्ण मिनी protease अवरोध करनेवाला के जमीन गोलियाँ युक्त बफर के 7.5 मिलीलीटर तैयार. PMSF और बाद के चरणों के दौरान होने वाली से पूरा मिनी गोलियाँ proteolysis को रोकने के. पूरा मिनी गोलियां आसानी से एक मोर्टार और मूसल के साथ एक ठीक पाउडर के लिए जमीन किया जा सकता है. सेल गोली homogenization बफर के 1.5 मात्रा में जोड़ें.
  5. टूटना Dounce (50 स्ट्रोक) homogenization या फ्रीज / पिघलना (3 चक्र) तकनीक द्वारा कोशिकाओं. Dounce homogenization में सुधार अंतर्जात जीआर • HSP90 प्रोटीन परिसरों को बनाए रखने और तेजी से पूरा हो सकता है. फ्रीज पिघलना / शोधकर्ता इस कदम पर प्रोटोकॉल को निरस्त करने और एक बाद में समय पर जारी करने का अवसर प्रदान करता है. Dounce homogenization एक बर्फ बाल्टी में homogenizer प्रोटीन गिरावट को रोकने के साथ किया जाना चाहिए. फ्रीज पिघलना / अपकेंद्रित्र ट्यूब गोली - homogenization बफर मिश्रण तरल नाइट्रोजन, सूखी बर्फ, या -20 के साथ सेल युक्त ठंड से पूरा किया जा सकता डिग्री सेल्सियस ऊष्मायन, एक 30 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में विगलन द्वारा पीछा किया.
  6. उठी सेल बात कण से ultracentrifugation के द्वारा cytosol जीआर युक्त अलग. टिकाऊ ultracentrifuge ट्यूबों, जोड़े में जन द्वारा संतुलन ट्यूबों, और अपकेंद्रित्र 100.000 × छ पर 30 मिनट के लिए homogenate स्थानांतरण.
  7. लंबी अवधि के भंडारण के लिए 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूबों में 500 μl aliquots में (सतह पर तैरनेवाला) cytosol और दुकान -20 डिग्री सेल्सियस निकालें. अधिकतम कार्यात्मक जीआर गतिविधि को बनाए रखने के लिए, एक मेथनॉल सूखी बर्फ के भंडारण के लिए पहले स्नान में 30 सेकंड के लिए तरल नाइट्रोजन या सेते में aliquots फ्लैश फ्रीज. ठंडा अभिकर्मक के साथ सीधे त्वचा के संपर्क से बचने के लिए सावधानी रखना.

2. सेल cytosol से जीआर के Immunoadsorption

  1. तकनीकी नोट: चित्रा 2 इस प्रोटोकॉल के 2-5 कदम की एक योजनाबद्ध सिंहावलोकन प्रदान करता है.
  2. एक immunoadsorption मिश्रण युक्त एक मोनोक्लोनल immunoglobulin जी (आईजीजी) के चरण 1 में तैयार रिसेप्टर immunoadsorb जीआर के खिलाफ उठाया एंटीबॉडी तैयार करें. एक 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में, thawed के 100 μl जीआर युक्त cytosol, 200 μl TEGM बफर (8 मिमी TES, 4 मिमी EDTA, 50 मिमी NaCl, 20 मिमी molybdate, 10% (v / v) ग्लिसरॉल, 7.6 पीएच) गठबंधन , एक 20% प्रोटीन की 100 μl (पीए) एक Sepharose विरोधी जीआर मोनोक्लोनल आईजीजी एंटीबॉडी के (v / v, TEGM बफर में तैयार घोल), और 5 μg (BuGR2 उदाहरण के लिए). Molybdate TEGM बफर में शामिल है क्रम में मदद करने के लिए जीआर HSP90 heterocomplex, जो उपयोगी हो सकता है क्रम में परख अंतर्जात heterocomplex स्टेरॉयड बाध्यकारी गतिविधि 13 से स्थिर है.
    1. एंटी - जीआर एंटीबॉडी वाणिज्यिक शुद्ध प्रोटीन के रूप में उपलब्ध है. वैकल्पिक रूप से, यह विरोधी जीआर immunoadsorption मिश्रण आईजीजी युक्त जलोदर के 10 μl जोड़ने के द्वारा प्राप्त किया जा सकता है. जलोदर विरोधी जीआर हाइब्रिडोमा कोशिकाओं (जैसे FiGR हाइब्रिडोमा 14 कोशिकाओं) के साथ चूहों अंतःक्षिप्त द्वारा निर्मित है, और लगभग एंटीबॉडी जलोदर से प्राप्त की और इन प्रयोगों में इस्तेमाल एकाग्रता 0.5 μg / μl किया गया था, के रूप में ब्रैडफोर्ड परख द्वारा मापा.
    2. एक नकारात्मक नियंत्रण जीआर युक्त cytosol, बफर TEGM, और पीए (जैसा ऊपर वर्णित है), और एक आईजीजी के 5 μg है कि जीआर की पहचान नहीं करता है, HSP90, या अन्य आणविक निगरानी प्रोटीन (एक "nonimmune" के रूप में संदर्भित का उपयोग नमूना तैयार एंटीबॉडी).
    3. अपेक्षाकृत बड़े पीए मनका आकार के कारण, एक कट P-200 pipet टिप का उपयोग करें जब 20% घोल से पीए नमूना ट्यूब को स्थानांतरित. कट pipet युक्तियाँ व्यावसायिक रूप से उपलब्ध पी-200 सुझावों के अंत के 2-3 मिमी बंद टुकड़ा करने की क्रिया द्वारा तैयार कर रहे हैं, इस प्रकार pipet टिप एपर्चर बढ़ती.
  3. एक ऊर्ध्वाधर घूर्णन और निरंतर रोटेशन के साथ 2 घंटे की एक न्यूनतम के लिए पहिया सेते पर प्लेस के नमूने. नमूने सकता हैगतिविधि के नुकसान के बिना करने के लिए 8 घंटे के लिए incubated.
  4. Immunoadsorption ऊष्मायन के समापन पर, एंटीबॉडी पीए गोली immunopellet ("") से centrifugation द्वारा अनबाउंड प्रोटीन को हटा. Immunopellets से supernatants centrifugation का उपयोग कर एक प्रशीतित १०००० पर 1 मिनट के लिए क्रमादेशित अपकेंद्रित्र × छ द्वारा अलग और फिर एक मिलीलीटर TEGM बफर और भंवर के साथ दो बार धोने. और washes के बीच centrifugation के बाद, सतह पर तैरनेवाला त्यागने के लिए गोली परेशान नहीं सतर्क किया जा रहा है.
    1. दूसरे धोने के समापन पर सभी सतह पर तैरनेवाला निकालें. आदेश में यह सुनिश्चित करने के लिए गोली से कोई भी अनजाने से aspirated है, अंतिम सतह पर तैरनेवाला आकांक्षा के लिए एक crimped पी 200 pipet टिप का उपयोग करें. Crimped pipet सुझावों व्यावसायिक रूप से उपलब्ध P-200 संदंश का उपयोग सुझावों सपाट द्वारा तैयार कर रहे हैं.

3. जीआर immunopellet से अंतर्जात HSP90 की हदबंदी ("नमक विपठ्ठन")

  1. धोया चरण 2 में तैयार immunopellet करने के लिए, 355 μl तेग बफर (सोडियम molybdate बिना TEGM बफर) और 5 एम NaCl (अंतिम NaCl एकाग्रता = 0.5 एम) के 45 μl जोड़ें.
  2. एक ऊर्ध्वाधर घूर्णन और निरंतर रोटेशन के साथ 1.5 घंटे के लिए पहिया सेते पर प्लेस के नमूने. नमूने 2 घंटे के लिए incubated किया जा सकता है, तथापि, अब incubations कम प्रोटीन वसूली और कम कार्यात्मक गतिविधि करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं.
  3. Immunopellet से centrifugation द्वारा अनबाउंड प्रोटीन निकालें. 10,000 × जी पर 1 मिनट के लिए नमूने स्पिन 1 मिलीलीटर तेग बफर और 10 मिमी HEPES बफर, पीएच 7.4 की 1 मिलीलीटर के साथ एक बार के साथ एक बार धोएं.
  4. दूसरे धोने के समापन पर सभी निकालें सतह पर तैरनेवाला, immunopellet परेशान नहीं सावधान किया जा रहा, एक crimped पी 200 pipet टिप का उपयोग कर.

4. जीआर के पुनर्गठन • HSP90 आणविक संरक्षिकाओं, cofactors, और एटीपी का उपयोग heterocomplex

  1. तकनीकी नोट: एक प्रयोगात्मक शर्तों के असंख्य पुनर्गठन नीचे तैयार मिश्रण में अतिरिक्त प्रोटीन, cofactors, activators, या ब्याज की inhibitors सहित द्वारा परीक्षण किया जा सकता है. पुनर्गठन मिश्रण की कुल मात्रा <120 μl होना चाहिए.
  2. प्रत्येक नमक छीन immunopellet चरण 3 में तैयार, एक पुनर्गठन एक आणविक निगरानी स्रोत और एक एटीपी पैदा करने प्रणाली (10 मिमी HEPES, 50 मिमी एटीपी, 250 मिमी creatine फॉस्फेट, 20 मिमी मैग्नीशियम एसीटेट के 5 μl के 50 μl युक्त मिश्रण जोड़ने 100 यू / मिलीलीटर creatine phosphokinase, 7.4 पीएच).
    1. पुनर्गठन प्रतिक्रियाओं 50 μl HKD (10 मिमी HEPES, 100 मिमी KCl, 5 मिमी dithiothreitol (डीटीटी), 7.4 पीएच) बफर और एटीपी उत्पादन प्रणाली की एक अतिरिक्त 5 μl पुनर्गठन मिश्रण के साथ सप्लीमेंट द्वारा बढ़ाया जा सकता है है. यह कदम अगर पर्याप्त पुनर्गठन और स्टेरॉयड बाध्यकारी मनाया जाता है हटाया जा सकता है. KCl HSP70 ATPase गतिविधि बढ़ जाती है और डीटीटी - सिस्टीन 9 ऑक्सीकरण से प्रोटीन युक्त बचाता है.
    2. एक सिफारिश की आणविक निगरानी स्रोत व्यावसायिक रूप से उपलब्ध खरगोश reticulocyte lysate है. व्यक्तिगत आणविक संरक्षिकाओं reticulocyte lysate से शुद्ध या recombinantly व्यक्त (जैसे 15 μg HSP90, 15 HSP70 μg, 0.6 μg हॉप, 6 μg p23, और 0.125 HKD बफर में hsp40 μg) भी इस्तेमाल किया जा सकता है.
  3. वास्तव में 20 मिनट के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में नमूनों को सेते हैं. झाड़ ट्यूबों के क्रम में हर 1-2 मिनट धीरे गोली को परेशान करने और पुनर्गठन के समाधान के मिश्रण.
  4. 1 मिनट के लिए 1 मिलीलीटर TEGM बफर, भंवर, और अपकेंद्रित्र १०,००० × छ जोड़ें. सतह पर तैरनेवाला निकालें और त्यागने को गोली परेशान नहीं सावधान किया जा रहा है. तीन washes के एक कुल के लिए दोहराएँ. पूरी तरह से अंतिम एक crimped पी 200 pipet टिप का उपयोग कर धोने के समापन पर सभी सतह पर तैरनेवाला हटा दें.

5. पुनर्गठन प्रोटीन परिसरों और ligand बाध्यकारी गतिविधि का विश्लेषण

  1. पुनर्गठन immunopellet में प्रोटीन पारंपरिक denaturing polyacrylamide जेल वैद्युतकणसंचलन (एसडीएस पृष्ठ), microfluidic वैद्युतकणसंचलन (जैसे Experion जैव रेड), और पश्चिमी सोख्ता (3 छवि) द्वारा पहचाना जा सकता है . तकनीकी नोट: बहुत बढ़िया 15 एसडीएस PAGE और 16 सोख्ता पश्चिमी वर्णन प्रोटोकॉल वर्तमान में उपलब्ध हैं, अन्य जांचकर्ताओं के सौजन्य.
    1. एसडीएस पृष्ठ नमूना β-mercaptoethanol और भंवर युक्त बफर के 50 μl जोड़ें. विशिष्ट नमूना बफर व्यंजनों बदलती हैं. एक वैद्युतकणसंचलन के लिए नियोजित किया जा प्रणाली के निर्माता की सिफारिश के आधार पर चयन करें.
    2. एक उबलते पानी स्नान या 100 डिग्री सेल्सियस इलेक्ट्रॉनिक गर्मी ब्लॉक में 5 मिनट के लिए सेते हैं.
    3. १०,००० × छ में 1 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र. immunoadsorbing एंटीबॉडी, जीआर, प्रोटीन और जीआर के लिए complexed एक दूसरे से अलग हो सकता है और नमूना बफर सतह पर तैरनेवाला में जारी किया जाएगा.
    4. सतह पर तैरनेवाला एक ताजा microcentrifuge एक crimped P-200 pipet टिप टिप का उपयोग ट्यूब के लिए स्थानांतरण. गोली त्यागें. नमूना अब व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एसडीएस PAGE या microfluidic वैद्युतकणसंचलन प्रणाली का उपयोग विश्लेषण के लिए तैयार है. या तो तकनीक च पूरा करेंनिर्माता के निर्देशों ollowing.
    5. पश्चिमी धब्बा विश्लेषण निम्नलिखित एसडीएस पृष्ठ immunoadsorbed जीआर और आणविक पुनर्गठन ऊष्मायन निम्नलिखित जीआर complexed संरक्षिकाओं की निश्चित पहचान के लिए अनुमति देता है. मोनोक्लोनल प्राथमिक एंटीबॉडी (BuGR2) जीआर, HSP90 (AC88) के खिलाफ उठाया, HSP70 (N27F3 4) और सह निगरानी प्रोटीन का उपयोग करने के लिए जीआर • HSP90 प्रोटीन परिसर के प्रमुख घटक का पता लगाने के लिए.
  2. जीआर • HSP90 प्रोटीन जटिल स्टेरॉयड बाध्यकारी गतिविधि [3] एच स्टेरॉयड (4 छवि) का उपयोग परख करने की क्रिया द्वारा पहचाना जा सकता है है के पुनर्गठन के बाद नमक छीन जीआर के कार्यात्मक सक्रियण. प्रोटोकॉल के शेष के लिए, सुरक्षित tritiated नमूने और अपशिष्ट से निपटने के लिए आवश्यक सावधानियों का पालन करें.
    1. पुनर्गठन immunopellet करने के लिए, 47.5 μl हेम बफर और 2 सुक्ष्ममापी के 2.5 μl [एच 3] dexamethasone (अंतिम स्टेरॉयड एकाग्रता = 100 एनएम) जोड़ने.
    2. धीरे मिश्रण गोली microcentrifuge ट्यूब की दीवार के लिए विस्थापित नमूने की राशि को कम करने के लिए सावधान किया जा रहा है.
    3. बर्फ पर रातोंरात सेते हैं. यह करने के लिए बारी बारी से या इस ऊष्मायन के दौरान नमूना ट्यूबों मिश्रण आवश्यक नहीं है.
    4. 1 मिलीलीटर TEGM बफर, धीरे मिश्रण, और 10,000 पर अपकेंद्रित्र × 1 मिनट के लिए छ जोड़ें. सतह पर तैरनेवाला त्यागें, प्रति जागरूक किया जा रहा यह अनबाउंड [एच 3] स्टेरॉयड शामिल हैं. TEGM बफर के साथ 3 washes के एक कुल के लिए दोहराएँ.
    5. पूरी तरह से अंतिम एक crimped पी 200 pipet टिप का उपयोग कर धोने के समापन पर सभी सतह पर तैरनेवाला हटा दें. गोली जीआर, HSP90 और अन्य आणविक जीआर करने के लिए complexed संरक्षिकाओं, और [3] एच स्टेरॉयड विशेष रूप से रिसेप्टर के लिए बाध्य होता है. Nonspecific बाध्यकारी रातोंरात ऊष्मायन मिश्रण में 1000 गुना अधिक गैर tritiated dexamethasone सहित से गणना की जा सकती है. एक वैकल्पिक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में, विरोधी जीआर immunoadsorbing एंटीबॉडी 2.2 चरण में जोड़ी के साथ प्रतिस्थापित किया जा सकता है एक गैर - GR-immunoadsorbing एंटीबॉडी (एनआई).
    6. 200 μl TEGM बफर और 10 मिलीलीटर जगमगाहट की शीशियों कट P-200 pipet टिप का उपयोग करने के लिए हस्तांतरण में धोया immunopellets निलंबित.
    7. शीशियों और भंवर को 4.8 मिलीलीटर जगमगाहट कॉकटेल जोड़ें.
    8. पुनर्गठन जीआर के लिए स्टेरॉयड के बंधन [3 एच] की राशि • HSP90 प्रोटीन जटिल तरल जगमगाहट स्पेक्ट्रोमेट्री का उपयोग assayed किया जा सकता है है .

6. प्रतिनिधि परिणाम:

एसडीएस PAGE प्रतिनिधि और पश्चिमी धब्बा डेटा चित्रा 3 में प्रस्तुत कर रहे हैं. अंतर्जात जीआर • HSP90 heterocomplex सेल cytosol विरोधी जीआर एंटीबॉडी और व्यक्ति प्रोटीन है कि जीआर के साथ सह - immunoadsorb Coomassie धुंधला हो जाना (छवि 3A) द्वारा कल्पना कर रहे हैं का उपयोग कर से immunoadsorbed है. पुनर्गठन परख में किसी भी कदम पर immunopellet के किसी भी घटक के प्रोटीन की पहचान की पुष्टि एसडीएस पृष्ठ आणविक भार और पश्चिमी सोख्ता हित के प्रोटीन के खिलाफ उठाया मोनोक्लोनल एंटीबॉडी का उपयोग कर की गणना के द्वारा बनाया जा सकता है.

पुनर्गठित जीआर • HSP90 heterocomplexes Experion microfluidic वैद्युतकणसंचलन (छवि -3 सी और 3 डी) डेटा और पश्चिमी धब्बा विश्लेषण (3B छवि) का उपयोग कर प्रस्तुत कर रहे हैं. जीआर immunoadsorption की विशिष्टता nonimmune एंटीबॉडी (छवि -3 सी, एनआई आईजीजी गलियों) के साथ immunoadsorbing विरोधी जीआर एंटीबॉडी की जगह द्वारा की पुष्टि की है. यहां तक ​​कि जब nonimmune एंटीबॉडी का अत्यधिक मात्रा में उपयोग किया जाता है, कोई जीआर या आणविक संरक्षिकाओं (cf. चित्र 3C में, जीआर, HSP90, और HSP70 में मनाया बैंड की कमी के साथ विरोधी जीआर immunoadsorption गलियों में मौजूद प्रोटीन बैंड immunoprecipitated एनआई आईजीजी गलियों). इसी तरह, यह संभव है पश्चिमी धब्बा विश्लेषण द्वारा नमक छीन छीन लिया और पुनर्गठन immunopellets की जीआर (3B छवि) से HSP90 की हदबंदी और अन्य निगरानी प्रोटीन की पुष्टि करने के लिए. immunoadsorbing एंटीबॉडी की भारी श्रृंखला (एचसी) के दोनों Coomassie दाग और पश्चिमी सोख्ता द्वारा detectable है, और यह प्रत्येक लेन में visualized किया जा रहा बराबर आकार immunopellets की पुष्टि करता है.

स्टेरॉयड बाध्यकारी गतिविधि immunoadsorbed जीआर के सभी परीक्षण की स्थिति के लिए assayed द्वारा किया जा सकता है, और प्रतिनिधि स्टेरॉयड डेटा बाइंडिंग चित्रा 4 में प्रस्तुत कर रहे हैं. अंतर्जात जीआर • HSP90 heterocomplexes, नमक छीन, immunoadsorbed हैं और पुनर्गठन. या तो reticulocyte lysate का प्रयोग या शुद्ध प्रोटीन, पुनर्गठन जीआर स्टेरॉयड बाध्यकारी गतिविधि • HSP90 heterocomplex आम तौर पर अंतर्जात जीआर • HSP90 बाध्यकारी गतिविधि के स्तर के 75-100% रिटर्न. वैद्युतकणसंचलन डेटा के लिए इसी प्रकार, एक nonimmune एंटीबॉडी (एनआई) विरोधी जीआर एंटीबॉडी (मैं) की जगह में इस्तेमाल किया जा सकता है क्रम में एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में सेवा और nonspecific [एच 3] स्टेरॉयड बंधन का एक उपाय के रूप में.

चित्रा 1
चित्रा 1 जीआर • HSP90 heterocomplex विधानसभा और जीआर स्टेरॉयड बाध्यकारी फांक खोलने के मॉडल. hsp90/hsp70-based निगरानी मशीनरी जीआर ligand बाध्यकारी डोमेन fol से धर्मान्तरितded रचना में जो स्टेरॉयड फांक बंधन बंद है और एक खुला फांक रचना (heterocyclic स्टेरॉयड चिह्न द्वारा सचित्र) पहुँचा जा सकता है के लिए सुलभ हार्मोन के लिए नहीं. निगरानी कक्ष में preassembled मशीनरी और अनायास जब HSP90, HSP70 शुद्ध फार्म का होगा, और हॉप समाधान में मिश्रित कर रहे हैं (1 रिएक्शन). हॉप एक 34 एमिनो एसिड tetratricopeptide (TPR) दोहराने डोमेन (एक अंधेरे वर्धमान के रूप में सचित्र) होते हैं, और बाद TPR डोमेन immunophilin प्रोटीन युक्त द्वारा heterocomplex परिपक्वता की प्रक्रिया के दौरान बदल दिया है. मशीनरी स्टेरॉयड एक एटीपी और कश्मीर + निर्भर तरीके में फांक बंधन खोलता है, जिसके बाद छोड़ हॉप और HSP70 और hsp40 अंततः सबसे जटिल (एक डैश्ड चिह्न के रूप में सचित्र). Mechanistically, जीआर के साथ HSP70 पहले सूचना का आदान प्रदान HSP90 और primes HSP90 और बाद में फांक खोलने के लिए रिसेप्टर. प्रयोगात्मक, स्टेरॉयड बाध्यकारी और जीआर फांक खोलने अगर HSP90 और HSP70 एक साथ मौजूद हैं बढ़ रहे हैं. heterocomplex HSP90 सह निगरानी p23, जो एक एटीपी बाध्य रचना में HSP90 रखता है प्रविष्टि से स्थिर है. हॉप के बाहर निकलने के बाद, एक उच्च आणविक भार immunophilin (IMM) HSP90 बाँध, अंतिम heterocomplex बनाने के रूप में यह कोशिकाओं से बरामद किया है सकते हैं. Pratt और एक रियासत से अनुकूलित.

चित्रा 2
चित्रा 2 इस प्रोटोकॉल के 2-5 कदम की योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व. जीआर जीआर (FiGR) एक Sepharose प्रोटीन की एक गोली के लिए बाध्य के खिलाफ उठाए गए एक मोनोक्लोनल एंटीबॉडी का उपयोग करते हुए सेल cytosol से immunoadsorbed है. HSP90 और अन्य निगरानी प्रोटीन अंतर्जात जीआर • HSP90 heterocomplex जीआर के साथ सह immunoadsorbed में मौजूद है, और जीआर स्टेरॉयड के लिए बाध्य करने में सक्षम है. HSP90 एक हल्के नमक उपचार, नमक विपठ्ठन के रूप में (Str) करने के लिए निर्दिष्ट का उपयोग जीआर से अलग है. स्टेरॉयड नमक - छीन जीआर के फांक बंधन बंद कर देता है, यह स्टेरॉयड के लिए बाध्य करने में असमर्थ रही. मध्यवर्ती जीआर • HSP90 HSP70 युक्त heterocomplexes, hsp40, और हॉप, जो बाध्यकारी स्टेरॉयड के सक्षम हैं प्रोटीन या reticulocyte lysate (Retic lysate) और cofactors शुद्ध के साथ नमक - छीन जीआर incubating द्वारा (Recon) का पुनर्गठन कर सकते हैं. स्टेरॉयड बाध्यकारी और हर कदम के immunopellet प्रोटीन सामग्री गतिविधि रातोंरात [एच 3] स्टेरॉयड ऊष्मायन और पश्चिमी सोख्ता, क्रमशः से पहचाना जा सकता है .

चित्रा 3
चित्रा 3 immunoadsorbed परिसरों के electrophoretic प्रोटीन विश्लेषण. पुनर्गठन जीआर के एक, एसडीएस PAGE • HSP90 पारंपरिक वैद्युतकणसंचलन electrotransfer और Coomassie धुंधला द्वारा बाद प्रणाली का उपयोग करने के लिए imaged heterocomplex. जीआर, HSP90, और HSP70 के अलावा, भारी (एचसी) श्रृंखला और एंटीबॉडी के प्रकाश श्रृंखला (नियंत्रण रेखा) कल्पना कर रहे हैं. वजन आणविक मार्कर (केडीए में व्यक्त) के प्रवासन बाईं तरफ संकेत कर रहे हैं. बी, नमक - छीन (Str) जीआर और पुनर्गठन जीआर • HSP90 heterocomplex (Recon) युक्त immunopellets के पश्चिमी धब्बा. सी, पुनर्गठन जीआर की आभासी जेल • HSP90 एक Experion microfluidic वैद्युतकणसंचलन प्रणाली का उपयोग करने के लिए उत्पन्न heterocomplex. (एनआई आईजीजी) nonimmune और (विरोधी जीआर) प्रतिरक्षा एंटीबॉडी immunoadsorbing के दो अलग अलग सांद्रता शामिल हैं. एनआई IgGs नकारात्मक नियंत्रण के रूप में सेवा करते हैं. विकास, पुनर्गठन जीआर के electropherogram • HSP90 Experion microfluidic वैद्युतकणसंचलन पैनल microfluidic वैद्युतकणसंचलन बी लाभ छोटे नमूना संस्करणों के लिए आवश्यकता शामिल की तीसरी लेन में दिखाया गया है नमूना से प्राप्त heterocomplex, तरल से निपटने और चलाने के बाद सफाई में कमी, सुधार मात्रा का ठहराव, काफी और कम नमूना चलाता है.

चित्रा 4
चित्रा 4 अंतर्जात जीआर के immunoadsorption (Enodg), नमक - छीन जीआर (Str) निम्नलिखित immunopellets स्टेरॉयड बाध्यकारी गतिविधि, और जीआर पुनर्गठन • HSP90 heterocomplex (Recon). एक मोनोक्लोनल विरोधी जीआर immunoadsorbing एंटीबॉडी (आई) के साथ जीआर immunoadsorbing के अलावा, प्रत्येक शर्त के लिए नकारात्मक नियंत्रण नमूने एक nonimmune immunoglobulin (एनआई) का उपयोग कर तैयार थे.

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Discussion

ऊपर वर्णित परख hsp90/hsp70-based निगरानी मशीनरी की निगरानी कार्रवाई के रूप में अच्छी तरह के रूप में जीआर स्टेरॉयड बंधन को प्रभावित करने की स्थिति की असंख्य परीक्षण करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है. यह पहले की रिपोर्ट 4,8,9,17 तरीकों में से एक संशोधन है और वैद्युतकणसंचलन प्रौद्योगिकी के क्षेत्र में हाल के अग्रिमों का लाभ ले लो और एक व्यापक अनुसंधान समुदाय के लिए सुलभ बनाया. ब्याज के अतिरिक्त cofactors या प्रोटीन जीआर करने के लिए जोड़ा जा सकता है • HSP90 heterocomplex पुनर्गठन मिश्रण, प्रोटोकॉल के चरण 4 में वर्णित है, क्रम में स्टेरॉयड बंधन, heterocomplex प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत, और सह कारक आवश्यकताओं पर प्रभाव का निरीक्षण करने के लिए. उदाहरण के लिए, HSP90 समारोह पर ischemia-reperfusion की प्रभाव एक प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों की बढ़ती सांद्रता के अलावा के साथ modeled किया जा सकता है. एक विशिष्ट सुविधा (जैसे acetylated HSP90) या संभावित HSP90 inhibitors (जैसे उपन्यास geldanamycin analogs) के साथ शुद्ध प्रोटीन स्टेरॉयड बाध्यकारी और heterocomplex गठन के लिए निर्धारित किया पर उनके प्रभाव के लिए आदेश में जोड़ा जा सकता है है.

डाउन स्ट्रीम वैद्युतकणसंचलन की तुलना में अलग assays, पश्चिमी सोख्ता, और स्टेरॉयड बाध्यकारी assays भी नियोजित किया जा सकता है. उदाहरण के लिए, immunoprecipitated multiprotein परिसरों पर्याप्त 18,19 सफलता के साथ प्रवाह cytometry द्वारा विश्लेषण किया गया है. immunoadsorbed जीआर • HSP90 परिसरों hsp90/hsp70 nucleotide राज्य के लिए भी assayed किया जा सकता है या परमाणु शक्ति 17 माइक्रोस्कोपी का उपयोग करते हुए कल्पना. HSP90 ग्राहक जीआर की तुलना में अन्य प्रोटीन (जैसे chaperoning चेकपॉइंट kinase (Chk1) मैं 20) इस्तेमाल किया जा सकता है, और मौलिक अनुसंधान एस्ट्रोजन रिसेप्टर, प्रोजेस्टेरोन रिसेप्टर और एसआरसी 1,13,21 इस प्रोटोकॉल के साथ भिन्नरूपों का उपयोग करने के लिए आयोजित किया गया है.

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Disclosures

वैद्युतकणसंचलन अभिकर्मकों का चयन करें और छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर जैव रेड द्वारा प्रदान किया गया.

Acknowledgments

यह काम राष्ट्रीय स्वास्थ्य अनुदान GM086822, आशा है कि हार्ट इंस्टीट्यूट बेसिक साइंसेज पुरस्कार, और एम.जे. Murdock चैरिटेबल ट्रस्ट कॉलेज साइंस रिसर्च प्रोग्राम के संस्थान के द्वारा वित्त पोषित किया गया था. वैद्युतकणसंचलन अभिकर्मकों का चयन करें और छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर उदारता जैव रेड द्वारा प्रदान किया गया.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sf9 insect cells Invitrogen for baculovirus expression of recombinant mouse GR
L929 cells ATCC CRL-2173 for endogenous mouse GR cytosol preparation (alternative to baculovirus expression)
FiGR hybridoma cells ATCC CRL-2173 for preparing ascites containing anti-GR monoclonal antibody (alternative to purified BuGR2 antibody)
Complete-Mini protease inhibitor, EDTA-free Roche Group 11836170001
protein A-Sepharose Sigma-Aldrich P3391
rabbit reticulocyte lysate Green Hectares (Oregon, WI) rich source of endogenous hsp90/hsp70 chaperone machinery
creatine phosphokinase Sigma-Aldrich C3755 for ATP-regenerating system
phosphocreatine Sigma-Aldrich P7936 for ATP-regenerating system
anti-GR mouse monoclonal antibody (BuGR2) Pierce, Thermo Scientific MA1-510 used for GR immunoadsorption and as primary antibody in western blotting
anti-hsp90 mouse monoclonal antibody (AC88) Enzo Life Sciences ADI-SPA-830 used as primary antibody in western blotting
anti-hsp70 mouse monoclonal antibody (N27F3-4) Enzo Life Sciences ADI-SPA-820 used as primary antibody in western blotting
IgG from mouse serum Sigma-Aldrich 038K7690 used as nonimmune antibody for negative control of immunoadsorption
anti-mouse IgG-peroxidase conjugate Sigma-Aldrich A4416 used as secondary antibody in western blotting
Experion microfluidic electrophoresis system Bio-Rad 7007001 alternative to conventional SDS-PAGE
[1,2,4,6,7-3H] dexamethasone PerkinElmer, Inc. NET1192001MC follow safety precautions

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References

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बायोकैमिस्ट्री 55 अंक glucocorticoid रिसेप्टर HSP90 आणविक निगरानी प्रोटीन इन विट्रो पुनर्गठन में स्टेरॉयड बंधन जैव रसायन immunoadsorption immunoprecipitation Experion पश्चिमी धब्बा
स्टेरॉयड रिसेप्टर की बायोकेमिकल पुनर्गठन • HSP90 प्रोटीन ligand के परिसर और पुनर्सक्रियण बंधन
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Murphy, P. J. M., Franklin, H. R.,… More

Murphy, P. J. M., Franklin, H. R., Furukawa, N. W. Biochemical Reconstitution of Steroid Receptor•Hsp90 Protein Complexes and Reactivation of Ligand Binding. J. Vis. Exp. (55), e3059, doi:10.3791/3059 (2011).

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