Summary
플라스미드 DNA, 세포질 단백질과 DNA - 단백질 단지의 시각화를위한 감청 모드 원자 힘 현미경 (AFM) 방법을 설명합니다. 방법은 다음과 같은 생화 학적 조작 AFM 이미징을위한 샘플을 준비 대체 방법을 제공합니다. 특정 단백질 상호 작용하는 지역을 포함하는 DNA는 거의 physiologic 버퍼 조건에서 관찰됩니다.
Abstract
원자 힘 현미경 (AFM)은 각각의 단백질, DNA 분자, 단백질 - 단백질 단지, 그리고 DNA - 단백질 단지의 시각을 허용합니다. 현미경의 캔틸레버의 끝에 나노미터에서 micrometers에 이르기까지 탐색 이미지 영역, 특정 시점에서 기판 표면에 휴식 macromolecules의 고도를 측정하는 나노 스케일 프로브가 있습니다. 정전 세력은 느슨하게 무작위 방향으로 기판에 연결하여 영상을 허용하기 위해 단백질, lipids 및 핵산의 원인이됩니다. 생성된 데이터는 macromolecules가 개별 크기 (그림 1) 1,2 세 가지 차원 입자로 해결 지형도, 유사. 태핑 모드 AFM은 DNA와 단백질과 같은 비교적 부드러운 biomaterials의 이미징을 허용 캔틸레버의 반복 진동을 포함합니다. 다른 nanoscale 현미경 기술을 통해 AFM의 주목할만한 장점 중 하나는 실시간으로, 그리고 얼룩이나 코팅 군데로 샘플 않고 가까운 physiologic 버퍼링 조건을 포함한 수성 버퍼, 내의 개별 단백질 및 macromolecular의 단지를 시각화하기 위해 상대적으로 적응성입니다.
여기서 제시하는 방법은 DNA와 버퍼링 솔루션에 immunoadsorbed 전사 인자 (예 : 글루코 코르티 코 이드 수용체, GR) (그림 2)의 이미지에 대해 설명합니다. Immunoadsorbed 단백질과 단백질 단지는 항체 에피토프와 (그림 2A)가 몇 군데와 경쟁하여 immunoadsorbing 항체 - 비드 펠렛 분리 수 있습니다. 이것은 이전 이미지의 관심 biomolecules의 생화학 조작을 허용합니다. 일단 정제, DNA와 단백질을 혼합 수 있으며 결과 상호 작용하는 복합은 물론 몇 군데하실 수 있습니다. 미카에게 DNA의 바인딩이 같은 니켈이 같은 이가의 양이온 3, 필요 + 또는 MG이 단백질의 활동을 유지하고 아직 샘플 버퍼에 추가할 수 있습니다 +. 비슷한 접근법을 사용, AFM은 개인의 DNA 가닥에 바인딩된 RNA 효소 4 수리 효소 5 포함한 개인 효소를 시각화하기 위해 활용되었습니다. 이러한 실험은 단백질 단백질 및 분자 수준에서 일어나는 DNA - 단백질 상호 작용에 중요한 biophysical 통찰력을 제공합니다. AFM과 이미징 개별 macromolecular 입자는 입자 균질성를 결정하고 몇 군데 입자의 구성 요소의 물리적인 배열을 식별하는 데 유용할 수 있습니다. 현재 메서드가 GR가 바인딩할 수있는 GR - 보호자 단백질 단지 1,2와 DNA 가닥의 시각화를 위해 개발되었습니다 있지만, 그것은 다양한 소스로부터 영상 DNA와 단백질 샘플에 널리 적용할 수 있습니다.
Protocol
1. 오염 물질 무료 군데로 준비 DNA와 단백질 샘플
- 적당한 수성 버퍼에 몇 군데 장소로 biomolecules를 분리. 몇 군데로 단백질이 액체 크로마 토그래피 6을 사용 정화 수도 immunoadsorption는 항체와 펠렛 1,2 제거 또는 Profinity 정확한 정화 및 태그 제거 7 (그림 2A)으로 따라갔다. miniprep 정화 (그림 2B)에 의해 몇 군데로의 DNA 분자를 분리.
- SDS - PAGE와 모래 바닥 서부를 사용하여 몇 군데로 단백질 샘플의 구성과 순도를 확인합니다. DNA 들어, 제한 다이제스트와 아가로 오스 겔 전기 영동을 작성하여 시퀀스와 순결을 확인합니다.
- 운모에 대한 샘플의 이행을 촉진하기 위해 AFM 흡착 버퍼에 샘플을 품어. 단백질 샘플의 경우, 10 MM의 HEPES 버퍼는 사용할 수 있습니다. 추가 낮은 이온 강도 소금이나 기타 cofactors은 잘 추가할 수 있습니다. DNA 샘플의 경우, 이가의 양이온 (예 : MG 2 + 또는 니켈 2 +) 운모 기판에 흡착을 촉진합니다.을 포함 DNA에 적합한 MG 2 + 함유 버퍼 10 MM 트리스, 산도 7.5, 10 MM NaCl, 2 MM MgCl 2 3입니다. 대안 니켈 2 + 버퍼 10 MM HEPES, pH를 6.8, 10 MM NiCl 2.
- 5 μg / 흡착 버퍼 ML의 농도에 샘플을 희석. 부드럽게 섞는다. 현미경이 준비되는 동안 얼음에 보관하십시오.
2. 장착 AFM 프로브
- 해당 캔틸레버 설치 도킹 스테이션에 액체 세포 프로브 홀더를 놓습니다.
- 이미징에 사용되는 날카로운 질화물 레버 (SNL) 프로브의 긴 두꺼운 캔틸레버를 ( 'B'캔틸레버로 함) 찾습니다. 조심스럽게 그것은 끝이 직립 유지 보장, 액체 세포 프로브 홀더에 전송할 수 있습니다. 기술 참고 : 탐사선이 전송되는 동안 익스 트림 케어 어떤 높이에서 드롭으로 지불되어야합니다 캔틸레버 또는 팁을 손상되거나 파괴 수 있습니다. microlever SNL (MSNL) 프로브는 SNL 프로브의 대안으로 사용할 수 있습니다.
- 도킹 스테이션에서 프로브 홀더를 제거하고 온전하고 제대로 액체 세포 프로브 홀더에 장착하기 위해 가벼운 현미경 캔틸레버를 검사하십시오.
- 조심스럽게 널드 머리 클램프 나사를 강화하여 악기 도브 테일 어셈블리에서 AFM 헤드를 제거합니다. 기술 참고 : AFM의 머리를 조종하면서 익스 트림주의가 심지어 짧은 거리 (도브 테일 어셈블리에서 제대로 자리하지 않을 경우 등)에서 드롭으로 지불되어야합니다 실질적인 손상을 줄 수 있습니다.
- AFM의 머리를 반전 단단히 AFM 헤드의 기본에있는 4 개의 핀이에 액체 세포 프로브 홀더를 밀어. 조심스럽게 악기 도브 테일 어셈블리에 AFM의 머리를 반환합니다. 악기에 AFM의 머리를 고정하기 위해 널드 머리 클램프 나사를 놓습니다.
3. , 캔틸레버 팁 찾기 레이저를 정렬하고, 광검출기을 조정
- AFM 악기 소프트웨어를 사용하여 온보드 라이트 현미경의 손잡이를 이동하여 캔틸레버 끝부분을 찾습니다. 필요한 경우 팁 식별을 개선하기 위해 현미경의 조명을 조정합니다. 악기 소프트웨어에 표시되는 주목의 가까이에 캔틸레버 팁의 끝을 가져와.
- 소프트웨어에 광학 컨트롤러의 위쪽 및 아래쪽 화살표를 조정하여 초점에 캔틸레버 팁을 가져와. 광학를 조정하면서 느린 (S) 또는 중간 (M) 속도를 사용하십시오.
- 레이저 조정 손잡이를 사용하여 캔틸레버 팁에 레이저를 맞춥니다. 빨간색 레이저 점이 화이트 일루미 네이션 스포트 안에 때까지 조정 손잡이를 이동합니다. 레이저가 캔틸레버 끝에 위치 때까지 지그 - 재그 패턴을 사용하여 캔틸레버 팔을 따라 추적. 제대로 정렬하면 강한 반사 지점은 AFM 머리의 전면 창에 나타납니다.
- AFM의 머리에 광검출기 손잡이를 조정하여 센터 광검출기. 이것은 악기 소프트웨어의 광검출기 디스플레이의 주목을 레이저 점을 정렬합니다. 관찰 신호 합계는 약 4-6한다.
4. 위치 AFM의 머리와 튜닝 외팔보
- AFM 홀더 플레이트 위에 magnetized 샘플 홀더에 금속 AFM의 표본 디스크에 연결된 미카의 신선한 죽습 시트를 놓습니다. 이 설정은 이전 영상 1 단계에서 준비한 DNA 또는 단백질 샘플을하기 위해 AFM 헤드를 위치하는 데 사용됩니다.
- 기술 참고 : magnetized 샘플 홀더 및 액체 세포 프로브 홀더는 메커니즘과 프로브 홀더를 체결 다른 샘플보다 두꺼운 수 있습니다. 미카 - 샘플 홀더 어셈블리 및 AFM 머리 사이에 충분한 정리가 현재있다면, 악기 소프트웨어에 여러 번 철회 아이콘을 선택하여 AFM 헤드를 이동합니다.
- 표본 디스크가 초기 이미징을위한 배치되도록 AFM 홀더 플레이트를 돌리세요. 운모 기판은 AFM의 머리 아래에 중심 있는지 확인합니다.
- 쪽으로 AFM의 머리를 아래로 이동악기 소프트웨어의 초점 표면 컨트롤을 사용하여 미카 - 표본 디스크의 표면. Z 모터에 중간 (M) 속도를 선택하고 AFM 헤드는 운모 위에 약 2mm 때까지 표면을 향해 진행합니다. 이때 프로브와 표면 (팁을 충돌로 함) 사이의 돌발 접촉을 방지하기 위해 느린 (S) Z 모터 속도를 사용하여 전환합니다.
- 운모 표면이나 팁 반사에 별개의 기능은 초점 때까지 가까이 운모 기판 표면에 프로브를 이동하는 진행합니다. 악기 소프트웨어의 아이콘 표면과 "에 초점을"사용 팁 반사 초점 비행기 사이를 전환합니다.
- 악기 소프트웨어에서 조정 아이콘을 선택하고 캔틸레버를 조정. 권장 SNL과 MSNL의 캔틸레버 프로브의 공진 주파수는 20-60의 kHz에서 수 있습니다. 오프셋 5 %의 피크를 선택합니다. 기술 참고 사항 : 적절한 캔틸레버 튜닝은 적절한 샘플 이미징을 위해 필수적입니다.
5. 이미징 미카 샘플 표면
- 운모 표면에 프로브를 참여. 10 μm의 및 스캔 속도 1 Hz로하는 초기 스캔 크기를 설정합니다. 적분 이득과 비례 게인은 처음에는 각각 0.2과 0.4로 설정할 수 있습니다. 추적을하고 조사할 검사는 대략 중복하기 위하여 필요에 따라 이득을 조정합니다. 진폭 설정점 감소하면 프로브와 미카 사이의 상호 작용을 향상시키고 참여를 보장합니다.
- 10 μm의 필드의 전체 스캔 이미지를 캡처합니다. 1, 5 크기를 스캔하고, 0.5 μm의 각 필드의 전체 이미지를 캡처 감소. 필요한 이득 및 스캔 속도를 조정합니다. 미카 표면의 이미지를 캡처하면 DNA와 단백질이 포함된 샘플을 비교 기준을 제공합니다.
- 악기 소프트웨어에 공격 중지 아이콘을 클릭 한 번으로 프로브를 공격 중지.
6. 관심 이미징 biomolecules
- 부드럽게 1 단계에서 준비한 DNA 또는 단백질 샘플을 혼합하여 몇 군데 운모 표면에 그것을 로드할 준비합니다. 신선한 흡착 버퍼 45 μl (최종 샘플 농도 = 0.5 μg / ML)로 준비 샘플 5 μl를 섞는다.
- 조심스럽게 직접 운모 표면에 0.5 μg / ML 생분자 함유 용액 50 μl를 추가합니다. 프로브 또는 AFM의 머리를 움직이지 않고이 작업을 수행하고, (하지만 pipet 팁) 샘플 솔루션을 보장하기는 프로브와 접촉을합니다.
- 일시 정지 5 분 샘플에 biomolecules은 운모 표면을 준수하도록합니다.
- 5 분 pipet 액체 세포 프로브 홀더에 흡착 버퍼의 추가 50-100 μl를 끝 부분에서 프로브, AFM 머리 또는 pipet 팁과 운모를 접촉하지 않도록주의하고. 이것은 초승달 모양을 형성하고 AFM은 액체 모드 이미징을 도청에 대한 수 있습니다. 그림 3은 유체 세포, 캔틸레버, 예제, 샘플 홀더와 초승달 모양의 마지막 정리를 보여줍니다.
- 광검출기를 재조정하고 필요한 캔틸레버에 레이저를 재개. 기술 참고 : 프로브 팁 및 레이저 정렬을보고는 프로브 홀더에 샘플 버퍼를 추가 의한 회절 패턴으로 인해 복잡합니다. 수동으로 필요한 경우, 캔틸레버를 retune.
- 악기 소프트웨어를 사용하여 프로브를 다시 참여. 수직 편향, 적분 이득 및 필요에 따라 비례 게인을 조정합니다. 이것은 미카의 섹션 사전 추가 샘플 및 캡처 이미지를 즉시 스캔을 다시 영상의 과정을 시작합니다.
- 관심 지역을 식별하는 (500 NM - 10 μm의) 스캔 크기를 증가시킵니다. 확대 및 이미지 해상도를 향상시키기 위해 0.5 Hz로 스캔 속도를 감소
- 이미징가 완료되면, 악기 소프트웨어 아이콘을 인출할 여러 번을 선택하여 프로브를 공격 중지. 해체 액체 셀 또는 표본 디스크의 전에 AFM 헤드와 디스크 사이의 표본 충분한 허가를 보장합니다.
- 철저하게 잔여 흡착 버퍼 증발로 성형에서 소금 결정을 방지하기 위해 증류수와 액체 세포 프로브 홀더 및 표본 디스크를 씻어. 압축 공기와 함께 건조.
7. 대표 결과 :
AFM 이미지의 예는 그림 4에 표시하고 있습니다. 미카 기판 (A)은 DNA와 단백질 adsorb 수있는에 molecularly 평평한 표면을 제공합니다. 이전 생분자 샘플로 영상 미카는 이미지 노이즈의 부정적인 관리 및 평가를 제공합니다. 또한 캔틸레버가 올바르게 조정하고 이후의 샘플 영상이 성공적으로 될 것을 보증 수준을 제공합니다. 두 번 좌초 플라스미드 DNA (B, D), presumptively supercoiled는 즉시 이전 unremarkable 운모 기판에 입금의 비대칭 모양과 균일에 의해 식별됩니다. 신중 입자 크기 (C, E)의 단백질 단지는 또한 운모 기판에서 고유하게 구별됩니다. 입자 크기 차이는 샘플 이질을 표시하고, 단백질 복잡한 stoichiometry 또는 생화 학적 활동을 approximating에 유용할 수 있습니다. 프로의 일반 대각선 모양과 일치하는 방향단백질은 expectedly 무작위 방식으로 운모 기판을 지향 될처럼 패널 C에서 관찰 tein 입자는 영상 유물이다. 관찰된 유물의 원인이 신체 이상 팁 또는 스캔 속도가 너무 빠른에서 AFM 이미징입니다. 팁 회선이 (그림 1B에 그림)의 절대 길이 측정 계산을 방지하면서 x와 y의 축, 높이 측정 (Z 축)와 상대적인 x와 y 측정은 몇 군데 biomolecules의 biophysical 속성을 계산에도 불구하고 유용할 수 있습니다.
그림 1 : 모드 원자 힘 현미경 (AFM)을 감청의 도식 표현. A, 현미경. 캔틸레버의 끝에 그것이 운모 기판의 표면을 통해 검사로서 진동 아래 날카로운 조언하는 biomolecular의 단지의 adsorb 수 있습니다. 스캐너는 x와 y 방향으로 움직이면서, 레이저 빔을 그것은에 앉아 biomolecular의 단지 통과로 끝 이동 수직 (Z) 거리를지도로 위치에 민감한 photodiode 검출기에 캔틸레버의 뒷면에서 반사 운모. 팁 회선에 의한 x와 y 방향으로 이미지의 B.의 왜곡. 종래의 실리콘 질화물 팁의 공칭 반경 몇 군데있을 수있는 입자보다 큰이며, 팁 연락처 시료의 가장자리가 탐색 표면으로. 팁 회선의 몇 군데 x와 y 방향의 큰 표시되는 입자가 아니라 Z 방향으로 결과를. 이 효과는 작은 소액의 팁 반경과 팁 사용하여 최소화할 수 있습니다.
그림 2 : immunoadsorbed 단백질과 DNA 샘플 준비의 일러스트. immunoadsorbed GR의, 릴리스 단클론 항체 (mAb) 단백질 A - 세파 로스 (PAS) 펠렛에서 • hsp70 단백질 복합. mAb 에피토프가 들어있는 펩타이드와 immunopellet을 잠복기하면 복잡한는 AFM에 의해 뜨는와 시각에서 수집한 수 있도록, 펠렛에서 GR • hsp70 단백질 복합의 출시를 촉진합니다. B, AFM 이미징을 위해 DNA의 준비는 이가의 양이온 흡착 버퍼를 사용해야합니다. 이가의 양이온은 운모 기판을위한 DNA의 친화력을 증가시킵니다.
그림 3 : AFM 헤드, 액체 세포 프로브 홀더, 샘플, 표본 홀더 및 버퍼 초승달 모양의 최종 정리. pipet 팁 및 AFM 헤드, 액체 전화 및 운모 기판 사이의 물리적 접촉을 피하기 위해 운모 기판에 샘플과 추가 버퍼를 입금하면,주의해야합니다. B, 버퍼 초승달 모양의 액체 세포 프로브 홀더에 표본 디스크에서 펼쳐져 A.의 확대.
그림 4 : 운모 기판의 원자 힘 micrographs (A), 버퍼 용액에 2xGal4 - 2xGRE - luciferease 플라스미드 DNA 8 (B, D) 및 GR • hsp70 단백질 단지 (C, E). 미카는 DNA와 단백질의 시각화와 비교하기 위해 제어 이미지로 제공하고 있습니다. GR • hsp70 단백질 단지는 mAb 경쟁 항체를 (그림 2A에서 그림)를 사용하여 항체 - 비드 펠렛에서 발표 다음 hsp70과 함께 준비하는 GR의 immunoadsorption에 의해 준비되었다. DNA는 종래의 플라스미드 miniprep에 의해 준비되었다. 패널 A, B, 및 C는 동일한 배율 (스케일 바가 = 200 NM)의 아르로 패널 D와 E는 (스케일 바가 = 40 NM)입니다.
Discussion
AFM은 실시간으로 수성과 가까운 physiologic 버퍼 솔루션 이미징 개인 uncoated biomolecules 수있는 독특한 미세 기술을 제공합니다. 이것은 각각의 단백질과 DNA의 분자뿐만 아니라 multiprotein의 단지 및 단백질의 DNA 단지의 시각화를위한 수 있습니다. AFM과 이미징 macromolecular 입자는 샘플 균질성 평가와 관찰 입자의 구성 요소의 실제 배열을 식별하는 데 유용할 수 있습니다. 개인 macromolecular 입자를 관찰 이러한 접근 방식은 immunoprecipitation의 assays, polyacrylamide 젤 전기 영동하고, 현재 관심있는 10 세 -10 11 개별 biomolecular의 단지를 나타내는 중요한 summative 데이터를 제공 크기 제외 칼럼 크로마 토그래피로 종래의 생화학 기술에 유용한 부가 될 수 있습니다 샘플 인치
multiprotein 복잡한 stoichiometry, biomolecular 상호 작용, 그리고 cofactor 요구 사항에 대한 연구는 모든 AFM을 사용하여 조사하실 수 있습니다. 여기서 제시하는 방법은 관심의 특정 biophysical 질문을 수용하기 위해 적용할 수 있습니다. 예를 들어, 버퍼를 교환 수있는 액체 세포 프로브 홀더를 사용하여 그것은 복잡한 단백질 형성에 대한 분석 cofactor 요구하는 것이 가능해 질 것입니다. 몇 군데하면서 DNA - 단백질 어셈블리도 거의 실시간 및 형성하고 dissociated 수 있습니다. DNA는 가상 바인딩 단백질과 혼합 관심의 특정 시퀀스 (추정 응답 요소 또는 소설 단백질 바인딩 순서를 예)와 함께 생성하고, 분자간 상호 작용의 직접적인 증거를 제공하기 위해 몇 군데 있습니다.
건조 표본이 아니라 수성 솔루션의 샘플 및 선형 DNA 스탠드 및 폐쇄 원형의 DNA plasmids이 방법으로 3,9 군데있다 모두보다 활용하는 경우 태핑 모드 AFM 이미징은 크게 덜 복잡합니다. 여기서 제시하는 방법은보다 생리적 이미징 환경을 제공하기 위해 버퍼 솔루션 샘플을 활용합니다. 이미지 단백질의 다른 주목할만한 방법은 역시 현장 적외선 현미경 니어 10를 포함하여 고려되어야합니다. AFM과 조화의 immunoadsorption의 보완 사용 잘 설립 생화 학적 기법을 이용하여, 단백질 단지의 무수한를 준비하는 기회를 제공하고, 다음 immunoadsorbing 항체 - 비드 펠렛에서 릴리스 다음을 시각화. 예를 들어, immunoadsorbed GR은 복잡한 크기와 stoichiometries을 추정하기 위해서는이 접근법을 사용이 hsp70 분자 보호자 단백질 일뿐만 아니라 dynein 모터 단백질과의 연관에 대한 assayed되었습니다. 입자 크기와 biophysical 기능 (예 : 강성) AFM 군데 샘플 11,12에서 관찰 biomolecules의 신원을 ascertaining에 유용했습니다. 그것은 대상 생분자가있는 경우 그 대상과 원인 입자 크기 증가에 바인딩 것이 상호 작용 생분자 (예 : 리간드 또는 단클론 항체)의 추가로 생분자 신원을 확인하는 것도 가능합니다.
Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 작품은 보건 부여 GM086822 국립 연구소에 의해 투자되었다. 저자 DRS 감사하고 싶습니다. 알렉 Pakhomov & 폴 월리스 (워싱턴 나노기술 사용자 시설의 Univ. (NTUF)) 및 전문 기술 지원 안드레아 슬레 이드 (Bruker AXS). DNA AFM 이미징은 대학교에서 실시되었다. 워싱턴 NTUF, 국립 나노기술 인프라 네트워크의 멤버. 2xGal4 - 2xGRE - luciferease 플라스미드는 친절 박사 키스 야마모토 (캘리포니아 Univ., 샌프란 시스코)의 실험실에 의해 제공되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dimension 3100 | Bruker Corporation | Dimension 3100 | |
| Dimension Fluid Cell | Bruker Corporation | DTFML-DD-HE | |
| Sharp nitride lever (SNL) silicon nitride AFM probe | Bruker Corporation | SNL-10 | |
| Microlever sharp nitride lever (MSNL) silicon nitride AFM probe | Bruker Corporation | MSNL-10 | |
| NanoScope AFM instrument software | Bruker Corporation | 004-132-000 | |
| Metal AFM specimen discs | Ted Pella, Inc. | 16208 | |
| Grade V1 Mica Discs, 12 mm | Ted Pella, Inc. | 50-12 |
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