Summary
En knacka läge atomkraftsmikroskop (AFM) metod för visualisering av plasmid-DNA, cytoplasma proteiner och DNA-protein komplex beskrivs. Metoden innehåller alternativa metoder för att förbereda prover för AFM bildhantering följande biokemiska manipulation. DNA innehåller specifika regioner protein interagerar observeras i nära fysiologiska bufferten förhållanden.
Abstract
Atomkraftsmikroskopi (AFM) gör det möjligt att visualisera enskilda proteiner, molekyler DNA, protein-protein komplex, och DNA-protein komplex. På slutet av mikroskop är fribärande är en nanonivå sond, som korsar bild allt från nanometer till mikrometer, mäta höjd av makromolekyler vilar på underlaget ytan vid en given punkt. Elektrostatiska krafter orsakar proteiner, lipider och nukleinsyror att löst fästa på substratet slumpmässiga riktlinjer och tillåter avbildning. De data som genereras likna en topografisk karta, där makromolekyler lösa som tredimensionella partiklar av diskret storlek (Figur 1) 1,2. Knacka läge AFM innebär upprepade svängning cantilever som tillåter avbildning av relativt mjuk biomaterial såsom DNA och proteiner. En av de viktiga fördelarna med AFM jämfört med andra nanoskala mikroskopitekniker är dess relativa anpassningsförmåga att visualisera enskilda proteiner och makromolekylära i vattenlösning buffertar, inklusive nästan fysiologiska buffrade förhållanden, i realtid, och utan färgning eller beläggning det prov som skall avbildas.
Den metod som presenteras här beskriver avbildning av DNA och en immunoadsorbed transkriptionsfaktor (dvs glukokortikoidreceptorn, GR) i buffrad lösning (Figur 2). Immunoadsorbed proteiner och protein kan skiljas från immunoadsorbing antikropps-pärla pellet av konkurrensen med antikroppen epitop och sedan avbildade (Figur 2A). Detta möjliggör för biokemiska manipulation av biomolekyler av intresse innan avbildning. När renat kan DNA och proteiner blandas och den resulterande samverkande komplexa kan avbildas också. Bindning av DNA till glimmer kräver en divalent katjon 3, som Ni 2 + eller Mg 2 +, som kan läggas till prov buffertar ändå behålla protein aktivitet. Med hjälp av en liknande strategi har AFM använts för att visualisera enskilda enzymer, inklusive RNA-polymeras 4 och en reparation enzymet 5, bunden till enskilda DNA-strängar. Dessa experiment ger betydande insikt i protein-protein och DNA-protein biofysiska interaktion som sker på molekylär nivå. Imaging enskilda makromolekylära partiklar med AFM kan vara användbart för att avgöra partikel homogenitet och för att identifiera den fysiska placeringen av ingående komponenter i avbildade partiklar. Samtidigt som den nuvarande metoden utvecklades för visualisering av GR-förkläde proteinkomplex 1,2 och DNA-strängar som GR kan binda, kan den tillämpas allmänt för att avbildning DNA och prover protein från olika källor.
Protocol
1. Förbereda DNA och protein prover som ska avbildas fritt från föroreningar
- Isolera biomolekyler som ska avbildas och placera i en lämplig vattenbaserad buffert. Proteiner som ska avbildas kan renas med hjälp av vätskekromatografi sex, följt immunoadsorption genom att avlägsna antikroppar och pellets 1,2 eller Profinity exakt rening och tag bort 7 (Figur 2A). Isolera DNA-molekyler som ska avbildas genom miniprep rening (Figur 2B).
- Bekräfta sammansättning och renhet av protein prov som skall avbildas med SDS-PAGE och Western blotting. För DNA, bekräfta sekvens och renhet genom att fylla i en begränsning smälta och agarosgelelektrofores.
- Inkubera proverna i en AFM adsorption buffert att främja efterlevnad av provet på glimmer. För protein prover, får 10 mM HEPES buffert användas. Extra låg jonstyrka salter eller andra kofaktorer kan läggas till också. För DNA-prover, bland annat en divalent katjon (t.ex. Mg 2 + eller Ni 2 +) för att främja absorption till glimmer underlaget. En lämplig Mg 2 +-innehållande buffert för DNA är 10 mM Tris, pH 7,5, 10 mM NaCl, 2 mM MgCl 2 3. Ett alternativ Ni 2 + buffert är 10 mm HEPES, 6,8 pH, 10 mm NiCl 2.
- Späd provet till en koncentration på 5 mikrogram / ml i adsorption buffert. Blanda försiktigt. Förvara på is medan mikroskop håller på att utarbetas.
2. Montering AFM sond
- Placera flytande hållaren cellen sond på motsvarande fribärande installationen dockningsstation.
- Leta reda på den långa, tjocka cantilever (kallad "B" fribärande) av den kraftiga nitrid spaken (SNL) sond som ska användas för avbildning. Försiktigt överföra den till vätskan cellen probhållare, se till att spetsen är fortfarande upprätt. Teknisk anmärkning: Extrem försiktighet måste betalas när givaren är i transit enligt släppa det från valfri höjd kan skada eller förstöra cantilever eller tips. En microlever SNL (MSNL) sond kan användas som ett alternativ till SNL sonden.
- Ta bort sonden innehavaren från dockningsstationen och undersöka cantilever under ett ljusmikroskop för att säkerställa att den är intakt och ordentligt i vätskan cellen probhållaren.
- Ta försiktigt bort AFM huvudet från instrumentet kopplas ihop monteringen genom att dra åt den räfflade skruven huvudet klämma. Teknisk anmärkning: Extrem försiktighet måste betalas samtidigt manipulera AFM huvudet, som släppa det från och med ett kort avstånd (t.ex. om den inte sitter korrekt i samklang församlingen) kan leda till omfattande skador.
- Vänd AFM huvudet och skjut den flytande innehavaren cellen sond på fyra stift vid basen av AFM huvudet. Försiktigt tillbaka AFM huvudet i instrumentet passar ihop montering. Släpp den räfflade skruven huvudet klämma för att fästa AFM huvudet i instrumentet.
3. Hitta fribärande spets, anpassa laser och justera fotodetektor
- Använda AFM instrumentets programvara, lokalisera cantilever spetsen genom att flytta reglagen för ombord ljusmikroskop. Justera belysningen av mikroskop om det är nödvändigt att förbättra spets identifiering. Ta slutet av cantilever spetsen i närheten av hårkorset visas på instrumentets programvara.
- Ta med fribärande spetsen i fokus genom att justera upp och ner pilarna för optik regulatorn på programvaran. Använd långsam (S) eller medium (M) hastighet medan justering av optiken.
- Rikta lasern till fribärande spets med rattar lasern justering. Flytta justeringsrattar tills den röda laserpunkten är inne i vit belysning plats. Spåra längs cantilever armen med en zig-zag mönster tills lasern är placerad på fribärande spetsen. När korrekt inställd, kommer en stark reflektion plats visas i framrutan av AFM huvudet.
- Centrera fotodetektor genom att justera fotodetektor vreden på AFM huvudet. Detta kommer att anpassa laserpunkten i hårkorset på fotodetektor visningen av instrumentets programvara. Den observerade signalen summan bör vara ungefär 4-6.
4. Positionering AFM huvud och tuning fribärande
- Placera en nyligen klyvs blad av glimmer bifogas en metall AFM exemplar skiva i magnetiserade provhållaren ovanpå AFM innehavaren plattan. Denna inställning kommer att användas för att placera AFM huvudet före avbildning av DNA eller protein prov som beretts i steg 1.
- Teknisk anmärkning: magnetiserade provhållaren och flytande celler probhållaren är tjockare än andra prov infästning mekanismer och innehavare sond. Om det för närvarande är otillräcklig spelet mellan glimmer-provhållaren montering och AFM huvudet, flytta AFM huvudet upp genom att välja ut ikonen på instrumentets programvara flera gånger.
- Rotera AFM innehavaren plattan så exemplaret skivan är placerad för den första avbildning. Se till att glimmer substratet är centrerad under AFM huvudet.
- Flytta AFM huvudet ner motytan av glimmer-provet skiva med kontroll fokus ytan av instrumentets programvara. Välj medium (M) hastighet på Z motor, och fortsätter mot ytan tills AFM huvudet är cirka 2 mm ovanför glimmer. Vid den här tiden, växla till att använda den långsamma (S) Z motorns varvtal för att undvika plötsliga kontakt mellan sonden och ytan (kallas krascha spetsen).
- Fortsätt att flytta sonden närmare glimmer substratet ytan tills olika egenskaper på glimmer ytan eller spetsen reflektion är i fokus. Växla mellan ytan och spetsen reflektion fokalplan med "fokusera på:" ikonen från instrumentet mjukvara.
- Välj låten ikonen från instrumentets programvara och trimma den fribärande. Resonansfrekvensen av den rekommenderade SNL och MSNL sonder cantilever är 20-60 kHz. Välj en 5% från topp offset. Teknisk anmärkning: Adekvat fribärande inställning är avgörande för lämpligt stickprov avbildning.
5. Imaging glimmer provytan
- Engagera sonden på glimmer ytan. Ställ in första MRT-storlek till 10 mikrometer och avsökningshastighet till 1 Hz. Integral vinna och proportionell förstärkning kan inledningsvis inställd på 0,2 och 0,4, respektive. Justera vinster som behövs för att få spåra och spåra skannar ungefär överlappar varandra. Minska amplituden börvärdet kommer att öka samspelet mellan sonden och glimmer och säkerställa engagemang.
- Fånga komplett skanna bilder av 10 mikrometer fältet. Minska skanningsstorlek till 5, 1 och 0,5 ìm och fånga kompletta bilder av varje fält. Justera vinster och skanna takt som behövs. Fånga bilder av glimmer ytan ger en utgångspunkt för jämförelse med DNA-och protein-innehållande prover.
- Koppla proben med ett enda klick på lösgöra ikonen på instrumentets programvara.
6. Imaging biomolekyler av intresse
- Blanda försiktigt DNA eller protein prov som beretts i steg 1 och förbereda för att ladda den på avbildade glimmer ytan. Blanda 5 l av det beredda provet med 45 l av färska adsorption buffert (sista provet koncentration = 0,5 mikrogram / ml).
- Tillsätt försiktigt 50 ìl av 0,5 mikrogram / ml biomolekyler som innehåller lösningen direkt på glimmer ytan. Gör detta utan att flytta sonden eller AFM huvudet, och se till provlösningen (men inte pipettspetsen) kommer i kontakt med sonden.
- Paus 5 minuter för att biomolekyler i provet att ansluta sig till glimmer ytan.
- Vid slutet av 5 minuter, Pipettera en ytterligare 50-100 ìl adsorption buffert i vätskan cellen probhållaren var noga med att inte röra sonden, AFM huvudet, eller glimmer med pipettspetsen. Detta kommer att bilda en menisk och möjliggöra AFM knacka mode scanning i vätska. Figur 3 visar den slutliga placeringen av vätska cellen, grenställ, prov, prov hållaren och menisker.
- Justera fotodetektor och justera lasern till fribärande vid behov. Teknisk anmärkning: visa sondspetsen och laser anpassning är komplicerat på grund av diffraktionsmönster orsakas genom att lägga provet buffert i sonden hållaren. Manuellt RETUNE den fribärande, om det behövs.
- Återuppta kontakten sonden med hjälp av instrumentets programvara. Justera vertikal nedböjning, integrerad förstärkning, och proportionell förstärkning vid behov. Detta kommer att påbörja processen med att re-imaging den del av glimmer skannade omedelbart före lägga prov och bilder fånga.
- Öka skanningsstorlek (500 nm-10 mikrometer) för att identifiera områden av intresse. Zooma in och minska avsökningshastighet till 0,5 Hz för att förbättra bildens upplösning
- När bildbehandling är klar, koppla ur sonden genom att välja ut ikonen på instrumentets programvara flera gånger. Se till att tillräckligt med utrymme mellan AFM huvudet och exemplar skivan innan demontering av vätskan cell eller prov skiva.
- Skölj vätskan innehavaren cellen sond och prov skivan med destillerat vatten för att förhindra att saltkristaller bildas som restprodukter adsorption buffert avdunstar. Torka med tryckluft.
7. Representativa resultat:
Exempel på AFM-bilder visas i Figur 4. Mica substrat (A) ger ett molekylärt plan yta på vilken DNA och protein kan adsorbera. Imaging glimmer före biomolekyler prover ger en negativ kontroll och bedömning av avbildning buller. Det ger också en säkerhet att cantilever är korrekt inställd och efterföljande prov imaging kommer att lyckas. Dubbel-strängat plasmid-DNA (B, D), presumtivt supercoiled är lätt identifieras genom sin asymmetriska utseende och enhetlig insättning på tidigare unremarkable glimmer substrat. Proteinkomplex med diskret partikelstorlekar (C, E) är också unikt skiljas från glimmer underlaget. Partikelstorlek skillnader visar prov heterogenitet, och kan vara bra att tillnärma proteinkomplex stökiometri eller biokemiska aktivitet. Den allmänna diagonala formen och konsekvent orientering av profett, protein partiklar som observerats vid Panel C är en avbildning artefakt, som proteiner skulle oväntat vara inriktad på glimmer underlaget på ett slumpmässigt sätt. Möjliga orsaker till de observerade artefakt är en fysisk tips abnormitet eller AFM bildhantering på alltför snabbt av en avsökningshastighet. Medan spetsen faltning (illustreras i figur 1B) förhindrar absolut beräkningar längdmätning i x-och y-axeln, höjd mätning (Z-axel) och relativ x-och y-mätningar kan ändå användbart för att skatta biofysiska egenskaper avbildade biomolekyler.
Figur 1: Schematisk presentation av knacka läge atomkraftsmikroskopi (AFM). A, mikroskopet. I slutet av cantilever är en vass spets som oscillerar upp och ner när den skannar över ytan av ett glimmer substrat som biomolekylära komplex adsorbera. Eftersom skannern rör sig i x-och y-riktningar är en laserstråle som reflekteras från baksidan av cantilever på en ställning-känslig fotodiod detektorn att kartlägga den vertikala (z) Avståndet spetsen rör sig när den passerar över biomolekylära komplex sitter på glimmer. B. förvrängning av bilden i x-och y-riktningar som orsakas av spetsen faltning. Den nominella radie av en konventionell kiselnitrid tips är större än de partiklar som skall avbildas, och kanten på spetsen kontakter provet som korsar ytan. Tips faltning resultat i avbildade partiklarna förekommer större i x-och y-riktning, men inte z-riktningen. Denna effekt kan minimeras genom användning av tips med en mindre nominell nosradie.
Figur 2: Illustration av immunoadsorbed protein och DNA-prov förberedelse. En, frigörande av immunoadsorbed GR • hsp70 proteinkomplex från den monoklonala antikroppen (mAb)-protein A-Sepharose (PAS) pellets. Inkubering av immunopellet med en peptid som innehåller mAb epitopen kommer att underlätta frisläppandet av GR • hsp70 proteinkomplex från pellets, vilket gör att komplicerade att samlas in från supernatanten och visualiseras genom AFM. B, kräver Preparation av DNA för AFM avbildning användning av en divalent katjon adsorption buffert. Den divalent katjon ökar affinitet av DNA för glimmer substrat.
Figur 3: Slutlig placering av AFM huvudet, flytande cell probhållare, prov, provhållare, och buffert menisken. A Man måste vara försiktig vid insättning prov och ytterligare buffert på glimmer underlaget för att undvika fysisk kontakt mellan pipettspetsen och AFM huvudet, flytande samtal, och glimmer substrat. B, Förstoring av A. buffert menisk sträcker sig från provet skivan till flytande cellen probhållaren.
Figur 4: Atomic force micrographs av glimmer substrat (A), 2xGal4-2xGRE-luciferease plasmid-DNA 8 (B, D) och GR • hsp70 proteinkomplex (C, E) i buffrad lösning. Mica fungerar som en kontroll bild att jämföra med visualiseringar av DNA och protein. GR • hsp70 proteinkomplex har utarbetats av immunoadsorption för GR grundas med hsp70 och sedan frigörs från antikropps-pärla pellets med hjälp av en mAb konkurrerande antikropp (illustreras i Figur 2A). DNA preparerades med konventionella plasmid miniprep. Paneler A, B och C är en likvärdig förstoring (skala bar = 200 nm), liksom paneler D och E (skala staplar = 40 nm).
Discussion
AFM ger en unik mikroskopisk teknik kan imaging obestruket enskilda biomolekyler i vattenlösning och nära fysiologiska buffrade lösningar i realtid. Detta gör det möjligt för visualisering av enskilda proteiner och molekyler DNA, liksom komplex Multiproteinkomplex och protein-DNA-komplex. Imaging makromolekylära partiklar med AFM kan vara användbart för att bedöma prov homogenitet och för att identifiera den fysiska placeringen av de ingående komponenterna i de observerade partiklarna. Denna metod att observera enskilda makromolekylära partiklar kan vara ett bra komplement till konventionella biokemiska tekniker, såsom immunoprecipitation analyser, polyakrylamidgelelektrofores och storlek utanförskap kolonnkromatografi, vilket ger betydande summativ uppgifter som representerar 10 3 -10 11 individuella biomolekylära komplex av intresse närvarande i ett prov.
Forskning Multiproteinkomplex komplexa stökiometri, interaktioner biomolekyler och krav kofaktor alla kan undersökas med hjälp av AFM. Metoden som presenteras här kan anpassas till specifika biofysiska frågor av intresse. Till exempel med hjälp av en flytande innehavaren cell sond kan utbyta buffert, är det möjligt att kraven assay kofaktor för proteinkomplex bildas. DNA-protein församlingar kan bildas och dissocierade i nära realtid och med när som avbildas. DNA kan genereras med specifika sekvenser av intresse (t.ex. en presumtiv svar element eller nya proteinbindning sekvens), blandat med de hypoteser protein och avbildade att ge direkta bevis för intermolekylära interaktioner.
Knacka läge AFM bildhantering betydligt mindre komplicerat om torra prover tas tillvara i stället för prov i vattenlösningar, och linjär står DNA och slutna cirkeln plasmider DNA har båda varit avbildad på detta sätt 3,9. Den metod som presenteras här utnyttjar prov i buffrad lösningar för att ge en mer fysiologisk bildbehandling miljö. Andra beaktansvärda metoder för avbildning proteiner bör också övervägas, inklusive närområdet infraröd mikroskopi 10. Den kompletterande användning av immunoadsorption i umgås med AFM ger en möjlighet att förbereda en myriad av proteinkomplex med hjälp av väl etablerade biokemiska tekniker, och sedan visualisera dem efter release från immunoadsorbing antikropps-pärla pelleten. Till exempel har immunoadsorbed GR blivit analyserade för sitt samarbete med de molekylära förkläde proteinet hsp70 1 samt dynein motor proteinet 2 som använder denna metod för att uppskatta komplexa storlek och stoichiometries. Partikelstorlek och biofysiska funktioner (t ex stelhet) har varit användbar i fastställa identiteten hos biomolekyler som observerats i AFM avbildas prover 11,12. Det är också möjligt att bekräfta biomolekyler identitet genom tillägg av en samverkande biomolekyler (t.ex. en ligand eller monoklonal antikropp), som skulle binda till sitt mål och orsaka en partikelstorlek öka om målet biomolekyler är närvarande.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Detta arbete har finansierats av National Institutes of Health Grant GM086822. Författarna vill tacka Dr. Alec Pakhomov & Paul Wallace (Univ. of Washington nanoteknik användare anläggning (NTUF)) och Andrea Slade (Bruker AXS) för teknisk experthjälp. DNA AFM bildhantering genomfördes vid Univ.. Washington NTUF, en medlem av National Nanotechnology infrastrukturnätverket. Den 2xGal4-2xGRE-luciferease plasmid var vänligt tillhandahålls av laboratoriet av Dr Keith Yamamoto (Univ. of California, San Francisco).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dimension 3100 | Bruker Corporation | Dimension 3100 | |
| Dimension Fluid Cell | Bruker Corporation | DTFML-DD-HE | |
| Sharp nitride lever (SNL) silicon nitride AFM probe | Bruker Corporation | SNL-10 | |
| Microlever sharp nitride lever (MSNL) silicon nitride AFM probe | Bruker Corporation | MSNL-10 | |
| NanoScope AFM instrument software | Bruker Corporation | 004-132-000 | |
| Metal AFM specimen discs | Ted Pella, Inc. | 16208 | |
| Grade V1 Mica Discs, 12 mm | Ted Pella, Inc. | 50-12 |
References
- Murphy, P. J. M. Visualization and mechanism of assembly of a glucocorticoid receptorhsp70 complex that is primed for subsequent Hsp90-dependent opening of the steroid binding cleft. J Biol Chem. 278, 34764-34773 (2003).
- Harrell, J. M. Evidence for glucocorticoid receptor transport on microtubules by dynein. J Biol Chem. 279, 54647-54654 (2004).
- Pastre, D. Adsorption of DNA to mica mediated by divalent counterions: a theoretical and experimental study. Biophys J. 85, 2507-2518 (2003).
- Guthold, M. Direct observation of one-dimensional diffusion and transcription by Escherichia coli RNA polymerase. Biophys J. 77, 2284-2294 (1999).
- Petrucco, S., Volpi, G., Bolchi, A., Rivetti, C., Ottonello, S. A nick-sensing DNA 3'-repair enzyme from Arabidopsis. J Biol Chem. 277, 23675-23683 (2002).
- Murphy, P. J. M., Morishima, Y., Kovacs, J. J., Yao, T. P., Pratt, W. B. Regulation of the dynamics of hsp90 action on the glucocorticoid receptor by acetylation/deacetylation of the chaperone. J Biol Chem. 280, 33792-33799 (2005).
- Ruan, B., Fisher, K. E., Alexander, P. A., Doroshko, V., Bryan, P. N. Engineering subtilisin into a fluoride-triggered processing protease useful for one-step protein purification. Biochemistry. 43, 14539-14546 (2004).
- Meijsing, S. H., Elbi, C., Luecke, H. F., Hager, G. L., Yamamoto, K. R. The ligand binding domain controls glucocorticoid receptor dynamics independent of ligand release. Mol Cell Biol. 27, 2442-2451 (2007).
- Shen, X. C. A simple and effective sample preparation method for atomic force microscopy visualization of individual DNA molecules in situ. Mol Biol Rep. 38, 965-969 (2010).
- Paulite, M., Fakhraai, Z., Akhremitchev, B. B., Mueller, K., Walker, G. C. Assembly, tuning and use of an apertureless near field infrared microscope for protein imaging. J Vis Exp. , (2009).
- Cretu, A., Castagnino, P., Assoian, R. Studying the effects of matrix stiffness on cellular function using acrylamide-based hydrogels. J Vis Exp. , (2010).
- Brunger, A. T., Weninger, K., Bowen, M., Chu, S. Single-molecule studies of the neuronal SNARE fusion machinery. Annu Rev Biochem. 78, 903-928 (2009).
