Summary
Un mode tapping microscope à force atomique (AFM) Méthode pour la visualisation de l'ADN plasmidique, protéines cytoplasmiques et complexes ADN-protéine est décrite. La méthode comprend d'autres approches pour la préparation d'échantillons pour l'imagerie AFM après manipulation biochimique. Spécifiques d'ADN contenant les régions interacting protein sont observées dans des conditions quasi-tampon physiologique.
Abstract
La microscopie à force atomique (AFM) permet de visualiser des protéines individuelles, les molécules d'ADN, complexes protéine-protéine et complexes ADN-protéine. Sur la fin du cantilever le microscope est une sonde à l'échelle nanométrique, qui traverse des zones d'image allant du nanomètre au micromètre, mesurer l'élévation de macromolécules reposant sur la surface du substrat en un point donné. Les forces électrostatiques provoquer des protéines, des lipides et acides nucléiques à vaguement se fixent au substrat dans des orientations aléatoires et permettent d'imagerie. Les données générées ressembler à une carte topographique, où les macromolécules régler en trois dimensions des particules de tailles discrètes (Figure 1) 1,2. Exploiter le mode AFM implique l'oscillation répétée du cantilever, qui permet l'imagerie de biomatériaux relativement mous tels que l'ADN et des protéines. Un des avantages notables de l'AFM sur les autres techniques de microscopie nanométrique est son adaptabilité par rapport à visualiser des protéines individuelles et des complexes macromoléculaires dans des tampons aqueux, y compris la quasi physiologique conditions tamponnées, en temps réel, et sans coloration ou un revêtement de l'échantillon à imager.
La méthode présentée ici décrit l'imagerie de l'ADN et un facteur de transcription immunoadsorbed (c'est à dire le récepteur des glucocorticoïdes, GR) en solution tamponnée (figure 2). Protéines et des complexes protéiques Immunoadsorbed peut être séparée de la immunoadsorbing anticorps perles pastilles par la concurrence avec l'épitope d'anticorps et ensuite imagé (figure 2A). Cela permet une manipulation biochimique des biomolécules d'intérêt avant d'imagerie. Une fois purifié, l'ADN et les protéines peuvent être mélangés et le complexe de l'interaction qui en résulte peut être imagée ainsi. La liaison de l'ADN pour le mica exige un cation divalent 3, tel que Ni 2 + ou Mg 2 +, qui peuvent être ajoutés aux tampons d'échantillon tout en maintenant l'activité des protéines. En utilisant une approche similaire, l'AFM a été utilisée pour visualiser les différentes enzymes, dont l'ARN polymérase 4 et 5 une enzyme de réparation, lié à des brins d'ADN individuelles. Ces expériences fournissent un aperçu significatif de la protéine-protéine et ADN-protéines interactions biophysiques ayant lieu au niveau moléculaire. Particules macromoléculaires Imaging individuels avec l'AFM peut être utile pour déterminer l'homogénéité des particules et pour identifier la disposition physique des éléments constitutifs des particules imagée. Bien que la méthode actuelle a été développée pour la visualisation des complexes de protéines chaperonnes GR-brins 1,2 et d'ADN à laquelle le GR peuvent se lier, il peut être largement appliquée à l'ADN et des échantillons de protéines d'imagerie à partir de diverses sources.
Protocol
1. Préparation des échantillons d'ADN et de protéines à imager exempt de contaminants
- Isoler des biomolécules à imager et le placer dans un tampon aqueux adéquat. Protéines à imager peut être purifié en utilisant la chromatographie liquide 6, immunoadsorption suivie par l'élimination des anticorps et des granulés 1,2, ou la purification Profinity exact et 7 tag retrait (figure 2A). Isoler les molécules d'ADN à imager par purification miniprep (figure 2B).
- Confirmer la composition et la pureté des échantillons de protéines pour être imagées par SDS-PAGE et Western blot. Pour l'ADN, de confirmer la séquence et la pureté en remplissant une restriction et de digérer l'électrophorèse sur gel d'agarose.
- Incuber les échantillons dans un tampon d'adsorption AFM pour promouvoir l'adhésion de l'échantillon à mica. Pour les échantillons de protéines, 10 mM de tampon HEPES peuvent être utilisés. D'autres sels de faible force ionique ou des cofacteurs d'autres peuvent être ajoutés aussi bien. Pour des échantillons d'ADN, notamment un cation divalent (par exemple Mg 2 + ou Ni 2 +) de promouvoir l'adsorption sur le substrat de mica. Une Mg 2 + adaptée tampon contenant de l'ADN est de 10 mM Tris, pH 7,5, NaCl 10 mM, MgCl2 2 mM 3. Une alternative Ni 2 + est de tampon HEPES 10 mM, pH 6,8, 10 mM de NiCl 2.
- Diluer l'échantillon à une concentration de 5 ug / ml dans le tampon d'adsorption. Mélanger délicatement. Store sur la glace tandis que le microscope est en cours de préparation.
2. Montage de sonde AFM
- Placez le porte-cellule liquide sonde sur la station d'accueil en porte à faux d'installation correspondant.
- Repérez la longue, épaisse en porte à faux (appelé cantilever 'B') du levier de nitrure de Sharp (SNL) sonde d'être utilisés pour l'imagerie. Soigneusement transfert au titulaire de la sonde cellule liquide, en s'assurant que la pointe reste debout. Note technique: Un soin extrême doit être payé alors que la sonde est en transit, car il tomber de n'importe quelle hauteur peut endommager ou détruire le cantilever ou à l'extrémité. Un microlever SNL (MSNL) sonde peut être utilisée comme une alternative à la sonde de SNL.
- Retirez le support de sonde à partir de la station d'accueil et d'examiner le cantilever sous un microscope à lumière pour s'assurer qu'il est intact et correctement dans le porte-sonde cellule liquide.
- Retirez délicatement la tête AFM de l'assemblage en queue d'aronde instrument en serrant la vis à tête moletée pince. Note technique: Un soin extrême doit être payé tout en manipulant la tête AFM, comme il chutant de même sur une courte distance (par exemple si elle n'est pas correctement installé dans l'assemblage en queue d'aronde) peut causer des dommages importants.
- Inverser la tête de l'AFM et poussez fermement le porte cellule liquide sonde sur les quatre broches à la base de la tête de l'AFM. Soigneusement retourner la tête AFM dans l'assemblage en queue d'aronde instrument. Desserrer la vis moletée pince pour fixer la tête AFM dans l'instrument.
3. Localisation de la pointe en porte à faux, en alignant au laser, et en ajustant photodétecteur
- Utilisation du logiciel de l'instrument AFM, localiser l'extrémité en porte à faux en déplaçant les boutons du microscope optique à bord. Régler l'éclairage du microscope si nécessaire pour améliorer l'identification pointe. Apportez la fin de la pointe en porte à faux dans la proximité de la ligne de mire affichée sur le logiciel de l'instrument.
- Apportez la pointe en porte à faux en lumière en ajustant les flèches haut et bas du contrôleur optique sur le logiciel. Utilisez lente (S) ou moyen (M) tout en ajustant la vitesse de l'optique.
- Aligner le laser à la pointe en porte à faux en utilisant les boutons de réglage laser. Déplacer les boutons de réglage jusqu'à ce que le point rouge laser est à l'intérieur du spot éclairage blanc. Trace le long du bras cantilever, avec un zig-zag jusqu'au laser est positionné sur la pointe cantilever. Lorsqu'il est correctement aligné, un endroit de réflexion forte apparaîtra dans la fenêtre avant de la tête de l'AFM.
- Centre du photodétecteur en ajustant les boutons photodétecteur sur la tête de l'AFM. Ce sera d'aligner le point laser dans le collimateur de l'affichage photodétecteur du logiciel de l'instrument. La somme du signal observée devrait être d'environ 4-6.
4. Positionnement AFM tête et en porte à faux tuning
- Placez une feuille de mica fraîchement clivé attaché à un disque métallique spécimen de l'AFM sur le porte-échantillon magnétisé au sommet de la plaque de support de l'AFM. Cette configuration sera utilisée pour positionner la tête de l'AFM avant d'imagerie de l'échantillon ADN ou de protéines préparés à l'étape 1.
- Note technique: Le porte-échantillon aimanté et support de sonde de liquide de cellules sont plus épaisses que d'autres échantillons de fixation des mécanismes et des détenteurs de la sonde. S'il ya actuellement un jeu insuffisant entre l'ensemble porte-échantillon de mica et de la tête AFM, déplacer la tête de l'AFM en sélectionnant l'icône de retirer le logiciel de l'instrument à plusieurs reprises.
- Tournez la plaque porte-AFM de sorte que le disque de spécimen est positionné pour l'imagerie initiale. S'assurer que le substrat de mica est centrée sous la tête de l'AFM.
- Déplacez la tête vers le bas vers l'AFMsurface du disque de mica-éprouvette en utilisant le contrôle de surface se concentrer sur le logiciel de bord. Sélectionnez le moyen (M) la vitesse du moteur Z, et continuer vers la surface jusqu'à ce que la tête de l'AFM est d'environ 2 mm au dessus du mica. À ce moment, basculer vers l'utilisation de la lente (S) Z moteur à vitesse afin d'éviter le contact brutal entre la sonde et la surface (appelée s'écraser la pointe).
- Passez à déplacer la sonde près de la surface jusqu'au substrat de mica caractéristiques distinctes sur la surface de mica ou de pointe de la réflexion sont au point. Basculer entre la surface et les avions de réflexion pointe de focale en utilisant le "accent sur:« l'icône du logiciel de l'instrument.
- Sélectionnez l'icône du logiciel mélodie de l'instrument et régler le cantilever. La fréquence de résonance de la BN recommandées et les sondes sont en porte à faux MSNL kHz 20-60. Sélectionnez un pic de 5% de décalage. Note technique: tuning cantilever adéquat est essentiel pour l'imagerie d'échantillon adéquate.
5. Surface de l'échantillon de mica Imaging
- Engager la sonde sur la surface du mica. Définir la taille du scan initial à 10 um et le taux de balayage à 1 Hz. Gain intégral et gain proportionnel peut être initialement fixé à 0,2 et 0,4, respectivement. Ajustez les gains que nécessaire afin d'avoir de trace et retrace à peu près scans se chevauchent. La diminution de la consigne d'amplitude va augmenter l'interaction entre la sonde et le mica et s'assurer de l'engagement.
- Capture d'images scan complet du champ 10 um. Diminuer la taille du scanner à 5, 1 et 0,5 um et de capturer des images complètes de chaque champ. Ajustez les gains et les taux de balayage nécessaire. Capturer des images de la surface du mica fournit une base de comparaison à l'ADN et des protéines contenant des échantillons.
- Dégagez la sonde avec un simple clic sur l'icône se désengager sur le logiciel de bord.
6. Biomolécules d'intérêt Imaging
- Mélanger délicatement l'ADN ou des protéines de l'échantillon préparé à l'étape 1 et de préparer pour la charger sur la surface du mica imager. Mélanger 5 pl de l'échantillon préparé avec 45 ul d'adsorption tampon frais (concentration finale de l'échantillon = 0,5 pg / ml).
- Soigneusement ajouter 50 ul de l'0,5 mg / ml solution contenant des biomolécules directement sur la surface du mica. Pour ce faire, sans bouger la sonde ou la tête AFM, et garantir la solution de l'échantillon (mais pas de pipette) est en contact avec la sonde.
- Pause 5 minutes pour permettre à des biomolécules dans l'échantillon d'adhérer à la surface du mica.
- A l'issue de 5 minutes, une pipette supplémentaires 50-100 ul de tampon d'adsorption dans le support de sonde cellule liquide en faisant attention de ne pas toucher la sonde, la tête AFM, ou du mica avec la pipette. Cela formera un ménisque et de permettre l'AFM en mode d'imagerie tapant dans le liquide. La figure 3 montre l'arrangement final de la cellule fluide, cantilever, des échantillons, porte-échantillon, et le ménisque.
- Réajuster le photodétecteur et réaligner le laser pour le cantilever, si nécessaire. Note technique: la visualisation de l'extrémité de la sonde et l'alignement au laser est compliquée en raison de la diffraction causée par l'ajout de tampon d'échantillon dans le porte-sonde. Manuellement réaccorder l'encorbellement, si nécessaire.
- Réengager la sonde en utilisant le logiciel de l'instrument. Réglez la déviation verticale, gain intégral, et le gain proportionnel, si nécessaire. Ceci lancera le processus de re-imagerie de la section de mica numérisés précédant immédiatement l'échantillon d'ajouter et de capturer des images.
- Augmenter la taille de balayage (500 nm-10 um) pour identifier les régions d'intérêt. Zoom-in et de réduire les taux de balayage à 0,5 Hz afin d'améliorer la résolution d'image
- Une fois que l'imagerie est terminée, la sonde se désengager en sélectionnant l'icône de retirer le logiciel de l'instrument à plusieurs reprises. Assurer un dégagement suffisant entre la tête de l'AFM et le disque éprouvette avant le démontage de la cellule de liquide ou de platine.
- Bien rincer le porte-cellule liquide sonde et le disque échantillon avec de l'eau distillée pour éviter la formation de cristaux de sel que résiduelle s'évapore tampon d'adsorption. Sec à l'air comprimé.
7. Les résultats représentatifs:
Exemples d'images AFM sont présentées dans la figure 4. Substrat de mica (A) fournit une surface plane sur laquelle moléculairement ADN et les protéines peuvent adsorber. Imagerie de mica avant échantillons de biomolécules fournit un contrôle négatif et évaluation du bruit d'imagerie. Il fournit également un niveau d'assurance que le cantilever est bien réglé et l'imagerie de l'échantillon ultérieures seront couronnés de succès. Double brin d'ADN plasmidique (B, D), par présomption superenroulé, est facilement identifiable par son aspect asymétrique et uniformes déposer sur le substrat de mica précédemment banale. Complexes protéiques de tailles de particules discrètes (C, E) sont aussi particulièrement distingués dans le substrat de mica. La taille des particules différences indiquent une hétérogénéité de l'échantillon, et peut être utile de rapprocher stoechiométrie complexe protéique ou d'une activité biochimique. La forme générale de diagonale et d'orientation cohérente de la ProTEIN particules observées dans le Panneau de C est un artefact d'imagerie, comme les protéines serait expectedly être orientée sur le substrat de mica de façon aléatoire. Les causes possibles de l'artefact observée est une anomalie ou physiques pointe de l'imagerie AFM à une trop rapide d'une fréquence de balayage. Bien convolution de la pointe (illustré à la figure 1B) empêche absolue des calculs de mesure de longueur dans les axes x et y, mesure de la hauteur (axe Z) et x relative et les mesures y peut néanmoins être utile pour estimer les propriétés biophysiques des biomolécules imagée.
Figure 1: Représentation schématique du mode de microscopie à force tapant atomique (AFM). A, le microscope. A la fin du cantilever est une pointe acérée qui oscille de haut en bas comme il scanne la surface d'un substrat de mica à laquelle biomoléculaire complexes adsorber. Comme le scanner se déplace dans les directions X et Y, un faisceau laser est réfléchi par l'arrière du cantilever sur une position sensible à photodiode à cartographier la verticale (z) la distance de la pointe se déplace comme il passe sur les complexes biomoléculaires assis sur le mica. Distorsion B. de l'image dans les directions x et y causée par convolution de la pointe. Le rayon nominal d'une pointe de nitrure de silicium conventionnelles est plus grand que les particules à imager, et le bord de la pointe de contacts de l'échantillon comme il traverse la surface. Résultats de convolution de la pointe dans les particules imagées apparaissant dans les grandes directions X et Y, mais pas la direction z. Cet effet peut être minimisé par l'utilisation de pointes avec un rayon de pointe nominal inférieur.
Figure 2: Illustration de la protéine immunoadsorbed et préparation des échantillons d'ADN. Un communiqué de GR immunoadsorbed • complexes protéine Hsp70 de l'anticorps monoclonal (mAb)-protéine A-Sepharose (PAS) de granules. L'incubation de la immunopellet avec un peptide contenant l'épitope MAB faciliter la libération de la GR complexes protéine Hsp70 • à partir du culot, permettant au complexe pour être collectées à partir du surnageant et visualisée par l'AFM. B, Préparation de l'ADN pour l'imagerie AFM nécessite l'utilisation d'un tampon d'adsorption cations divalents. Le cation divalent augmente l'affinité de l'ADN pour le substrat de mica.
Figure 3: Disposition finale de la tête de l'AFM, le liquide cellulaire porte-sonde, échantillon, porte-échantillon, et le ménisque tampon. Un soin, doivent être prises au moment du dépôt de l'échantillon et de tampon supplémentaire sur le substrat de mica pour éviter tout contact physique entre l'embout de la pipette et la tête AFM, appelez liquide, et le substrat de mica. B, agrandissement de A. Le ménisque tampon s'étend de la platine au titulaire de sonde cellule liquide.
Figure 4: Micrographies à force atomique d'un substrat de mica (A), 2xGal4-2xGRE-luciferease ADN plasmidique 8 (B, D), et GR • Les complexes protéine Hsp70 (C, E) dans une solution tamponnée. Mica sert comme une image de contrôle à comparer avec les visualisations de l'ADN et de protéines. GR complexes • protéine Hsp70 ont été préparés par immunoadsorption du GR amorcée avec hsp70, puis libérés à partir du culot d'anticorps-billes à l'aide d'un anticorps monoclonal concurrentes (illustré à la figure 2A). L'ADN a été préparé par miniprep plasmide conventionnel. Panneaux A, B et C sont d'un grossissement équivalent (barres d'échelle = 200 nm), comme des panneaux D et E (barres d'échelle = 40 nm).
Discussion
AFM offre une technique unique microscopiques capables d'imagerie individuelles biomolécules non couchés en solution aqueuse et quasi-physiologiques des solutions tamponnées en temps réel. Cela permet la visualisation des protéines et des molécules individuels d'ADN, ainsi que des complexes multiprotéiques et de complexes protéine-ADN. Particules macromoléculaires Imaging avec l'AFM peut être utile pour évaluer l'homogénéité des échantillons et d'identifier la disposition physique des éléments constitutifs des particules observées. Cette approche de l'observation des particules macromoléculaires individu peut être un complément utile aux techniques biochimiques classiques, tels que des essais d'immunoprécipitation, électrophorèse sur gel de polyacrylamide, et chromatographie sur colonne d'exclusion de taille, qui fournissent d'importantes données sommatives représentant les 3 10 -10 11 complexes biomoléculaires individuelle d'intérêts présents dans un échantillon.
La recherche sur stoechiométrie multiprotéiques complexes, les interactions biomoléculaires, et les exigences de cofacteur peuvent tous être étudiés à l'aide de l'AFM. La méthode présentée ici peut être adapté pour accueillir des questions spécifiques d'intérêt biophysiques. Par exemple, en utilisant un porte-cellule liquide sonde capable d'échanger des tampons, il est possible d'exigences cofacteur de dosage pour la formation des protéines complexes. ADN-protéines assemblées peut être formé et dissocié en quasi-temps réel et même en étant imagé. L'ADN peut être généré avec des séquences spécifiques d'intérêt (par exemple un des éléments de réponse ou présumée séquence de la protéine nouvelle liaison), mélangé avec la protéine liant l'hypothèse, et imagé de fournir des preuves directes des interactions intermoléculaires.
Tapping AFM en mode d'imagerie est beaucoup moins compliquée si les échantillons secs sont utilisés plutôt que des échantillons dans des solutions aqueuses, et stands d'ADN linéaire et plasmides d'ADN fermé cercle ont tous deux été imagé de cette manière 3,9. La méthode présentée ici utilise des échantillons dans des solutions tamponnées afin de fournir un environnement d'imagerie plus physiologique. D'autres méthodes d'imagerie remarquable de protéines doivent également être envisagées, y compris à proximité de microscopie en champ infrarouge 10. L'utilisation complémentaire de immunoadsorption de consort avec l'AFM fournit une occasion de préparer une myriade de complexes protéiques, en utilisant des techniques bien établies biochimiques, puis de les visualiser après la sortie de l'immunoadsorbing anticorps perles granulés. Par exemple, GR immunoadsorbed a été testé pour son association avec la protéine chaperon moléculaire hsp70 1 ainsi que la protéine dynéine moteur 2 en utilisant cette approche afin d'estimer la taille et la complexité stoechiométries. La taille des particules et des caractéristiques biophysiques (rigidité, par exemple) ont été utiles pour déterminer l'identité des biomolécules observé dans les échantillons AFM imagé 11,12. Il est également possible de confirmer l'identité de biomolécules par l'ajout d'une biomolécule interagir (par exemple un ligand ou un anticorps monoclonal), qui se lient à sa cible et provoquer une augmentation de la taille des particules, si la biomolécule cible est présente.
Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Ce travail a été financé par les Instituts nationaux de la santé Grant GM086822. Les auteurs tiennent à remercier les Drs. Alec Pakhomov & Paul Wallace (Univ. de l'installation de Washington utilisateur nanotechnologie (NTUF)) et Andrea Slade (Bruker AXS) pour leur assistance technique d'experts. L'ADN a été effectué l'imagerie AFM à l'Univ. de Washington NTUF, un membre du Réseau National Nanotechnology Infrastructure. Le plasmide 2xGal4-2xGRE-luciferease a été aimablement fourni par le laboratoire du Dr Keith Yamamoto (Univ. de Californie, San Francisco).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dimension 3100 | Bruker Corporation | Dimension 3100 | |
| Dimension Fluid Cell | Bruker Corporation | DTFML-DD-HE | |
| Sharp nitride lever (SNL) silicon nitride AFM probe | Bruker Corporation | SNL-10 | |
| Microlever sharp nitride lever (MSNL) silicon nitride AFM probe | Bruker Corporation | MSNL-10 | |
| NanoScope AFM instrument software | Bruker Corporation | 004-132-000 | |
| Metal AFM specimen discs | Ted Pella, Inc. | 16208 | |
| Grade V1 Mica Discs, 12 mm | Ted Pella, Inc. | 50-12 |
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