Summary
एक दोहन मोड डीएनए प्लाज्मिड, cytoplasmic प्रोटीन और डीएनए प्रोटीन परिसरों के दृश्य के लिए परमाणु बल सूक्ष्मदर्शी विधि (AFM) में वर्णित है. विधि जैव रासायनिक हेरफेर के बाद AFM इमेजिंग के लिए नमूने तैयार करने के लिए वैकल्पिक दृष्टिकोण शामिल हैं. विशिष्ट प्रोटीन बातचीत क्षेत्रों युक्त डीएनए के पास शारीरिक बफर स्थितियों में मनाया जाता है.
Protocol
1. तैयारी डीएनए और प्रोटीन contaminants से मुक्त imaged किया जा नमूनों
- Biomolecules पृथक करने के लिए एक उपयुक्त जलीय बफर में imaged और जगह हो. Imaged किया जा प्रोटीन तरल क्रोमैटोग्राफी का का उपयोग कर छह शुद्ध हो सकता है, immunoadsorption प्रतिरक्षी और गोली 1,2 हटाने, या Profinity सटीक शुद्धि और टैग हटाने 7 (2A चित्रा) के द्वारा पीछा किया. डीएनए अणुओं miniprep शुद्धि (चित्रा 2B) द्वारा imaged किया जा पृथक.
- संरचना और प्रोटीन एसडीएस पृष्ठ और सोख्ता पश्चिमी का उपयोग imaged किया जा नमूनों की शुद्धता की पुष्टि करें. डीएनए के लिए, प्रतिबंध को पचाने और agarose जेल वैद्युतकणसंचलन पूरा करके अनुक्रम और पवित्रता की पुष्टि.
- एक AFM सोखना बफर में नमूने सेते अभ्रक के लिए नमूने के पालन को बढ़ावा देने. प्रोटीन के नमूने के लिए, 10 मिमी HEPES बफर का इस्तेमाल किया जा सकता है. अतिरिक्त कम ईओण ताकत लवण या अन्य cofactors के रूप में अच्छी तरह से जोड़ा जा सकता है. डीएनए नमूने के लिए, एक द्विसंयोजक कटियन (जैसे 2 मिलीग्राम + या 2 नी +) अभ्रक सब्सट्रेट करने के लिए सोखना को बढ़ावा देने के शामिल डीएनए के लिए एक उपयुक्त 2 मिलीग्राम + युक्त बफर 10 मिमी Tris, 7.5 पीएच, 10 मिमी NaCl, 2 मिमी 2 MgCl 3 है. एक वैकल्पिक नी 2 + बफर 10 मिमी HEPES, 6.8 पीएच, 10 मिमी 2 NiCl है.
- 5 μg / सोखना बफर में मिलीलीटर की एक एकाग्रता के लिए नमूना पतला. धीरे मिश्रण. बर्फ पर स्टोर जबकि माइक्रोस्कोप तैयार किया जा रहा है.
2. बढ़ते AFM जांच
- इसी ब्रैकट अधिष्ठापन डॉकिंग स्टेशन पर तरल सेल जांच धारक रखें.
- लंबे, तेज नाइट्राइड लीवर जांच (SNL) की मोटी ब्रैकट ('बी' ब्रैकट के रूप में संदर्भित) इमेजिंग के लिए इस्तेमाल किया जा पता लगाएँ. ध्यान यह तरल सेल जांच धारक को हस्तांतरण सुनिश्चित करना है कि टिप ईमानदार रहता है. तकनीकी ध्यान दें: चरम देखभाल जबकि जांच पारगमन में भुगतान किया जाना चाहिए, यह किसी भी ऊंचाई से गिर के रूप में, क्षति या ब्रैकट या टिप को नष्ट कर सकते हैं. एक microlever SNL जांच (MSNL) SNL जांच के लिए एक विकल्प के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है.
- डॉकिंग स्टेशन से जांच धारक निकालें और एक रोशनी खुर्दबीन के तहत ब्रैकट जांच करने के लिए सुनिश्चित करें इसे बरकरार है और ठीक से तरल सेल जांच धारक में बैठा है.
- ध्यान साधन सामंजस्य स्थापित विधानसभा से knurled सिर दबाना पेंच कस द्वारा AFM सिर को हटा दें. तकनीकी ध्यान दें: चरम देखभाल जबकि AFM सिर से छेड़छाड़ भुगतान किया जाना चाहिए, यह भी एक छोटी दूरी (जैसे सामंजस्य स्थापित विधानसभा में अगर सही ढंग से नहीं बैठा) से छोड़ने के रूप में, काफी नुकसान का कारण बन सकता है.
- AFM सिर उलटें और मजबूती से चार पिन पर AFM सिर के आधार पर तरल सेल जांच धारक धक्का. ध्यान साधन सामंजस्य स्थापित विधानसभा में AFM सिर वापसी. Knurled सिर दबाना पेंच रिलीज के लिए साधन में AFM सिर जकड़ना.
3. ब्रैकट टिप का पता लगाने, लेजर aligning, और समायोजन photodetector
- AFM साधन सॉफ्टवेयर का उपयोग, जहाज पर प्रकाश माइक्रोस्कोप का knobs चलती ब्रैकट टिप का पता लगाने. यदि आवश्यक टिप पहचान में सुधार करने के लिए माइक्रोस्कोप की रोशनी समायोजित. उपकरण सॉफ्टवेयर पर प्रदर्शित क्रॉसहेयर के करीब निकटता में ब्रैकट टिप के अंत लाओ.
- सॉफ्टवेयर पर प्रकाशिकी नियंत्रक के ऊपर और नीचे तीरों का समायोजन करके ध्यान में ब्रैकट टिप ले आओ. (एस) धीमी गति से या मध्यम गति (एम) जबकि प्रकाशिकी समायोजन का उपयोग करें.
- ब्रैकट टिप का उपयोग कर लेजर समायोजन knobs के लिए लेजर संरेखित करें. समायोजन knobs ले जाएँ जब तक कि लाल लेजर डॉट सफेद रोशनी स्थान के अंदर है. ब्रैकट zig zag-एक पैटर्न का उपयोग कर जब तक लेजर ब्रैकट टिप पर तैनात है हाथ के साथ ट्रेस. जब ठीक से गठबंधन, एक मजबूत प्रतिबिंब स्थल AFM सिर के सामने खिड़की में दिखाई देगा.
- केंद्र AFM सिर पर photodetector knobs के समायोजन करके photodetector. यह साधन सॉफ्टवेयर के photodetector प्रदर्शन के क्रॉसहेयर में लेजर डॉट पंक्ति में होगा. मनाया संकेत राशि 4-6 लगभग होना चाहिए.
4. पोजिशनिंग AFM सिर और ट्यूनिंग ब्रैकट
- अभ्रक के हौसले cleaved चादर AFM धारक थाली के ऊपर चुम्बकीय नमूना धारक पर एक धातु AFM नमूना डिस्क से जुड़ी रखें. इस सेटअप डीएनए या प्रोटीन चरण 1 में तैयार नमूना इमेजिंग के लिए पहले AFM सिर की स्थिति के लिए इस्तेमाल किया जाएगा.
- तकनीकी नोट: चुम्बकीय नमूना धारक और तरल सेल जांच धारक अन्य तंत्र और जांच धारकों बन्धन नमूना से अधिक गहरा कर रहे हैं. यदि वहाँ वर्तमान में अभ्रक नमूना धारक विधानसभा और AFM सिर के बीच पर्याप्त निकासी, उपकरण सॉफ्टवेयर पर वापस लेने का आइकन कई बार का चयन करके AFM सिर के ऊपर ले जाने के.
- AFM धारक थाली तो नमूना डिस्क प्रारंभिक इमेजिंग के लिए तैनात है घुमाएँ. सुनिश्चित करें कि अभ्रक सब्सट्रेट AFM सिर के तहत केंद्रित है.
- AFM सिर नीचे की ओर ले जाएँअभ्रक नमूना साधन सॉफ्टवेयर का ध्यान केंद्रित सतह नियंत्रण का उपयोग डिस्क की सतह. जेड मोटर पर मध्यम गति (एम) का चयन करें, और सतह की ओर जारी जब तक AFM सिर अभ्रक ऊपर लगभग 2 मिमी है. इस समय, धीमी (एस) Z मोटर गति का उपयोग करते हुए जांच और सतह (टिप दुर्घटनाग्रस्त के रूप में संदर्भित) के बीच आकस्मिक संपर्क से बचने के क्रम में स्विच करें.
- जांच अभ्रक सब्सट्रेट सतह के लिए करीब ले जाने तक अभ्रक सतह या टिप प्रतिबिंब पर विशिष्ट सुविधाओं को ध्यान में आगे बढ़ें. लिखत सॉफ्टवेयर से आइकन: सतह और टिप प्रतिबिंब फोकल "पर ध्यान केंद्रित" का उपयोग विमानों के बीच टॉगल.
- साधन सॉफ्टवेयर से धुन आइकन का चयन करें और ब्रैकट धुन. की सिफारिश की SNL और MSNL ब्रैकट जांच के अनुनाद आवृत्ति 20-60 kHz है. एक 5% ऑफसेट चोटी का चयन करें. तकनीकी नोट: पर्याप्त ब्रैकट ट्यूनिंग पर्याप्त नमूना इमेजिंग के लिए आवश्यक है.
5. इमेजिंग अभ्रक नमूना की सतह
- अभ्रक सतह पर जांच में संलग्न हैं. 10 सुक्ष्ममापी और 1 हर्ट्ज दर स्कैन करने के लिए प्रारंभिक स्कैन आकार सेट करें. इंटीग्रल लाभ और आनुपातिक लाभ 0.2 और 0.4 के लिए शुरू किया जा सकता है क्रमशः सेट,. क्रम में ट्रेस है और खोजना स्कैन मोटे तौर पर ओवरलैप करने के लिए जरूरत के रूप में लाभ समायोजित. आयाम setpoint घटाना जांच और अभ्रक के बीच बातचीत को बढ़ाने के लिए और सगाई को सुनिश्चित करेगा.
- 10 सुक्ष्ममापी क्षेत्र के पूरा स्कैन छवियों पर कब्जा. 5 आकार स्कैन, 1, और 0.5 सुक्ष्ममापी और प्रत्येक क्षेत्र के पूर्ण छवियों पर कब्जा घटाएँ. आवश्यक के रूप में लाभ और स्कैन दर को समायोजित करें. अभ्रक सतह की छवियों पर कब्जा करने डीएनए और प्रोटीन युक्त नमूनों की तुलना के लिए एक आधार रेखा प्रदान करता है.
- उपकरण सॉफ्टवेयर पर छुड़ाना आइकन पर एक सिंगल क्लिक के साथ जांच छुड़ाना.
6. ब्याज की इमेजिंग के biomolecules
- धीरे डीएनए या प्रोटीन नमूना चरण 1 में तैयार मिश्रण और imaged अभ्रक की सतह पर लोड करने के लिए तैयार है. ताजा सोखना बफर के 45 μl (अंतिम नमूना एकाग्रता = 0.5 / μg मिलीलीटर) के साथ मिश्रण तैयार नमूना के 5 μl.
- ध्यान से 0.5 / अभ्रक सतह पर सीधे मिलीलीटर biomolecule युक्त समाधान μg के 50 μl जोड़ें. जांच या AFM सिर के चलते बिना यह मत करो, और नमूना समाधान को सुनिश्चित करने (लेकिन नहीं टिप pipet) जांच के साथ संपर्क बनाता है.
- रोकें 5 मिनट के नमूने में biomolecules अभ्रक सतह का पालन करने के लिए अनुमति देने के लिए.
- 5 मिनट, तरल सेल जांच धारक में एक अतिरिक्त 50-100 μl pipet सोखना बफर के समापन पर जांच, AFM सिर, या pipet टिप के साथ अभ्रक स्पर्श नहीं सावधान किया जा रहा है. यह एक meniscus फार्म और AFM दोहन द्रव में मोड इमेजिंग के लिए अनुमति देते हैं चित्रा 3 द्रव सेल, ब्रैकट, नमूना, नमूना धारक, और meniscus के अंतिम व्यवस्था से पता चलता है..
- Photodetector मरम्मत करना और फिर से संगठित करना आवश्यक के रूप में ब्रैकट के लिए लेजर. तकनीकी नोट: जांच टिप और लेजर संरेखण को देखने के विवर्तन जांच धारक में नमूना बफर जोड़ने के कारण पैटर्न की वजह से जटिल है. मैन्युअल ब्रैकट retune, अगर जरूरत है.
- साधन सॉफ्टवेयर का उपयोग कर जांच पुनः संलग्न हैं. ऊर्ध्वाधर विक्षेपन, अभिन्न लाभ है, और आवश्यक के रूप में आनुपातिक लाभ समायोजित. यह पुनः इमेजिंग अभ्रक की धारा जोड़ने का नमूना और छवियों पर कब्जा करने के लिए पहले तुरंत स्कैन करने की प्रक्रिया शुरू हो जाएगा.
- स्कैन आकार बढ़ाएँ (सुक्ष्ममापी 500 एनएम-10) के लिए ब्याज के क्षेत्रों की पहचान. ज़ूम में और 0.5 हर्ट्ज स्कैन दर को कम करने के लिए छवि संकल्प में सुधार
- एक बार जब इमेजिंग पूरा हो गया है, उपकरण सॉफ्टवेयर पर चयन चिह्न वापस लेने कई बार जांच छुड़ाना. AFM और तरल सेल या नमूना डिस्क के disassembly से पहले नमूना डिस्क सिर के बीच पर्याप्त निकासी सुनिश्चित करें.
- आसुत जल के साथ अच्छी तरह से तरल सेल जांच धारक और नमूना डिस्क कुल्ला नमक क्रिस्टल अवशिष्ट सोखना बफर evaporates के रूप में बनाने से रोकने के. संपीड़ित हवा के साथ सूखी.
7. प्रतिनिधि परिणाम:
चित्रा 4 में AFM छवियों के उदाहरण प्रस्तुत कर रहे हैं. मीका सब्सट्रेट (एक) एक molecularly फ्लैट सतह पर जो डीएनए और प्रोटीन सोखना कर सकते हैं प्रदान करता है. इमेजिंग biomolecule नमूने से पहले अभ्रक एक नकारात्मक और इमेजिंग शोर के नियंत्रण का आकलन प्रदान करता है. यह भी आश्वासन दिया है कि ब्रैकट ठीक देखते है और बाद में नमूना इमेजिंग सफल हो जाएगा का एक स्तर प्रदान करता है. डबल असहाय डीएनए प्लाज्मिड (बी, डी), presumptively supercoiled आसानी से अपने असममित उपस्थिति और वर्दी पहले unremarkable अभ्रक सब्सट्रेट पर जमा द्वारा की पहचान की है. विचारशील कण आकार (सी और ई,) के प्रोटीन परिसरों भी कर रहे हैं विशिष्ट अभ्रक सब्सट्रेट से अलग पहचाना है. कण आकार मतभेद नमूना विविधता से संकेत मिलता है, और प्रोटीन जटिल stoichiometry या जैव रासायनिक गतिविधि approximating के लिए उपयोगी हो सकता है. सामान्य विकर्ण आकार और समर्थक के अनुरूप अभिविन्यासtein पैनल सी में मनाया कणों एक इमेजिंग विरूपण साक्ष्य है, के रूप में प्रोटीन उम्मीद अभ्रक सब्सट्रेट पर एक यादृच्छिक फैशन में उन्मुख होगा. मनाया artifact के संभावित कारणों में एक भौतिक टिप भी एक दर स्कैन के तेजी से विषमता या AFM इमेजिंग है. जबकि टिप कनवल्शनफ़िल्टर्स (चित्रा 1 बी में सचित्र) में पूर्ण लंबाई माप गणना को रोकता है एक्स और वाई axes, ऊंचाई माप (z अक्ष) और रिश्तेदार एक्स और y माप फिर भी imaged biomolecules के biophysical गुणों के आकलन के लिए उपयोगी हो सकता है है.
चित्रा 1: मोड परमाणु शक्ति माइक्रोस्कोपी (AFM) के दोहन के योजनाबद्ध प्रस्तुति . एक, माइक्रोस्कोप. ब्रैकट अंत में एक तेज टिप है कि oscillates और नीचे के रूप में यह एक अभ्रक सब्सट्रेट की सतह पर स्कैन है जो biomolecular परिसरों सोखना. के रूप में स्कैनर एक्स और वाई दिशाओं में चलता है, ब्रैकट के पीछे से एक लेज़र बीम एक स्थिति के प्रति संवेदनशील photodiode डिटेक्टर पर परिलक्षित होता है ऊर्ध्वाधर दूरी (z) टिप चाल के रूप में यह biomolecular पर बैठा परिसरों पर गुजरता नक्शा अभ्रक. बी x और y टिप कनवल्शनफ़िल्टर्स के कारण दिशाओं में छवि के विरूपण. एक परंपरागत सिलिकॉन नाइट्राइड टिप के नाममात्र त्रिज्या imaged किया जा कणों से बड़ा है, और टिप नमूना संपर्कों के किनारे के रूप में यह सतह traverses. युक्ति imaged एक्स और वाई दिशाओं में बड़ा दिखने कणों, Z दिशा नहीं है, लेकिन में कनवल्शनफ़िल्टर्स परिणाम है. इस आशय के एक छोटे नाममात्र टिप त्रिज्या के साथ युक्तियों के प्रयोग के द्वारा कम किया जा सकता है.
चित्रा 2: immunoadsorbed प्रोटीन और डीएनए नमूना तैयार करने के चित्रण. Immunoadsorbed जीआर के एक रिलीज • मोनोक्लोनल (एमएबी) एंटीबॉडी प्रोटीन एक Sepharose गोली (पीए) से HSP70 प्रोटीन जटिल है. MAB मिलान युक्त पेप्टाइड साथ immunopellet incubating गोली से जीआर • HSP70 प्रोटीन जटिल की रिहाई की सुविधा, जटिल सतह पर तैरनेवाला और AFM द्वारा कल्पना से एकत्र की अनुमति होगी. बी, डीएनए के AFM इमेजिंग के लिए तैयार एक द्विसंयोजक कटियन सोखना बफर का उपयोग की आवश्यकता है. द्विसंयोजक कटियन अभ्रक सब्सट्रेट के लिए डीएनए की आत्मीयता बढ़ जाती है.
चित्रा 3: AFM सिर, तरल सेल जांच धारक, नमूना, नमूना धारक, और बफर meniscus के अंतिम व्यवस्था. एक देखभाल, जब अभ्रक सब्सट्रेट पर जमा नमूना और अतिरिक्त बफर pipet टिप और AFM सिर, तरल कॉल, और अभ्रक सब्सट्रेट के बीच शारीरिक संपर्क से बचने लिया जाना चाहिए. बी, ए के आवर्धन बफर meniscus नमूना डिस्क से तरल सेल जांच धारक को spans.
चित्रा 4: अभ्रक सब्सट्रेट के परमाणु बल micrographs (ए), प्लाज्मिड डीएनए 8 (बी, डी) 2xGal4 2xGRE - luciferease, और जीआर • बफर समाधान में HSP70 प्रोटीन परिसरों (सी और ई). मीका एक नियंत्रण छवि के रूप में कार्य करता है के लिए डीएनए और प्रोटीन के visualizations के साथ तुलना. जीआर • HSP70 प्रोटीन परिसरों जीआर के immunoadsorption HSP70 और तब एंटीबॉडी मनका गोली से जारी एक MAB प्रतिस्पर्धा एंटीबॉडी (2A चित्रा में सचित्र) का उपयोग के साथ primed द्वारा तैयार किए गए. डीएनए पारंपरिक प्लाज्मिड miniprep द्वारा तैयार किया गया था. पैनलों ए, बी, सी और एक बराबर बढ़ाई (पैमाने सलाखों = 200 एनएम) कर रहे हैं, पैनलों के रूप में डी और ई (पैमाने सलाखों = 40 एनएम) कर रहे हैं.
Discussion
AFM एक अद्वितीय सूक्ष्म इमेजिंग वास्तविक समय में जलीय और पास शारीरिक बफर समाधान में व्यक्तिगत uncoated biomolecules सक्षम तकनीक प्रदान करता है. यह व्यक्ति प्रोटीन और डीएनए अणु के रूप में के रूप में अच्छी तरह से multiprotein परिसरों और प्रोटीन डीएनए परिसरों के दृश्य के लिए अनुमति देता है. इमेजिंग AFM के साथ macromolecular कणों नमूना एकरूपता का आकलन करने के लिए मनाया कणों के घटक घटकों के भौतिक व्यवस्था की पहचान करने के लिए उपयोगी हो सकता है. व्यक्तिगत macromolecular कणों को देख के यह दृष्टिकोण एक उपयोगी सहायक immunoprecipitation assays, polyacrylamide जेल वैद्युतकणसंचलन, और आकार अपवर्जन कॉलम क्रोमैटोग्राफी, जो महत्वपूर्ण summative 10 3 11 -10 ब्याज की अलग - अलग biomolecular परिसरों वर्तमान का प्रतिनिधित्व डेटा प्रदान करते हैं जैसे पारंपरिक जैव रासायनिक तकनीक, किया जा सकता है एक नमूना है.
Multiprotein जटिल stoichiometry, biomolecular बातचीत, और cofactor आवश्यकताओं में अनुसंधान सभी AFM का उपयोग कर जांच की जा सकता है. यहाँ प्रस्तुत विधि के हित के विशिष्ट biophysical सवालों को समायोजित करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है. उदाहरण के लिए, एक तरल सेल जांच बफर का आदान प्रदान करने में सक्षम धारक का उपयोग कर, यह परख प्रोटीन जटिल गठन के लिए cofactor आवश्यकताओं के लिए संभव हो सकता है. डीएनए प्रोटीन असेंबलियों और गठन किया जा सकता है के पास वास्तविक समय और भी dissociated जबकि imaged किया जा रहा है. डीएनए हित के विशिष्ट दृश्यों (जैसे एक प्रकल्पित प्रतिक्रिया तत्वों या उपन्यास प्रोटीन बाध्यकारी अनुक्रम), धारणा बंधनकारी प्रोटीन के साथ मिश्रित के साथ उत्पन्न किया जा सकता है, और intermolecular बातचीत की प्रत्यक्ष प्रमाण उपलब्ध कराने के imaged.
दोहन मोड AFM इमेजिंग काफी कम जटिल है, अगर सूखी नमूने जलकृत समाधान में नमूने, और रैखिक डीएनए खड़ा है और बंद सर्कल डीएनए plasmids दोनों इस 3,9 रास्ते में imaged किया गया है बजाय का उपयोग कर रहे हैं. यहाँ प्रस्तुत विधि बफर समाधान में नमूने का इस्तेमाल क्रम में एक और अधिक शारीरिक इमेजिंग वातावरण प्रदान. इमेजिंग प्रोटीन के अन्य उल्लेखनीय तरीकों में भी विचार किया जाना चाहिए क्षेत्र अवरक्त 10 माइक्रोस्कोपी के पास सहित . AFM के साथ बातचीत में immunoadsorption की पूरक उपयोग प्रोटीन परिसरों की असंख्य तैयार, अच्छी तरह से स्थापित जैव रासायनिक तकनीकों का उपयोग करने का अवसर प्रदान करता है, और फिर उन्हें immunoadsorbing एंटीबॉडी मनका गोली से रिहाई निम्नलिखित कल्पना. उदाहरण के लिए, immunoadsorbed जीआर आणविक निगरानी HSP70 प्रोटीन 1 के रूप में के रूप में अच्छी तरह से dynein मोटर प्रोटीन के साथ अपने सहयोग के लिए assayed 2 इस दृष्टिकोण का उपयोग क्रम में करने के लिए जटिल आकार और stoichiometries का अनुमान है. कण आकार और biophysical सुविधाओं (जैसे कठोरता) AFM imaged 11,12 नमूने में मनाया biomolecules की पहचान सुनिश्चित करने में उपयोगी है . यह भी संभव है एक बातचीत (जैसे एक ligand या मोनोक्लोनल एंटीबॉडी) biomolecule है, कि अपने लक्ष्य और कारण एक कण आकार में वृद्धि करने के लिए बाध्य अगर लक्ष्य biomolecule मौजूद है के अलावा द्वारा biomolecule पहचान की पुष्टि.
Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
यह काम राष्ट्रीय स्वास्थ्य अनुदान GM086822 के संस्थान के द्वारा वित्त पोषित किया गया था. लेखकों के लिए डीआरएस का शुक्रिया अदा करना होगा. एलेक Pakhomov और पॉल वालेस (Univ. (NTUF) वाशिंगटन नैनो प्रयोक्ता सुविधा) और उनके विशेषज्ञ तकनीकी सहायता के लिए Andrea स्लेड (Bruker AXS). डीएनए AFM इमेजिंग Univ में आयोजित किया गया. वाशिंगटन NTUF, राष्ट्रीय नैनो इंफ्रास्ट्रक्चर नेटवर्क के एक सदस्य के. 2xGal4 2xGRE - luciferease प्लाज्मिड कृपया डॉ. कीथ Yamamoto (Univ. कैलिफोर्निया, सैन फ्रांसिस्को) की प्रयोगशाला के द्वारा प्रदान किया गया.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dimension 3100 | Bruker Corporation | Dimension 3100 | |
| Dimension Fluid Cell | Bruker Corporation | DTFML-DD-HE | |
| Sharp nitride lever (SNL) silicon nitride AFM probe | Bruker Corporation | SNL-10 | |
| Microlever sharp nitride lever (MSNL) silicon nitride AFM probe | Bruker Corporation | MSNL-10 | |
| NanoScope AFM instrument software | Bruker Corporation | 004-132-000 | |
| Metal AFM specimen discs | Ted Pella, Inc. | 16208 | |
| Grade V1 Mica Discs, 12 mm | Ted Pella, Inc. | 50-12 |
References
- Murphy, P. J. M. Visualization and mechanism of assembly of a glucocorticoid receptorhsp70 complex that is primed for subsequent Hsp90-dependent opening of the steroid binding cleft. J Biol Chem. 278, 34764-34773 (2003).
- Harrell, J. M. Evidence for glucocorticoid receptor transport on microtubules by dynein. J Biol Chem. 279, 54647-54654 (2004).
- Pastre, D. Adsorption of DNA to mica mediated by divalent counterions: a theoretical and experimental study. Biophys J. 85, 2507-2518 (2003).
- Guthold, M. Direct observation of one-dimensional diffusion and transcription by Escherichia coli RNA polymerase. Biophys J. 77, 2284-2294 (1999).
- Petrucco, S., Volpi, G., Bolchi, A., Rivetti, C., Ottonello, S. A nick-sensing DNA 3'-repair enzyme from Arabidopsis. J Biol Chem. 277, 23675-23683 (2002).
- Murphy, P. J. M., Morishima, Y., Kovacs, J. J., Yao, T. P., Pratt, W. B. Regulation of the dynamics of hsp90 action on the glucocorticoid receptor by acetylation/deacetylation of the chaperone. J Biol Chem. 280, 33792-33799 (2005).
- Ruan, B., Fisher, K. E., Alexander, P. A., Doroshko, V., Bryan, P. N. Engineering subtilisin into a fluoride-triggered processing protease useful for one-step protein purification. Biochemistry. 43, 14539-14546 (2004).
- Meijsing, S. H., Elbi, C., Luecke, H. F., Hager, G. L., Yamamoto, K. R. The ligand binding domain controls glucocorticoid receptor dynamics independent of ligand release. Mol Cell Biol. 27, 2442-2451 (2007).
- Shen, X. C. A simple and effective sample preparation method for atomic force microscopy visualization of individual DNA molecules in situ. Mol Biol Rep. 38, 965-969 (2010).
- Paulite, M., Fakhraai, Z., Akhremitchev, B. B., Mueller, K., Walker, G. C. Assembly, tuning and use of an apertureless near field infrared microscope for protein imaging. J Vis Exp. , (2009).
- Cretu, A., Castagnino, P., Assoian, R. Studying the effects of matrix stiffness on cellular function using acrylamide-based hydrogels. J Vis Exp. , (2010).
- Brunger, A. T., Weninger, K., Bowen, M., Chu, S. Single-molecule studies of the neuronal SNARE fusion machinery. Annu Rev Biochem. 78, 903-928 (2009).
