Summary
En
Abstract
Hsp90 är en viktig och mycket rikligt molekylära förkläde protein som har funnit att reglera mer än 150 eukaryota signalering proteiner, inklusive transkriptionsfaktorer (t.ex. nukleära receptorer, p53) och kinaser protein (t.ex. Src, Raf, Akt kinas) som är involverade i cell cykling, Tumörgenesens, apoptos, och flera eukaryota vägar signalering 1,2. Av dessa många "kund" proteiner för hsp90 och montering av steroidreceptoreffekten • hsp90 komplex är den bästa definieras (Figur 1). Vi presenterar här en anpassningsbar glukokortikoid-receptorn (GR) immunoprecipitation analys och in vitro GR • hsp90 beredning metod som lätt kan användas för att sonden eukaryota hsp90 funktionell aktivitet, hsp90-medierad steroidreceptoreffekten ligandbindande och molekylär förkläde krav kofaktor. Till exempel kan detta test användas för att testa hsp90 kofaktor kraven och effekterna av att lägga exogena substanser till återupprättandet processen.
GR har varit ett särskilt användbart för att studera hsp90 eftersom receptorn måste vara bunden till hsp90 att ha en öppen ligandbindande klyfta som är tillgänglig för steroid 3. Endogena, unliganded GR finns i cytoplasman hos däggdjursceller noncovalently bunden till hsp90. Som finns i den endogena GR • hsp90 heterocomplex är GR ligandbindande kluven öppen och kan binda steroid. Om hsp90 dissocierar från GR eller om dess funktion hämmas, är den receptor kan binda steroid och kräver beredning av GR • hsp90 heterocomplex innan steroid bindande aktivitet återställs 4. GR kan immunoprecipitated från cell cytosolen med hjälp av en monoklonal antikropp, och proteiner som hsp90 komplexbundet till GR kan analyseras med Western blot. Steroid bindande aktivitet immunoprecipitated GR kan bestämmas genom inkubering av immunopellet med [3 H] steroid.
Tidigare försök har visat hsp90-medierade öppnandet av GR kluven ligandbindande kräver hsp70, en andra molekylär förkläde också viktigt för eukaryota cellernas livskraft. Biokemiska aktivitet hsp90 och hsp70 katalyseras av co-förkläde proteiner Hop, hsp40 och P23 5. En Multiproteinkomplex förkläde maskiner som innehåller hsp90, hsp70, Hop, och hsp40 är endogent närvarande i eukaryota cellens cytoplasma, och retikulocytantal lysat ger ett förkläde rik proteinkälla 6.
I den presenterade metoden är GR immunoadsorbed från cell cytosolen och fråntagen den endogena hsp90/hsp70 förkläde maskiner med mild salt förhållanden. Saltet-avskalade GR inkuberas sedan med retikulocyttal lysat, ATP, och K +, vilket resulterar i beredning av GR • hsp90 heterocomplex och reaktivering av steroid bindande aktivitet 7. Denna metod kan användas för att testa effekterna av olika förkläde kofaktorer, proteiner roman, och experimentella hsp90 eller GR-hämmare för att fastställa deras funktionella betydelse för hsp90-medierad steroid bindande 8-11.
Protocol
1. Beredning av cell cytosolen innehåller funktionella GR
- Teknisk anmärkning: Alla buffertar bör förvaras i kylskåp och varje steg i detta protokoll, inklusive centrifugering och inkubation, bör utföras på is eller vid 4 ° C, om inte annat anges. Den låga temperaturen är nödvändig för att förhindra nedbrytning av GR och proteinkomplex.
- Med hjälp av en kyld centrifug, skaffa en ~ 1-5 ml pellet av celler som uttrycker en hög koncentration av funktionella GR. Exempel på cell källor rika på GR inkluderar möss fibroblast L929 celler, som uttrycker en hög koncentration av endogena GR och Sf9 celler som har infekterats med rekombinant GR baculovirus (t.ex. p2Bac-MGR baculovirus 12). Ungefär 15-20 ml packade celler erhålls per liter Sf9 baculovirus cellkultur. Celler bör växer exponentiellt före skörd. Centrifugera cellsuspension på 5000 × gi 5 min.
- Tvätta cellpelleten tre gånger med 15 ml Hanks buffrad saltlösning. Mellan tvättar försiktigt suspendera pelleten, följt av centrifugering på 5000 × gi 5 min. Efter den sista tvättningen helt avlägsna supernatanten.
- Förbered 7,5 ml av en homogenisering buffert som innehåller HEM buffert (10 mM HEPES, 1 mM EDTA, 20 mm natriummolybdat, pH 7,4), 1 mm phenylmethylsulfonyl fluorid (PMSF) och 3 tabletter grund av Komplett-Mini proteashämmare. Den PMSF och Complete-Mini tabletter förhindra proteolys uppstår under den efterföljande stegen. Komplett-Mini tabletter kan lätt marken till ett fint pulver med en mortel. Lägg till 1,5 volymer av homogenisering buffert cellpelleten.
- Ruptur cellerna genom Dounce homogenisering (50 slag) eller frysa / tina (3 cykler) teknik. Dounce homogenisering får behålla förbättrade endogena GR • hsp90 proteinkomplex och är snabbare att slutföra. Frys / tina ger forskare en möjlighet att avbryta protokollet i detta steg och fortsätta vid ett senare tillfälle. Dounce homogenisering bör utföras med homogeniseringsblandare i en ishink för att förhindra proteinnedbrytning. Frys / tina kan åstadkommas genom att frysa centrifugrör som innehåller cellpelleten-homogenisering buffert blandat med flytande kväve, torr is, eller -20 ° C inkubering, följt av upptining i ett 30 ° C vattenbad.
- Separera GR som innehåller cytosolen från spruckna cellen partiklar genom ultracentrifugering. Överför homogenatet till långsiktiga ultracentrifugen rör, rör balans genom massan i par och centrifugera vid 100 tusen × g under 30 minuter.
- Ta cytosolen (supernatanten) och förvara vid -20 ° C i 500 l alikvoter i 1,5 rör ml mikrocentrifug för långsiktig lagring. För att bibehålla maximal funktionell GR aktivitet, flash-frysa alikvoter i flytande kväve eller inkubera i 30 sekunder i en metanol-torr isbad före lagring. Ta försiktighet för att undvika direkt hudkontakt med kyl-reagens.
2. Immunoadsorption för GR från cell cytosolen
- Teknisk anmärkning: Figur 2 ger en schematisk översikt över stegen 2-5 i detta protokoll.
- Förbered en immunoadsorption blandning som innehåller en monoklonal immunoglobulin G (IgG) antikroppar som riktats mot GR för att immunoadsorb receptorn upprättats i steg 1. I ett 1,5 ml mikrocentrifugrör, kombinera 100 l av den upptinade GR som innehåller cytosolen, 200 l TEGM buffert (8 mm TES, 4 mM EDTA, 50 mM NaCl, 20 mM molybdat, 10% (v / v) glycerol, pH 7,6) , 100 l av en 20% protein A-Sepharose (PAS) Flytgödsel (v / v, upprättad i TEGM buffert), och 5 mikrogram av anti-GR monoklonal IgG-antikroppar (t.ex. BuGR2). Molybdat ingår i TEGM buffert för att hjälpa till att stabilisera GR-hsp90 heterocomplex, som kan vara användbara för att analysen endogena heterocomplex steroid bindande aktivitet 13.
- Anti-GR antikropp är kommersiellt tillgänglig som renat protein. Alternativt kan erhållas genom att tillsätta 10 ìl av anti-GR IgG-innehållande ascites till immunoadsorption blandningen. Ascites är producerad av möss injiceras med anti-GR Hybridomteknik celler (t.ex. FiGR Hybridomteknik celler 14), och den ungefärliga antikroppskoncentrationen från ascites och som används i dessa experiment var 0,5 mikrogram / l, mätt med Bradford analysen.
- Förbered en negativt kontrollprov med GR som innehåller cytosolen, TEGM buffert, och PAS (enligt ovan), och 5 mikrogram av en IgG som inte känner igen GR, hsp90 eller andra molekylära proteiner förkläde (som kallas en "nonimmune" antikropp).
- På grund av den relativt stora PAS pärla storlek, använd en cut P-200 pipettspetsen vid överföring PAS från 20% slammet till provrör. Skär Pipettera tips är förberedda genom skärning av 2-3 mm bort från slutet av kommersiellt tillgängliga P-200 tips, vilket ökar bländaren pipettspetsen.
- Placera prov på en vertikal roterande hjul och inkubera i minst 2 timmar med konstant rotation. Prover kaninkuberas i upp till 8 timmar utan förlust av aktivitet.
- Vid ingående av immunoadsorption inkubation, avlägsna obundna proteiner från antikropps-PAS pellet ("immunopellet") genom centrifugering. Separera supernatanterna från immunopellets genom centrifugering med en kyld centrifug programmerad i 1 minut vid 10 tusen × g, och sedan tvätta två gånger med 1 ml TEGM buffert och skaka. Efter centrifugering och mellan tvättar, kassera supernatanten vara försiktig för att inte störa pelleten.
- Ta bort alla supernatanten vid ingåendet av den andra tvätten. För att säkerställa att ingen av pellets misstag sugs, använd en veckad P-200 pipettspetsen för slutlig supernatant aspiration. Veckade Pipettera tips är förberedda genom att platta kommersiellt tillgängliga P-200 tips med hjälp av pincett.
3. Dissociation av endogena hsp90 från GR immunopellet ("Salt stripping")
- Till tvättade immunopellet upprättats i steg 2, tillsätt 355 l TEG buffert (TEGM buffert utan natriummolybdat) och 45 l 5 M NaCl (slutlig NaCl koncentration = 0,5 M).
- Placera prov på en vertikal roterande hjul och inkubera i 1,5 timmar med ständig rotation. Prover kan inkuberas i upp till två timmar, men kan längre inkubationer leda till minskad protein återhämtning och lägre funktionell aktivitet.
- Ta bort obundna proteiner från immunopellet genom centrifugering. Spin prover för 1 minut vid 10000 × g. Tvätta en gång med 1 ml TEG buffert och en gång med 1 ml 10 mM HEPES buffert, pH 7,4.
- Ta bort alla supernatanten vid ingåendet av den andra tvättar, försiktigt så att inte störa immunopellet, med hjälp av en veckad P-200 pipettspetsen.
4. Ombildning av GR • hsp90 heterocomplex med molekylära följeslagare, co-faktorerna, och ATP
- Teknisk anmärkning: En myriad av experimentella förhållanden kan testas genom att ta med extra proteiner, co-faktorerna, aktivatorer eller inhibitorer av intresse i beredning blandningen förberedda nedan. Total volym av beredning blandningar bör vara <120 l.
- Till varje salt-strippad immunopellet upprättats i steg 3, tillsätt en blandning blandning som innehåller 50 ìl av en molekylär förkläde källa och 5 ìl av en ATP-genererande system (10 mM HEPES, 50 mm ATP, 250 mm kreatinfosfat, 20 mm magnesium-acetat , 100 U / ml kreatinfosfokinas, pH 7,4).
- Beredning reaktioner kan ökas genom att komplettera den beredning blandningen med 50 l HKD buffert (10 mM HEPES, 100 mm KCl, 5 mm ditiotreitol (DTT), pH 7,4) och ytterligare 5 ìl av ATP-genererande system. Detta steg kan utelämnas om gott beredning och steroid bindande följs. KCl ökar hsp70 ATPas aktivitet och DTT skyddar cystein-innehållande proteiner från oxidation 9.
- En rekommenderad molekylär förkläde källan är kommersiellt tillgänglig kanin retikulocyttal lysat. Individuella molekylär följeslagare renas från retikulocyttal lysat eller recombinantly uttrycker sig (t.ex. 15 mikrogram hsp90, 15 mikrog hsp70, 0,6 mikrogram Hop, 6 mikrogram P23 och 0,125 mikrogram hsp40 i HKD buffert) kan också användas.
- Inkubera prov i en 30 ° C vattenbad under exakt 20 minuter. Flick rören var 1-2 minuter för att försiktigt störa pelleten och blanda beredning lösningen.
- Tillsätt 1 ml TEGM buffert, virvel, och centrifugera vid 10000 × gi 1 minut. Avlägsna supernatanten och kasta försiktigt så att inte störa pelleten. Upprepa för totalt tre tvättar. Helt ta bort alla supernatanten på avslutningen av den sista tvätten med en veckad P-200 pipettspetsen.
5. Analys av rekonstituerad proteinkomplex och ligandbindande aktivitet
- Proteiner i den rekonstituerade immunopellet kan identifieras med konventionella denaturering polyakrylamidgelelektrofores (SDS-PAGE), mikroflödessystem elektrofores (t.ex. Bio-Rad Experion) och Western blotting (Fig. 3). Teknisk anmärkning: Utmärkt protokoll som beskriver SDS-PAGE 15 och Western blotting 16 finns för närvarande, artighet av andra utredare.
- Tillsätt 50 ìl av SDS-PAGE prov buffert som innehåller β-merkaptoetanol och skaka. Särskilda prov buffert recept varierar. Välj ett baserat på tillverkarens rekommendation av elektrofores som kommer att tillämpas.
- Inkubera i 5 minuter i ett kokande vattenbad eller 100 ° C elektroniska värmeblocket.
- Centrifugera vid 10000 × gi 1 minut. Den immunoadsorbing antikropp, GR, och proteiner komplexbundet till GR kommer att skiljas från varandra och släpps ut i provet bufferten supernatanten.
- Överför supernatanten till ett nytt mikrocentrifugrör med en veckad spets P-200 pipettspetsen. Kasta pelleten. Provet är nu förberett för analys med kommersiellt tillgängliga SDS-PAGE eller mikroflödessystem system elektrofores. Fyll i antingen teknik ffter tillverkarens anvisningar.
- Western blot analyser efter SDS-PAGE möjliggör definitiv identifiering av immunoadsorbed GR och molekylära följeslagare komplexbundet till GR efter beredning inkubation. Använd monoklonala primära antikroppar som riktas mot GR (BuGR2), hsp90 (AC88), hsp70 (N27F3-4) och co-förkläde proteiner för att upptäcka viktiga komponenter i GR • hsp90 proteinkomplex.
- Funktionell aktivering av salt avskalade GR efter beredning av GR • hsp90 proteinkomplex kan identifieras genom analys av steroid-bindande aktivitet med hjälp av ett [3 H] steroid (bild 4). För resten av protokollet, följer nödvändiga försiktighetsåtgärder för säker hantering tritiated prover och avfall.
- Till rekonstituerade immunopellet lägger 47,5 l HEM buffert och 2,5 l av 2 mikroM [3 H] dexametason (slutlig steroid koncentration = 100 nM).
- Blanda försiktigt pelleten var noga med att minimera mängden av prov förflyttas till väggen i mikrocentrifugrör.
- Inkubera över natten på is. Det är inte nödvändigt att rotera eller blanda provrören under inkubationstiden.
- Tillsätt 1 ml TEGM buffert, blanda försiktigt, och centrifugera vid 10000 × gi 1 minut. Kasta bort vätskefasen, vara uppmärksam innehåller obundna [3 H] steroid. Upprepa för totalt 3 tvättar med TEGM buffert.
- Helt ta bort alla supernatanten på avslutningen av den sista tvätten med en veckad P-200 pipettspetsen. Pelleten innehåller GR, hsp90 och andra molekylära följeslagare komplexbundet till GR, och [3 H] steroid specifikt bundet till receptorn. Icke-specifik bindning kan beräknas genom att ta 1000 gånger mer än icke-tritiated dexametason i natten inkubation blandningen. Som ett alternativ negativ kontroll, tillade den anti-GR immunoadsorbing antikroppar i steg 2,2 kan ersättas med en icke-GR-immunoadsorbing antikropp (NI).
- Häng tvättade immunopellets i 200 l TEGM buffert och överför till 10 flaskor ml scintillation med en cut P-200 pipettspetsen.
- Tillsätt 4,8 cocktail ml scintillation till rören och skaka.
- Mängden [3 H] steroid bindning till den beredda GR • hsp90 proteinkomplex kan analyseras med hjälp av flytande scintillation spektrometri.
6. Representativa resultat:
Representant SDS-PAGE och Western blot-uppgifter presenteras i figur 3. Den endogena GR • hsp90 heterocomplex är immunoadsorbed från cell cytosolen använda anti-GR antikropp och enskilda proteiner som tillsammans immunoadsorb med GR synliga genom Coomassie färgning (Fig. 3A). Bekräftelse av protein identiteten hos någon komponent i immunopellet vid varje steg i beredningen analysen kan göras med SDS-PAGE beräkning av molekylvikt och Western blotting med hjälp av monoklonala antikroppar som riktats mot proteinet av intresse.
Färdigberedd GR • hsp90 heterocomplexes presenteras med hjälp Experion mikroflödessystem elektrofores data (Fig. 3C och 3D) och Western blot-analys (Fig. 3B). Specificiteten hos GR immunoadsorption bekräftas genom att ersätta immunoadsorbing anti-GR antikropp med en nonimmune antikropp (Fig. 3C, NI IgG körfält). Även när stora mängder nonimmune antikroppar används, finns inga GR eller molekylär följeslagare immunoprecipitated (jfr i fig.. 3C, GR, hsp90 och hsp70 band protein som finns i den anti-GR immunoadsorption körfält med bristen på bandet som observerats i NI IgG körfält). Likaså är det möjligt att bekräfta dissociation av hsp90 och andra proteiner förkläde från salt-avskalade GR med Western blot-analys (Fig. 3B) av den skalade och beredda immunopellets. Den tunga kedjan i immunoadsorbing antikropp (HC) kan upptäckas av både Coomassie fläcken och Western blotting, och det tjänar till att bekräfta lika stora immunopellets håller på att visualiseras i varje körfält.
Steroid bindande aktivitet immunoadsorbed GR kan analyseras genom att för alla testade förhållanden, och representativa steroid bindande uppgifter presenteras i Figur 4. Endogena GR • hsp90 heterocomplexes är immunoadsorbed, salt-avskalade och rekonstruerad. Med antingen retikulocyttal lysat eller renade proteiner, steroid bindande aktivitet för färdigberedd GR • hsp90 heterocomplex återgår vanligtvis till 75-100% av den endogena GR • hsp90 bindande aktivitetsnivå. I likhet med elektrofores data kan en nonimmune antikropp (NI) användas i stället för anti-GR antikropp (I) i syfte att tjäna som en negativ kontroll och som ett mått på icke-specifik [3 H] steroid bindande.
Figur 1. Modell av GR • hsp90 heterocomplex montering och GR steroid bindande kluven öppning. Den hsp90/hsp70-based förkläde maskiner omvandlar GR ligandbindande domän från ett fölDED konformation i vilken steroid bindande klyfta är stängd och inte tillgänglig för hormon till ett öppet kluven konformation som kan nås (illustreras av heterocykliska steroid ikonen). Den förkläde maskiner är förmonterad i cellen och kommer spontant form när renat hsp90, hsp70 och Hop blandas i lösning (reaktion 1). Hop innehåller 34 aminosyror upprepa syra tetratricopeptide (TPR) domän (illustreras som en mörk halvmåne), och senare ersattes under heterocomplex mognadsprocessen av en TPR domän som innehåller immunofilin protein. De maskiner som öppnar steroid bindande klyfta i en ATP-och K +-beroende sätt, varefter Hop och de flesta av de hsp70 och hsp40 slutändan lämnar komplexet (illustreras som en streckad ikon). Mekaniskt, interagerar hsp70 med GR före hsp90 och primtal receptorn för hsp90 och efterföljande kluven öppning. Experimentellt, är steroid bindande och GR kluven öppning ökas om hsp90 och hsp70 är närvarande samtidigt. Den heterocomplex stabiliseras av införseln av hsp90 co-förkläde P23, som upprätthåller hsp90 i en ATP-bundna konformation. Efter uttag ur Hop, kan en hög molekylvikt immunofilin (IMM) binder hsp90 och bildar den slutliga heterocomplex som återvinns från celler. Anpassad från Pratt och Toft 1.
Figur 2. Schematisk bild över stegen 2-5 i detta protokoll. GR är immunoadsorbed från cell cytosolen med hjälp av en monoklonal antikropp som riktas mot GR (FiGR) bundna till en pellet av protein A-Sepharose. Hsp90 och andra proteiner förkläde som finns i den endogena GR • hsp90 heterocomplex är co-immunoadsorbed med GR och GR kan binda till steroid. Hsp90 är skiljas från GR med ett milt salt behandling, kallad salt-strippning (STR). Den steroid bindande kluven av saltet avskalade-GR stänger, eftersom det inte kan binda till steroid. Mellanliggande GR • hsp90 heterocomplexes innehåller hsp70, hsp40 och Hop, som kan binda steroid, kan beredas (Recon) genom inkubering av salt-avskalade GR med renade proteiner eller retikulocyter lysat (Retic lysat) och co-faktorerna. Den steroid bindande aktivitet och immunopellet proteinhalten i varje steg kan identifieras genom natten [3 H] steroid inkubation och Western blotting, respektive.
Figur 3. Elektroforesisk protein analys av immunoadsorbed komplex. A, SDS-PAGE rekonstituerad GR • hsp90 heterocomplex avbildas med konventionella elektrofores system som följs av electrotransfer och Coomassie färgning. Förutom GR, hsp90 och hsp70, den tunga kedjan (HC) och lätt kedja (LC) av antikroppar visualiseras. Migration av molekylvikt markörer (uttryckt i kDa) visas till vänster. B, Western blot av immunopellets innehåller salt-avskalade GR (STR) och rekonstruerad GR • hsp90 heterocomplex (Recon). C, virtuella gel av rekonstituerad GR • hsp90 heterocomplex genereras med hjälp av en Experion mikroflödessystem elektrofores system. Två olika koncentrationer av en nonimmune (NI IgG) och immunförsvaret (anti-GR) immunoadsorbing antikroppar ingår. NI IgG tjäna som negativa kontroller. D electropherogram rekonstituerad GR • hsp90 heterocomplex från Experion mikroflödessystem elektrofores prov som visas i tredje körfält av panel B. Fördelar med mikrofabricerade elektrofores omfattar krav för mindre provvolymer, minskade vätskehantering och efter kör rensning, förbättrad kvantifiering, och väsentligt kortare prov körs.
Figur 4. Steroid bindande aktivitet immunopellets efter immunoadsorption av endogena GR (Enodg), salt-avskalade GR (STR) samt rekonstruerad GR • hsp90 heterocomplex (Recon). Förutom immunoadsorbing GR med en monoklonal anti-GR immunoadsorbing antikropp (I), var negativa kontrollprover för varje tillstånd prepareras med en nonimmune immunglobulin (NI).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Analysen som beskrivs ovan kan anpassas för att testa en myriad av förhållanden som påverkar förkläde agerande hsp90/hsp70-based förkläde maskiner samt GR steroid bindande. Det är en modifiering av tidigare redovisade metoder 4,8,9,17 och är utformad för att dra nytta av de senaste framstegen inom elektrofores teknik och vara tillgänglig för en bredare forskarsamhället. Ytterligare kofaktorer eller proteiner av intresse kan läggas till GR • hsp90 heterocomplex beredning blandning, som beskrivs i steg 4 i protokollet, för att observera effekter på steroider bindande, heterocomplex protein-protein interaktioner och co-faktor krav. Till exempel kan effekterna av ischemi-reperfusion på hsp90 funktion modelleras med tillägg av ökande koncentrationer av en reaktiva syreradikaler. Renade proteiner med en viss funktion (t.ex. acetylerade hsp90) eller potentiella hsp90-hämmare (t.ex. romanen geldanamycin analoger) kan läggas till för att deras effekter på steroider bindande och heterocomplex bildning som skall fastställas.
Nedströms analyser annorlunda än elektrofores, kan western blotting, och steroid bindande analyser också användas. Till exempel har immunoprecipitated Multiproteinkomplex varit analyseras med flödescytometri med betydande framgång 18,19. Den immunoadsorbed GR • hsp90 komplex kan också analyseras för hsp90/hsp70 nukleotid stat eller visualiseras med atomkraftsmikroskopi 17. Hsp90 klient proteiner än GR kan användas (t.ex. chaperoning jag checkpoint kinas (Chk1) 20), och nyskapande forskning har bedrivits med hjälp av olika varianter av detta protokoll med östrogenreceptorn, progesteron-receptorn, och SRC 1,13,21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Välj elektrofores reagenser och bildanalys programvara som lämnades av Bio-Rad.
Acknowledgments
Detta arbete har finansierats av National Institutes of Health bidrag GM086822, Hope Heart Institute Basic Sciences utmärkelse, och MJ Murdock Charitable Trust College Science Research Program. Välj elektrofores reagenser och bildanalys programvara har generöst tillhandahållits av Bio-Rad.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sf9 insect cells | Invitrogen | for baculovirus expression of recombinant mouse GR | |
| L929 cells | ATCC | CRL-2173 | for endogenous mouse GR cytosol preparation (alternative to baculovirus expression) |
| FiGR hybridoma cells | ATCC | CRL-2173 | for preparing ascites containing anti-GR monoclonal antibody (alternative to purified BuGR2 antibody) |
| Complete-Mini protease inhibitor, EDTA-free | Roche Group | 11836170001 | |
| protein A-Sepharose | Sigma-Aldrich | P3391 | |
| rabbit reticulocyte lysate | Green Hectares (Oregon, WI) | rich source of endogenous hsp90/hsp70 chaperone machinery | |
| creatine phosphokinase | Sigma-Aldrich | C3755 | for ATP-regenerating system |
| phosphocreatine | Sigma-Aldrich | P7936 | for ATP-regenerating system |
| anti-GR mouse monoclonal antibody (BuGR2) | Pierce, Thermo Scientific | MA1-510 | used for GR immunoadsorption and as primary antibody in western blotting |
| anti-hsp90 mouse monoclonal antibody (AC88) | Enzo Life Sciences | ADI-SPA-830 | used as primary antibody in western blotting |
| anti-hsp70 mouse monoclonal antibody (N27F3-4) | Enzo Life Sciences | ADI-SPA-820 | used as primary antibody in western blotting |
| IgG from mouse serum | Sigma-Aldrich | 038K7690 | used as nonimmune antibody for negative control of immunoadsorption |
| anti-mouse IgG-peroxidase conjugate | Sigma-Aldrich | A4416 | used as secondary antibody in western blotting |
| Experion microfluidic electrophoresis system | Bio-Rad | 7007001 | alternative to conventional SDS-PAGE |
| [1,2,4,6,7-3H] dexamethasone | PerkinElmer, Inc. | NET1192001MC | follow safety precautions |
References
- Pratt, W. B., Toft, D. O. Regulation of signaling protein function and trafficking by the hsp90/hsp70-based chaperone machinery. Exp. Biol. Med. 228, 111-133 (2003).
- Murphy, P. J. M. Regulation of glucocorticoid receptor steroid binding and trafficking by the hsp90/hsp70-based chaperone machinery: implications for clinical intervention. Leukemia. 19, 710-712 (2005).
- Pratt, W. B., Morishima, Y., Osawa, Y. The Hsp90 chaperone machinery regulates signaling by modulating ligand binding clefts. J. Biol. Chem. 283, 22885-22889 (2008).
- Dittmar, K. D., Hutchison, K. A., Owens-Grillo, J. K., Pratt, W. B. Reconstitution of the steroid receptorhsp90 heterocomplex assembly system of rabbit reticulocyte lysate. J. Biol. Chem. 271, 12833-12839 (1996).
- Morishima, Y. The Hsp organizer protein hop enhances the rate of but is not essential for glucocorticoid receptor folding by the multiprotein Hsp90-based chaperone system. J. Biol. Chem. 275, 6894-6900 (2000).
- Murphy, P. J. M., Kanelakis, K. C., Galigniana, M. D., Morishima, Y., Pratt, W. B. Stoichiometry, abundance, and functional significance of the hsp90/hsp70-based multiprotein chaperone machinery in reticulocyte lysate. J. Biol. Chem. 276, 30092-30098 (2001).
- Dittmar, K. D., Pratt, W. B. Folding of the glucocorticoid receptor by the reconstituted Hsp90-based chaperone machinery. The initial hsp90.p60.hsp70-dependent step is sufficient for creating the steroid binding conformation. J. Biol. Chem. 272, 13047-13054 (1997).
- Kanelakis, K. C. Differential effects of the hsp70-binding protein BAG-1 on glucocorticoid receptor folding by the hsp90-based chaperone machinery. J. Biol. Chem. 274, 34134-34140 (1999).
- Morishima, Y., Kanelakis, K. C., Murphy, P. J. M., Shewach, D. S., Pratt, W. B. Evidence for iterative ratcheting of receptor-bound hsp70 between its ATP and ADP conformations during assembly of glucocorticoid receptor.hsp90 heterocomplexes. Biochemistry. 40, 1109-1116 (2001).
- Murphy, P. J. M. Pifithrin-alpha inhibits p53 signaling after interaction of the tumor suppressor protein with hsp90 and its nuclear translocation. J. Biol. Chem. 279, 30195-30201 (2004).
- Murphy, P. J. M., Morishima, Y., Kovacs, J. J., Yao, T. P., Pratt, W. B. Regulation of the dynamics of hsp90 action on the glucocorticoid receptor by acetylation/deacetylation of the chaperone. J. Biol. Chem. 280, 33792-33799 (2005).
- Morishima, Y., Murphy, P. J. M., Li, D. P., Sanchez, E. R., Pratt, W. B. Stepwise assembly of a glucocorticoid receptorhsp90 heterocomplex resolves two sequential ATP-dependent events involving first hsp70 and then hsp90 in opening of the steroid binding pocket. J. Biol. Chem. 275, 18054-18060 (2000).
- Pratt, W. B., Toft, D. O. Steroid receptor interactions with heat shock protein and immunophilin chaperones. Endocr. Rev. 18, 306-360 (1997).
- Bodwell, J. E. Identification of phosphorylated sites in the mouse glucocorticoid receptor. J. Biol. Chem. 266, 7549-7555 (1991).
- Penna, A., Cahalan, M. W. estern Blotting using the Invitrogen NuPage Novex Bis Tris minigels. J. Vis. Exp. (7), e264-e264 (2007).
- Choo, Y. S., Zhang, Z. Detection of Protein Ubiquitination. J. Vis. Exp. (30), e1293-e1293 (2009).
- Murphy, P. J. M. Visualization and mechanism of assembly of a glucocorticoid receptor•Hsp70 complex that is primed for subsequent Hsp90-dependent opening of the steroid binding cleft. J. Biol. Chem. 278, 34764-34773 (2003).
- Schrum, A. G. High-sensitivity detection and quantitative analysis of native protein-protein interactions and multiprotein complexes by flow cytometry. Sci STKE. 389, pl2-pl2 (2007).
- Davis, T. R., Schrum, A. G. IP-FCM: Immunoprecipitation Detected by Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (46), e2066-e2066 (2010).
- Felts, S. J., Karnitz, L. M., Toft, D. O. Functioning of the Hsp90 machine in chaperoning checkpoint kinase I (Chk1) and the progesterone receptor (PR). Cell Stress Chaperones. 12, 353-363 (2007).
- Cintron, N. S., Toft, D. Defining the requirements for Hsp40 and Hsp70 in the Hsp90 chaperone pathway. J. Biol. Chem. 281, 26235-26244 (2006).
