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Immunology and Infection

से संक्रमित चूहों में बैक्टीरियल लोड और इम्यून प्रतिक्रियाएँ माप लिस्टेरिया monocytogenes Published: August 9, 2011 doi: 10.3791/3076
Automatic Translation
1, 2, 2, 1
1St Vincent’s Institute, Department of Medicine, The University of Melbourne, 2Department of Microbiology and Immunology, The University of Melbourne

Summary

लिस्टेरिया monocytogenes प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया और आनुवंशिक संवेदनशीलता का अध्ययन चूहों में बैक्टीरिया intracellular के लिए एक मॉडल जीव है. इस विधि में एक जीवाणु लोड को मापने के लिए और FACS विश्लेषण के लिए चूहों से जिगर और तिल्ली के एकल कक्ष निलंबन उत्पन्न लिस्टेरिया संक्रमण के कारण प्रतिरक्षा कोशिकाओं में परिवर्तन का निर्धारण करने में सक्षम बनाता है.

Protocol

1. लिस्टेरिया monocytogenes के संवर्धन और लंबी अवधि के भंडारण (लिस्टिरिया)

  1. बनाओ या पूर्व बनाया घोड़े रक्त अगर प्लेट (HBA) खरीद. ड्राई प्लेटों से पहले पूर्व incubating द्वारा 37 पर उपयोग करने के लिए डिग्री सेल्सियस रातोंरात या 1 घंटे के लिए एक लामिना का प्रवाह कैबिनेट में खुला रखने.
  2. निम्न में से एक: एक संक्रमित माउस ऊतक homogenate, एक lyophilized शेयर, एक जमे हुए ग्लिसरॉल शेयर, या हाल ही में एक लिस्टेरिया संस्कृति (कम से कम एक सप्ताह पुरानी और उप सुसंस्कृत पीढ़ियों के 10 से अधिक नहीं) अर्थात् से एक कॉलोनी से व्यवहार्य लिस्टेरिया प्राप्त . सभी लिस्टेरिया एक बाँझ inoculating पाश का उपयोग और इस प्रोटोकॉल में वर्णित सभी तरीकों के लिए सड़न रोकनेवाला तकनीक को रोजगार प्राप्त होना चाहिए.
  3. प्राथमिक inoculum प्रसार के रूप में थाली की सतह के ¼ अधिक लिस्टेरिया लकीर: एचवीए के रूप में चित्र 1 में दिखाया गया है एक बाँझ inoculating पाश का उपयोग कर प्लेट पर लिस्टेरिया स्ट्रीक. प्राथमिक प्रसार से यूनिडायरेक्शनल धारियाँ की एक श्रृंखला बनाओ. 2-3 धारियाँ के प्रत्येक सेट के पहले एक ताजा या फिर निष्फल पाश का उपयोग बार streaking दोहराएँ. 37 डिग्री सेल्सियस रातोंरात प्लेटें सेते हैं.
  4. 4 ° C में 1 महीने की एक अधिकतम अवधि के लिए लिस्टेरिया एचवीए थाली या स्टोर से 1.5 कदम को लंबी अवधि के भंडारण के लिए लिस्टेरिया संस्कृति तैयार जाओ.
  5. एक ताजा लिस्टेरिया संस्कृति से एक एचवीए एक निष्फल inoculating पाश का उपयोग कर प्लेट पर एक एकल कॉलोनी और उठाओ मस्तिष्क दिल (भी) एक 30 एमएल मेकार्टनी बोतल में जलसेक शोरबा (निर्माता के निर्देशों के अनुसार तैयार) के 10 एमएल टीका लगाना.
  6. 37 ° रातोंरात सी पर 180rpm में एक कक्षीय प्रकार के बरतन में लिस्टेरिया संस्कृति सेते हैं.
  7. तरल लिस्टेरिया संस्कृति के लिए 1:1 के अनुपात में बाँझ 80% ग्लिसरॉल (v / v) के लिए 40% की एक अंतिम ग्लिसरॉल एकाग्रता (v / v) प्राप्त करने के लिए जोड़ें. Cryovials में 0.5-1 एमएल aliquots स्थानांतरण और -70 पर लिस्टेरिया / ग्लिसरॉल शेयरों की दुकान डिग्री सेल्सियस

युक्तियाँ और नोट्स:

  • लिस्टेरिया की ग्रोथ रक्त की एक सीमा अगर (घोड़ा, भेड़, गिनी पिग या मानव रक्त के साथ पूरक), मस्तिष्क दिल (भी) जलसेक अगर या शोरबा, या खमीर के साथ tryptic सोया शोरबा के रूप में विभिन्न गैर चयनात्मक मीडिया पर समर्थित किया जा सकता है है निकालने (TSB - तु). Contaminating विकास लिस्टेरिया उपभेदों के लिए मीडिया के लिए एंटीबायोटिक दवाओं परिभाषित एंटीबायोटिक प्रतिरोध (10403S जैसे एल monocytogenes) के साथ, ऑक्सफोर्ड, मीडिया, जो चुनिंदा लिस्टेरिया के विकास का समर्थन का उपयोग करके जोड़ने या संस्कृति में कम से कम किया जा सकता है.
  • यदि एक untested स्रोत से लिस्टेरिया प्राप्त की है, यह सिफारिश की है कि अतिरिक्त परीक्षण की पहचान की पुष्टि प्रदर्शन किया जा लिस्टेरिया (एल monocytogenes ग्राम सकारात्मक है, गैर - बीजाणु बनाने, चलता - फिरता 30 <° सी, facultatively anaerobic, catalase सकारात्मक है, और oxidase नकारात्मक). प्राप्त संस्कृति लिस्टेरिया चयनात्मक मीडिया पर भी हो सकते हैं करने के लिए सुनिश्चित करें कि एक शुद्ध संस्कृति प्राप्त है.
  • एचवीए प्लेटें सुखाने का सुनिश्चित करता है कि वहाँ थाली पर बैक्टीरियल कालोनियों के इष्टतम जुदाई है.
  • जब लिस्टेरिया के जमे हुए ग्लिसरॉल शेयरों बनाने, ताजा एचवीए लिस्टेरिया संस्कृतियों है कि कम से कम 1 सप्ताह पुरानी है और संभव के रूप में (5 <सबसे अच्छा है) के रूप में कुछ पीढ़ियों के लिए उप सुसंस्कृत हैं का उपयोग करें.
  • जब एक जमे हुए ग्लिसरॉल स्टॉक से ताजा लिस्टेरिया संस्कृतियों पाने, पहली बीतने के ठोस माध्यम (यानी एचवीए प्लेटें) पर बना होना चाहिए क्योंकि जमी ग्लिसरॉल शेयरों से लिस्टेरिया प्राप्त खराब बढ़ने जब ​​सीधे तरल माध्यम में subcultured.

2. और लिस्टेरिया संक्रामक स्टॉक के भंडारण में vivo में संक्रमण अध्ययन के लिए तैयार

  1. एक एचवीए थाली पर जमी ग्लिसरॉल शेयर (1.7 चरण) से लिस्टेरिया स्ट्रीक के रूप में 1.3 चरण में वर्णित है. 37 में प्लेटें सेते डिग्री सेल्सियस अगले दिन पर उपयोग के लिए रातोंरात.
  2. एक लकीर संस्कृति से एक एकल लिस्टेरिया कॉलोनी उठाओ और एक 10 एमएल भी शोरबा टीका लगाना. शोरबा में अगर स्थानांतरित करने से बचें.
  3. एक कक्षीय प्रकार के बरतन में 180 rpm और 37 में लिस्टेरिया भी संस्कृति सेते डिग्री सेल्सियस मध्य लघुगणक चरण (OD600 = 0.4 ~). यह आमतौर पर 3-4 घंटे लगते हैं.
  4. एक 0.9 एमएल विभाज्य aseptically लो और मिलाते के 3-4 घंटे में 600 एनएम पर एक आयुध डिपो पढ़ने प्राप्त. यदि आयुध डिपो पढ़ने <0.3 है, तो एक कक्षीय प्रकार के बरतन में 180 rpm और 37 में संस्कृति के लिए जारी रखने के ° सी आयुध डिपो पढ़ने तक 0.4 ~ है.
  5. 1 एमएल बाँझ 80% ग्लिसरॉल (v / v) 10 एमएल लिस्टेरिया भी शोरबा संस्कृति (OD600 0.4 ~) जोड़ें. धीरे मिक्स और 0.5-1 एमएल aliquots में 1.5 एमएल microfuge ट्यूबों में स्थानांतरित.
  6. -70 पर 10 मिनट और स्टोर के लिए बर्फ पर aliquots प्लेस डिग्री सेल्सियस एक unfrozen विभाज्य छोड़ो संक्रामक शेयर में लिस्टिरिया की एकाग्रता, जो 10 CFU / एमएल 9 के क्रम में आम तौर पर निर्धारित है.
  7. 1:10 unfro के धारावाहिक dilutions प्रदर्शनज़ेन लिस्टेरिया पीबीएस में संक्रामक 10 -8 कमजोर पड़ने शेयर. पूर्व सूखे एचवीए प्लेटें (1.1 कदम) पर एक गिलास स्प्रेडर का उपयोग कर दो प्रतियों में undiluted के 100 μL और प्रत्येक बाद कमजोर पड़ने बिखरा हुआ है. 37 डिग्री सेल्सियस रातोंरात प्लेटें सेते हैं.
  8. प्रत्येक प्लेट पर कालोनियों की संख्या की गणना और निर्धारित जमी संक्रामक शेयर संस्कृति के लिस्टेरिया एकाग्रता निम्नलिखित गणना का उपयोग: (CFU / एमएल) एकाग्रता कालोनियों की संख्या = x कमजोर पड़ने कारक / 0.1 एमएल. गिनती के लिए चुना प्लेटें आदर्श 30-300 कालोनियों CFU व्यवहार्य जीवाणुओं की एकाग्रता की एक विश्वसनीय अनुमान सुनिश्चित करना चाहिए.
  9. -70 पर लिस्टेरिया संक्रामक शेयर भंडारण के बाद कुछ दिनों ° सी, एक ट्यूब बाहर पिघलना . के रूप में 2.7 और 2.8 कदम में वर्णित व्यवहार्य लिस्टेरिया की एकाग्रता का निर्धारण करते हैं. यह एकाग्रता हौसले से तैयार 2.8 चरण में संक्रामक स्टॉक के लिए निर्धारित है कि समान होना चाहिए.

युक्तियाँ और नोट्स:

  • लिस्टेरिया संक्रामक शेयर सामान्य भंडारण लंबी अवधि (40%) के लिए जमे हुए लिस्टेरिया के लिए की तुलना में कम प्रतिशत ग्लिसरॉल (8%) में जमे हुए है.
  • -70 ° C पर जमे हुए लिस्टेरिया संक्रामक शेयरों आम तौर पर 3 महीने के लिए स्थिर रहे हैं. अगर 3 महीने से परे का उपयोग करते हुए, यह अनुशंसित है कि एक नए संक्रामक शेयर एक ताजा लिस्टेरिया संस्कृति से एक एचवीए प्लेट पर तैयार किया .
  • यदि thawed लिस्टेरिया संक्रामक शेयर की एकाग्रता (2.9 कदम) हौसले से तैयार के रूप में 2.7 और 2.8 कदम में वर्णित शेयर से अलग है (यानी CFU में> 20% गिरावट), तो एक नई जमी संक्रामक स्टॉक तैयार किया जाना चाहिए.
  • हालांकि शुरू में एक ही प्रयोग के लिए एक ताजा जीवाणु inoculum की तैयारी की तुलना में अधिक समय लेने, जमी लिस्टेरिया संक्रामक शेयरों की तैयारी CFU एकाग्रता का सही निर्धारण संक्रमण और प्रयोगों के बीच बेहतर स्थिरता जब चूहों ही जमे हुए स्टॉक से संक्रमित हैं करने से पहले सक्षम बनाता है.

3. लिस्टेरिया inoculum और चूहों की नसों में इंजेक्शन की तैयारी

  1. माउस प्रति इंजेक्शन जा लिस्टेरिया की एकाग्रता का निर्धारण करते हैं. अंतःशिरा इंजेक्शन के लिए, CFU 200 प्रति माउस μL inoculum में प्रयोग किया जाता है.
  2. लिस्टेरिया संक्रामक शेयर की एक जमे हुए विभाज्य (2.6 चरण) का पहले गला लें . वांछित लिस्टेरिया CFU एकाग्रता पीबीएस में संक्रामक शेयर पतला. सभी चूहों को इंजेक्शन करने के लिए सुनिश्चित करें कि वहाँ पर्याप्त इंजेक्शन और के निर्धारण के लिए inoculum है लिए आवश्यक मात्रा डबल लिस्टेरिया CFU पूर्व और पोस्ट इंजेक्शन (3.3 और 3.7 कदम) .
  3. तैयार लिस्टेरिया inoculum से 0.1 एमएल aliquots 2x निकालें, और प्रत्येक विभाज्य के लिए चूहों का इंजेक्शन पीबीएस में 1:10 कमजोर पड़ने से पहले तैयार है. प्लेट 0.1 एमएल एचवीए प्लेटों पर प्रत्येक कमजोर पड़ने के, और प्लेटें 37 पर रातोंरात सेते डिग्री सेल्सियस कालोनियों की संख्या की गणना और पूर्व इंजेक्शन लिस्टेरिया inoculum की एकाग्रता का निर्धारण: एकाग्रता (CFU / एमएल) = (कालोनियों की संख्या x कमजोर पड़ने कारक) एमएल / कि कमजोर पड़ने कारक के लिए मढ़वाया.
  4. एक साफ पिंजरे में इंजेक्ट किया माउस स्थानांतरण. गर्म ~ 50 सेमी एक 250 वाट अवरक्त दीपक के अंतर्गत 5 मिनट (अन्य उपयुक्त थर्मल उपकरणों है कि माउस या 40 डिग्री सेल्सियस का भी इस्तेमाल किया जा सकता है ऊपर पिंजरे के तापमान में वृद्धि नहीं जला देगा) के लिए पिंजरे रखकर माउस. पूंछ नस इंजेक्शन के लिए एक निरोधक डिवाइस में माउस रखें.
  5. धीरे लिस्टेरिया निलंबन का मिश्रण करने के लिए एक सुसंगत निलंबन हर बार एक सिरिंज भरी हुई है बनाए रखने.
  6. माउस के पार्श्व पूंछ नस का पता लगाएँ, धीरे से एक 70% इथेनॉल पोंछ और लिस्टेरिया inoculum के 200 μL (वांछित एकाग्रता में) एक 27 गेज सुई के साथ एक सिरिंज का उपयोग कर इंजेक्षन के साथ पोछ लो. संक्षेप में एक बाँझ धुंध के साथ प्रविष्टि घाव के लिए दबाव लागू होते हैं. अपने पिंजरे के लिए माउस लौटें.
  7. जब सभी चूहों के इंजेक्शन पूरा हो गया है, 3.3 कदम inoculum की शेष राशि का उपयोग करने के बाद इंजेक्शन लिस्टेरिया inoculum की एकाग्रता निर्धारित दोहराने.
  8. चूहों में लिस्टेरिया इंजेक्शन की राशि औसत से पूर्व और बाद इंजेक्शन लिस्टेरिया inoculum नमूने निर्धारित CFU के रूप में की सूचना दी है.

युक्तियाँ और नोट्स:

  • हम आम तौर पर 500 इंजेक्षन - 3000 CFU (2,500 की 200 μL CFU / एमएल - +१५,००० inoculum / CFU एमएल) जब एक प्रतिरोधी माउस (जैसे C57BL / 6) तनाव और एक अतिसंवेदनशील माउस तनाव (जैसे BALB / ग के बीच बैक्टीरियल बोझ और प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया की तुलना ).
  • यदि संक्रामक शेयर कम से कम 5 10 पीबीएस में पतला हो जाएगा, तो एक कपड़े धोने कदम आम तौर पर अवशिष्ट मीडिया / ग्लिसरॉल को हटाने की आवश्यकता नहीं है. यदि संक्रामक शेयर पीबीएस में कम से कम 5 10 नहीं पतला हो जाएगा, तो एक कपड़े धोने कदम 3.2 कदम में जोड़ा जाना चाहिए के रूप में निम्नानुसार अवशिष्ट मीडिया / ग्लिसरॉल को हटाने : एकdd 9 एमएल पीबीएस thawed संक्रामक शेयर और बैक्टीरिया 2100 XG पर centrifugation द्वारा 4 में 10 मिनट के लिए एकत्र करने के लिए डिग्री सेल्सियस सतह पर तैरनेवाला निकालें और 10 एमएल बाँझ पीबीएस, दोहराने centrifugation में pelleted बैक्टीरियल कोशिकाओं resuspend, और वांछित मात्रा में बैक्टीरिया कोशिका गोली resuspend. पूर्व और बाद इंजेक्शन लिस्टेरिया inoculum नमूने के रूप में 3.3 और 3.7 चरण में वर्णित से औसत CFU का निर्धारण करते हैं. यह उल्लेखनीय है कि इस कदम धोने बैक्टीरिया के कुछ नुकसान में परिणाम सकता है, और यह अनुशंसित है कि इस तरह के नुकसान पहले से निर्धारित किया और आवश्यक एकाग्रता के inoculum बनाने में के लिए जिम्मेदार है.
  • सुरक्षित और लिस्टेरिया के साथ माउस इंजेक्शन के बाद सिरिंज सुई त्यागें .

4. जिगर और तिल्ली के विश्लेषण के लिए लिस्टेरिया संक्रमित चूहों से हटाया

  1. वांछित समय बिंदु के बाद एक स्थानीय सीओ 2 asphyxiation जैसे पशु आचार समिति द्वारा अनुमोदित विधि का उपयोग संक्रमण संक्रमित माउस Euthanase .
  2. एक 1 एमएल सिरिंज और 25 गेज सुई का उपयोग इच्छामृत्यु के तुरंत बाद हृदय खून प्रदर्शन करना. जितना संभव हो उतना खून ले लीजिए. पित्ताशय निकालें और अवर रग Cava तोड़.
  3. ध्यान से सही करने के लिए आंतों को धक्का द्वारा यकृत पोर्टल शिरा बेनकाब, सिर की ओर और बाईं इतना जिगर जहां डायाफ्राम स्थित है बैठा है करने के लिए जिगर lobes फ्लिप. यकृत पोर्टल शिरा जिगर के तल में कम दाहिने हाथ की ओर से खिलाती है.
  4. यकृत पोर्टल नस में एक 26 गेज सुई का उपयोग 10 एमएल पीबीएस इंजेक्शन लगाने के द्वारा जिगर Perfuse. पीबीएस पोर्टल शिरा के माध्यम से इंजेक्शन कटे अवर रग Cava से बाहर निकल जाएगा. लिवर छिड़काव सुनिश्चित करता है कि काटा कोशिकाओं और रक्त परिसंचारी नहीं जिगर से कर रहे हैं.
  5. माउस शरीर गुहा, FACS बफर में जगह, और बर्फ पर दुकान से perfused जिगर निकालें. FACS विश्लेषण के लिए जिगर की तैयारी के लिए 5.1 कदम जाओ.
  6. माउस, FACS बफर में जगह है, और बर्फ पर दुकान से तिल्ली निकालें.
  7. पूरे तिल्ली, आधे में कटौती, वजन और एक आधा तौलना. प्लेस FACS बफर में एक आधा और 6.1 चरण पर जाएँ. बर्फ पर एक Stomacher बैग में दूसरे आधे प्लेस और 7.1 चरण पर जाएँ.

युक्तियाँ और नोट्स:

  • 4.5 और 4.6 चरणों में, पर पूरी तरह से ऊतक डूब पर्याप्त FACS बफर का उपयोग करने के लिए हवा के लिए ऊतक के किसी भी हिस्से के जोखिम को कम.
  • एक आधा इंच की लंबाई 26 गेज सुई है कि ~ 30 डिग्री द्वारा तुला हुआ है बेहतर यकृत पोर्टल शिरा में पीबीएस के इंजेक्शन की सुविधा कर सकते हैं.
  • जब ठीक से perfused, जिगर एक गहरे लाल रंग 1-2 एमएल पीबीएस इंजेक्शन के बाद हल्के भूरे रंग से बदल जाता है.
  • यदि जिगर FACS विश्लेषण के लिए आवश्यक नहीं है, छिड़काव जरूरी नहीं है. जिगर और अलग किया जा सकता है और एक Stomacher बैग में सीधे एकत्र संसाधित और चरण 7 में वर्णित के रूप में.
  • चूहों के इच्छामृत्यु के लिए, सीओ 2 asphyxiation पसंदीदा तरीका है क्योंकि यह जीवाणु और प्लीहा और जिगर में प्रतिरक्षा सेल व्यवहार्यता CFU पर न्यूनतम प्रभाव पड़ता है. यदि रक्त संग्रह की आवश्यकता नहीं है, गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था वैकल्पिक इच्छामृत्यु पद्धति के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है. यह अनुशंसा की जाती है कि इच्छामृत्यु तरीकों कि अंग वजन या प्रतिरक्षा सेल व्यवहार्यता को प्रभावित कर सकता है इस्तेमाल किया जा नहीं (जैसे thiobarbiturates).

5. यकृत सेल निलंबन के FACS विश्लेषण के लिए तैयार

  1. FACS बफर (4.5 कदम) के साथ एक 70 सुक्ष्ममापी सेल झरनी जो एक 60 मिमी पेट्री डिश के अंदर है में जिगर रखकर एकल कक्ष निलंबन उत्पन्न करता है. सेल का उपयोग कर एक 5 एमएल सिरिंज के सवार जब तक एक एकल कक्ष निलंबन का गठन किया है झरनी के माध्यम से ऊतक पुश.
  2. पेट्री डिश से 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब पेंच टोपी के लिए यकृत एकल कक्ष निलंबन और स्थानांतरण ठंड FACS बफर के साथ 40 एमएल के लिए कुल मात्रा को लाने.
  3. भंवर सेल निलंबन और एक 1 एमएल विभाज्य लेने के लिए जिगर के लिए जीवाणु लोड निर्धारित है. 7.3 कदम और Stomacher बैग में ऊतक homogenate के स्थान पर इस एक एमएल विभाज्य का उपयोग जाओ.
  4. गोली कोशिकाओं centrifugation द्वारा 4 में 5 मिनट के लिए 500 XG ° सी, पर 40 एमएल ठंड FACS बफर में सतह पर तैरनेवाला, resuspend गोली त्यागें, गोली 500 XG पर centrifugation द्वारा 4 5min के लिए कोशिकाओं डिग्री सेल्सियस, और सतह पर तैरनेवाला त्यागने.
  5. कमरे के तापमान पर 20 एमएल isotonic Percoll में सेल गोली Resuspend. कमरे के तापमान पर 12 मिनट के लिए 700 XG पर सेल निलंबन अपकेंद्रित्र. शीर्ष पर चल कोशिकाओं की सतह पर तैरनेवाला और डिस्क की तरह शीट (यानी hepatocytes) त्यागें. 4 एमएल टीएसी बफर में ल्युकोसैट युक्त गोली Resuspend अक्सर उलटा के साथ 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर एरिथ्रोसाइट्स और सेते कोशिकाओं lyse.
  6. एक नया 10 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब में 100 सुक्ष्ममापी नायलॉन झिल्ली के माध्यम से फ़िल्टर सेल निलंबन.
  7. बुनियाद 1 एमएल / FCS EDTA बफर के साथ सेल निलंबन फ़िल्टर्ड. के लिए 350 XG पर अपकेंद्रित्रमें 5 मिनट 4 डिग्री सेल्सियस, सतह पर तैरनेवाला त्यागने, और 5 एमएल / FACS EDTA बफर में resuspend.
  8. 5 मिनट के लिए 350 XG पर 4 सेल निलंबन ° अपकेंद्रित्र सी, सतह पर तैरनेवाला त्यागने और 0.5-3 एमएल / FACS EDTA गोली के आकार के आधार पर के बफर में resuspend सेल गोली.
  9. पतला सेल trypan नीले में निलंबन 1:05-1:20 5.8 चरण में निलंबन की मात्रा पर निर्भर करता है. व्यवहार्य यकृत hemacytometer का उपयोग कर leukocytes (चित्रा -4 ए) की गणना और निर्धारित के रूप में कुल व्यवहार्य कोशिकाओं: व्यवहार्य कोशिकाओं / अंग = गिनती क्षेत्र एक्स कमजोर पड़ने कारक कोशिकाओं की संख्या x 10 4 एक्स मात्रा ( एमएल). लिवर एकल कक्ष निलंबन तब इच्छित सेल सतह मार्करों के लिए विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ लेबल किया जा सकता है और FACS से विश्लेषण किया.

युक्तियाँ और नोट्स:

  • बर्फ पर कोशिकाओं रखें जब तक अन्यथा निर्दिष्ट.

6. प्लीहा - संबंधी निलंबन एकल कोशिका के FACS विश्लेषण के लिए तैयार

  1. FACS बफर के साथ एक 70 सुक्ष्ममापी सेल झरनी जो एक 60 मिमी पेट्री डिश के अंदर है में तिल्ली का एक आधा (4.7 कदम) रखकर एकल कक्ष निलंबन उत्पन्न करता है. धीरे सेल का उपयोग कर एक 5 एमएल सिरिंज के सवार जब तक एक एकल कक्ष निलंबन का गठन किया है झरनी के माध्यम से ऊतक धक्का.
  2. पेट्री डिश से एक 10 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब के लिए तिल्ली एकल कक्ष निलंबन और स्थानांतरण 10 एमएल ठंड FACS बफर का उपयोग करने के लिए कुल मात्रा को लाने.
  3. 4 में 5 मिनट के लिए 350 XG ° सी, पर centrifugation द्वारा गोली कोशिकाओं 4 एमएल टीएसी बफर में सतह पर तैरनेवाला resuspend सेल गोली त्यागने के लिए कमरे के तापमान पर अक्सर उलटा के साथ 10 मिनट के लिए, एरिथ्रोसाइट्स और सेते कोशिकाओं lyse.
  4. एक नया 10 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब में 100 सुक्ष्ममापी नायलॉन झिल्ली के माध्यम से फ़िल्टर सेल निलंबन.
  5. बुनियाद 1 एमएल / FCS EDTA बफर के साथ सेल निलंबन फ़िल्टर्ड. में 5 मिनट 4 ° C के लिए 350 XG पर अपकेंद्रित्र, सतह पर तैरनेवाला त्यागने, और 5 एमएल / FACS EDTA बफर में resuspend सेल गोली.
  6. 5 मिनट के लिए 350 XG पर 4 सेल निलंबन ° अपकेंद्रित्र सी, सतह पर तैरनेवाला त्यागने, और 3-8 एमएल / FACS EDTA गोली के आकार के आधार पर के बफर में resuspend सेल गोली.
  7. सेल निलंबन 1:10 पतला - trypan नीले (आसुत पानी में 0.4%) में 1:20 7.6 चरण में निलंबन की मात्रा पर निर्भर करता है. व्यवहार्य hemacytometer का उपयोग splenocytes गणना - अंग प्लीहा एकल कक्ष निलंबन प्रति कुल व्यवहार्य कोशिकाओं की गणना करने के लिए 5.9 चरण देख तो वांछित सेल सतह मार्करों के लिए विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ लेबल किया जा सकता है और FACS द्वारा विश्लेषण.

युक्तियाँ और नोट्स:

  1. बर्फ पर कोशिकाओं रखें जब तक अन्यथा निर्दिष्ट.

7. बैक्टीरियल लोड के लिस्टेरिया संक्रमित चूहों से ऊतकों में मापन

  1. Stomacher तिल्ली आधा युक्त बैग के शीर्ष मोड़ो. जबकि पकड़े Stomacher बैग रिसाव को रोकने के लिए बंद, एक साफ बेंच पर या एक लामिना का प्रवाह कैबिनेट में यह फ्लैट करना. ऊतक पर एक मोटी दौर कलम रोल जब तक ऊतक बैग के भीतर मसला हुआ है.
  2. पीबीएस के 5 मिलीलीटर प्रत्येक Stomacher मैश्ड ऊतक युक्त बैग जोड़ें. Stomacher Stomacher बैग में रखें, और 10 मिनट के लिए उच्च गति पर Stomacher चलाते हैं.
  3. Stomacher बैग (या यकृत सेल निलंबन के 1 एमएल विभाज्य) में एक विंदुक के साथ homogenate मिक्स. डुप्लिकेट में निम्न कार्य करें. एक 96 अच्छी तरह से फ्लैट नीचे प्लेट 300 μL स्थानांतरण. 96 अच्छी तरह से थाली के कुओं के भीतर प्रत्येक ऊतक homogenate नमूना के लिए एक 10 -5 कमजोर पड़ने 1:10 धारावाहिक dilutions (270 μL पीबीएस में 30 μL) प्रदर्शन.
  4. ध्यान से एक पूर्व सूखे एचवीए एक गिलास स्प्रेडर का उपयोग की थाली पर प्रत्येक कमजोर पड़ने का 0.1 एमएल फैल गया. 37 डिग्री सेल्सियस रातोंरात प्लेटें सेते हैं.
  5. प्रत्येक कमजोर पड़ने के लिए CFU की संख्या की गणना करें और ऊतकों के प्रति CFU गणना खाते में ऊतक के भाग (जैसे एक आधा तिल्ली), कमजोर पड़ने कारक है, और ऊतक homogenate की कुल मात्रा (5 एमएल या 40 एमएल) लेने: CFU ऊतक / CFU/0.1 = एमएल एक्स एक्स एमएल / ऊतक कारक कमजोर पड़ने, प्लीहा के लिए तिल्ली ऊतक homogenization के लिए इस्तेमाल किया नमूना का प्रतिशत वजन (4.7 कदम देखें) द्वारा इस संख्या को विभाजित.

युक्तियाँ और नोट्स:

  • कुल मात्रा के रूप में लंबे समय के रूप में एक समय में एक से अधिक Stomacher बैग Stomacher में रखा जा सकता है अधिकतम मात्रा से अधिक नहीं है के रूप में निर्माता द्वारा निर्दिष्ट
  • यदि एक Stomacher उपलब्ध नहीं है, एक ऊतक homogenizer के बजाय प्रयोग किया जा सकता है. वैकल्पिक रूप से, निम्न विधि, हालांकि के रूप में कुशल नहीं है, भी मैन्युअल रूप से 7.1 और 7.2 कदम की जगह में अंग सिझाना किया जा सकता है: एक मोहरबंद निष्फल प्लास्टिक की थैली में जगह अंग है और एक साफ बेंच पर रखना जबकि करने के लिए रिसाव को रोकने के लिए बंद बैग पकड़े . एक 500 एमएल प्रयोगशाला कांच की बोतल repetitively बैग रोल पर जब तक ऊतक अच्छी तरह से मैश किए हुए है. पीबीएस के प्रत्येक बैग के लिए 5 एमएल जोड़ें और 7.3 कदम आगे बढ़ना.
  • यह 7.4 कदम में बहुत महत्वपूर्ण है कि एचवीए प्लेटें अच्छी तरह से सूख जाना(यानी अगर पर कोई नमी). अन्यथा यह मुश्किल हो सकता है के लिए अलग लिस्टेरिया कालोनियों कि ठीक से गिना जा सकता है प्राप्त कर सकते हैं.
  • अगर वहाँ सीमित एचवीए प्लेटें हैं, एक वैकल्पिक 7.4 कदम है: एक पूर्व सूखे एचवीए (1.1 चरण) थाली में यह पांच से छह वर्गों, प्रत्येक कमजोर पड़ने के लिए में विभाजित के तल पर लाइनों ड्रा. ध्यान एचवीए थाली पर प्रत्येक ऊतक homogenate के लिए इसी वर्गों में प्रत्येक कमजोर पड़ने की 25 μL विंदुक - स्प्रेडर के साथ फैल नहीं करते. रुको जब तक ऊतक homogenate की बूँदें inverting थाली से पहले सूख रहे हैं. 37 डिग्री सेल्सियस रातोंरात पर थाली सेते हैं. 80 कालोनियों को एक अगर प्लेट पर एक बूंद की वजह से प्रतिष्ठित किया जा सकता है.
  • ऊतक homogenates के कमजोर पड़ने जानवर में लिस्टेरिया के विकास पर निर्भर है और इच्छामृत्यु के समय जानवर द्वारा प्रदर्शित लक्षण के आधार पर अनुमान लगाया जा सकता है हो सकता है. चूहों कि ज़ाहिर मरणासन्न कर रहे हैं, तो अतिरिक्त dilutions आवश्यक हो करने के लिए और अधिक सही जीवाणु लोड निर्धारित कर सकते हैं. लिस्टेरिया या संक्रमण की अवधि के अंत में euthanased चूहों की कम खुराक के साथ inoculated चूहों के लिए, undiluted ऊतक homogenate जीवाणु लोड निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
  • प्लेट्स 37 में incubated किया जा सकता डिग्री सेल्सियस रातोंरात या 2-3 दिनों के लिए कमरे के तापमान पर.

8. प्रतिनिधि परिणाम:

एक मानक संक्रमण के प्रयोग के लिए, एक जमे हुए ग्लिसरॉल स्टॉक से लिस्टेरिया प्राप्त हुई थी और एक एचवीए प्लेट पर रेखादार के रूप में चित्र 1 में दिखाया गया है. यदि कुछ कालोनियों streaking के बाद प्राप्त कर रहे हैं, यह गरीब streaking या इष्टतम जमे हुए शेयर की तुलना में एक कम संकेत हो सकता है. एक लिस्टेरिया संक्रामक शेयर हौसले रेखादार एचवीए थाली से तैयार किया गया था है और -70 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत बैक्टीरियल निकासी और प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को मापने के लिए, हम नियमित रूप से 2500 CFU / एमएल thawed लिस्टेरिया संक्रामक शेयर पतला - 15,000 CFU / एमएल और उन्हें 500 के साथ संक्रमित - 3000 CFU 200 μL के साथ चूहों इंजेक्षन. हम पालन कि इस प्रोटोकॉल का उपयोग लिस्टेरिया के उप घातक खुराक के साथ संक्रमित चूहों transiently पहले कुछ दिनों के भीतर झालरदार फर, hunched मुद्रा और वजन घटाने प्रदर्शन कर सकते हैं. ये लक्षण गंभीर रूप से कैसे एक व्यक्ति माउस संक्रमण से प्रभावित है के रूप में एक दृश्य संकेत प्रदान करते हैं, चाहे वह (यानी एक "स्पष्ट" ग़ैर) समूह के बाकी के लिए अलग तरह से प्रतिक्रिया, और इच्छामृत्यु आवश्यक है कि अत्यधिक दुख और आसन्न मृत्यु को रोकने के लिए संक्रमण के कारण.

परिणाम 2-5 आंकड़े द्वारा प्रतिनिधित्व में, चूहों लिस्टेरिया संक्रामक शेयर के हौसले से thawed विभाज्य का उपयोग संक्रमित थे. अलग अलग समय बिंदुओं पर संक्रमण के बाद, चूहों euthanased थे और जिगर और तिल्ली हटा दिया गया. चित्रा 2 एक एचवीए थाली जिस पर एक माउस से पतला तिल्ली homogenate सुसंस्कृत था दिखाता है. कालोनियों की संख्या में एक स्पष्ट कमी के रूप में कमजोर पड़ने कारक उच्च हो जाता है चाहिए, जैसे कि अलग CFU गिनती कम से कम दो dilutions के लिए संभव है. यदि माउस लिस्टेरिया संक्रमण (यानी पता लगाने सीमा = 100 CFU / ऊतक) को मंजूरी दे दी है, तो <5 लिस्टेरिया कालोनियों एचवीए थाली कि undiluted ऊतक homogenate के 200 μL के साथ फैल गया था पर उपस्थित रहेंगे . यदि जिगर और तिल्ली या / आंतों या अन्य बाहरी जीवाणु के साथ अलगाव के दौरान दूषित हो गया है, एचवीए प्लेट पर कालोनियों अलग आकारिकी (यानी विशेषता प्रभामंडल और लिस्टेरिया कालोनियों का पीला रंग नहीं होगा) और / या किया जा सकता है प्रदर्शन की संभावना के लिए क्या उम्मीद है कॉलोनी मायने में अलग लिस्टेरिया (यानी बहुत कुछ या बहुत सारे). चित्रा 3 C57BL 6 / चूहों के लिए एक ठेठ लिस्टेरिया मंजूरी वक्र से पता चलता है - कृपया ध्यान दें कि आम तौर पर जिगर की तुलना तिल्ली से लिस्टेरिया और अधिक जल्दी से मंजूरी दे दी है और पांच दिनों के संक्रमण के बाद जब तक कि मंजूरी नहीं होता है.

चित्रा 4 सेल एकल कोशिका और संक्रमित चूहों की तिल्ली जिगर से संक्रमण के बाद अलग अलग समय बिंदुओं पर तैयार निलंबन पर आधारित मायने रखता है दिखाता है. इस विधि एकल कोशिका जिगर और तिल्ली से> 80% से तैयार निलंबन में> 95% ल्युकोसैट शुद्धता को प्राप्त कर सकते हैं. ल्युकोसैट शुद्धता FACS अखिल ल्युकोसैट CD45 मार्कर (क्लोन 30-F11) के लिए एक मोनोक्लोनल एंटीबॉडी विशिष्ट का उपयोग विश्लेषण द्वारा निर्धारित किया जा सकता है. आमतौर पर, यह अवधि के लिए एक बड़ा यकृत leukocytes में वृद्धि गुना प्रदर्शन जिगर के साथ संक्रमण स्पष्ट लेता के दौरान splenocytes और यकृत leukocytes की संख्या बढ़ाने के लिए, लेकिन एक काफी छोटे कुल तिल्ली में splenocytes की वृद्धि की तुलना में. और प्रतिरक्षा कोशिकाओं के प्रकार और संख्या सेल सतह मार्कर के लिए विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ एकल कक्ष निलंबन लेबलिंग के द्वारा निर्धारित किया जा सकता है. लेबल कोशिकाओं तो FACS विश्लेषण से पता लगाया जा सकता है. चित्रा 5 CD8 + टी कोशिकाओं के लिए प्रतिनिधि परिणाम प्रदान करता है . C57BL 6 / चूहों में एक मानक लिस्टेरिया संक्रमण के दौरान, सीडी 8 की संख्या + टी कोशिकाओं transiently तिल्ली में lymphopenia के कारण दिन 2-3 befor में घट जाती हैई दिन 5 पोस्ट संक्रमण से ज़ाहिर दोनों प्लीहा और यकृत में वृद्धि.

चित्रा 1
चित्रा 1. एचवीए थाली लिस्टेरिया के साथ रेखादार. एक बाँझ inoculating पाश एक जमे हुए ग्लिसरॉल स्टॉक से लिस्टेरिया लकीर के लिए इस्तेमाल किया गया था. प्लेट 37 डिग्री सेल्सियस रातोंरात incubated था. विशेषता व्यक्तिगत कालोनियों आसपास के प्रभामंडल β-hemolysis के लिए कारण है.

चित्रा 2
चित्रा 2. ऊतक एक लिस्टेरिया संक्रमित एचवीए प्लेटों पर सभ्य माउस से homogenate. जिगर एक लिस्टेरिया संक्रमित / 3 दिनों के बाद संक्रमण के 6 माउस C57BL से काटा गया था . ऊतक homogenate तैयार किया गया था और से प्रत्येक 1:10 कमजोर पड़ने के लिए 100 μl पूर्ण दस -4 (ए) के कमजोर पड़ने और 10 -5 कमजोर पड़ने (बी) के लिए फैल थाली, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से एक एचवीए प्लेट पर 25 μl बूँदें के रूप में रखा dilutions 10 को undiluted -5 (सी). प्लेटें 37 डिग्री सेल्सियस रातोंरात पर incubated रहे थे. dilutions कि व्यक्तिगत कालोनियों की गिनती सक्षम करने के लिए उस समय के बाद संक्रमण बिंदु पर बैक्टीरिया लोड (यानी CFU / ऊतक) निर्धारित किया जाता है.

चित्रा 3
चित्रा 3 संक्रमित C57BL / 3 पर 6 चूहों और 7 दिन के बाद संक्रमण की प्लीहा और जिगर में लिस्टेरिया लोड. C57BL 6 / चूहों ~ लिस्टेरिया के 2000 CFU से संक्रमित थे. प्रत्येक समय बिंदु पर, चूहों euthanased थे perfused जिगर और तिल्ली के साथ काटा, और प्लीहा - संबंधी homogenate (ए) या यकृत एकल सेल निलंबन (बी) के dilutions एचवीए प्लेटों पर सुसंस्कृत थे जीवाणु लोड निर्धारित है. ठोस लाइनों ज्यामितीय माध्य से संकेत मिलता है, और ऊर्ध्वाधर सलाखों SEM से संकेत मिलता है. डॉटेड रेखा इंगित करता है कि जीवाणु लोड की सही माप के लिए पता लगाने सीमा के इस प्रयोग के लिए 100 CFU / अंग है.

चित्रा 4
चित्रा 4 संक्रमित चूहों से ऊतकों के लिए व्यवहार्य सेल मायने रखता है . C57BL 6 / चूहों ~ लिस्टेरिया के 2000 CFU से संक्रमित थे. प्रत्येक समय बिंदु पर, चूहों euthanased जिगर perfused थे और तिल्ली के साथ काटा. कक्ष trypan नीले के साथ दाग थे और एक hemacytometer का उपयोग कर 5.9 चरण (ए) में वर्णित के रूप में गिना. Splenocyte (बी) और यकृत (सी) ल्युकोसैट एकल कोशिका लिस्टेरिया संक्रमित चूहों से तैयार निलंबन से प्राप्त मायने रखता है. लाइन्स ज्यामितीय मतलब संकेत मिलता है.

चित्रा 5
चित्रा 5 सीडी 8 की FACS विश्लेषण + लिस्टेरिया संक्रमित चूहों में टी कोशिकाओं. C57BL 6 / चूहों ~ लिस्टेरिया के 2000 CFU से संक्रमित थे. प्रत्येक समय बिंदु पर, चूहों euthanased जिगर perfused थे और तिल्ली के साथ काटा. एकल कक्ष निलंबन टी कोशिकाओं (CD3, TCRβ, सीडी 4, सीडी 8) के लिए विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ दाग रहे थे. (ए) सीडी 8% के साथ प्रतिनिधि FACS प्रोफाइल + टी कोशिकाओं + / - SEM . (बी) कुल CD8 + टी कोशिकाओं तिल्ली में. (सी) जिगर में कुल CD8 + टी कोशिकाओं.

Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

लेखकों के लिए सलाह और अभिकर्मकों के लिए अन्ना Walduck, क्रिस्टीना चीयर्स, स्टुअर्ट Berzins, डेल गॉडफ्रे, Yifan Zhan और जोनाथन Wilksch धन्यवाद देना चाहूंगा. यह काम किशोर मधुमेह अनुसंधान फाउंडेशन (1-2008-602) और ऑस्ट्रेलियाई राष्ट्रीय स्वास्थ्य और चिकित्सा अनुसंधान परिषद (575,552) द्वारा वित्त पोषित किया गया था. एनडब्ल्यू एक ऑस्ट्रेलियाई स्नातकोत्तर पुरस्कार द्वारा समर्थित है. ओ ऑस्ट्रेलियाई राष्ट्रीय स्वास्थ्य चिकित्सा अनुसंधान परिषद से एक आरडी राइट फैलोशिप द्वारा समर्थित है.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Horse blood agar base No.2 Oxford Labware CM0271 Preparation of agar base for HBA plates
Horse blood (defibrinated) Oxford Labware HB1000 Add 5-10% to agar base
Brain heart infusion (BHI) broth (10 mL) Oxford Labware TM456
Brain heart infusion dehydrated media Oxford Labware CM1135
96-well flat bottom plate BD Biosciences 353072
70 μm cell strainer BD Biosciences 352350
Small petri dish BD Biosciences 351007
Stomacher 80 biomaster lab system Seward
Plastic Stomacher bags Sarstedt Ltd 86 9924 530
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich A3912
FACS buffer 0.1% (w/v) bovine serum albumin in PBS
Isotonic Percoll (33.75% Percoll in PBS) GE Healthcare 17-0891-01 33.75mL Percoll, 3.75mL 10x PBS, 62.5mL 1x PBS makes 100mL isotonic Percoll
TAC Buffer 17mM Tris, 140mM ammonium chloride in distilled water
FCS/EDTA buffer Fetal calf serum with 10mM EDTA
FACS/EDTA buffer FACS buffer + 5mM EDTA
Trypan blue Sigma-Aldrich T6146 0.4% (w/v) in PBS, filter sterilized
2mL Cryovial Greiner Bio-One 121263
27 gauge/1mL insulin syringe Terumo Medical Corp. SS10M2713
Needle Terumo Medical Corp. NN-2516R (25G 5/8in) NN-2613R (26G 1/2in)
Syringe Terumo Medical Corp. SS-01T (1mL), SS-053 (5mL), SS-10S (10mL)

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References

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इम्यूनोलॉजी 54 अंक लिस्टेरिया intracellular जीवाणु आनुवंशिक संवेदनशीलता जिगर तिल्ली रक्त FACS विश्लेषण टी कोशिकाओं
से संक्रमित चूहों में बैक्टीरियल लोड और इम्यून प्रतिक्रियाएँ माप<em> लिस्टेरिया monocytogenes</em
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Wang, N., Strugnell, R., Wijburg,… More

Wang, N., Strugnell, R., Wijburg, O., Brodnicki, T. Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes. J. Vis. Exp. (54), e3076, doi:10.3791/3076 (2011).

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