Summary
Listeria monocytogenes ist ein Modellorganismus für die Untersuchung Immunreaktionen und die genetische Anfälligkeit für Bakterien bei Mäusen intrazellulär. Diese Methode ermöglicht ein bis bakterielle Belastung zu messen und generieren Single-Cell-Suspensionen der Leber und Milz von Mäusen für FACS-Analyse auf Veränderungen in Immunzellen durch Listeria-Infektion zu bestimmen.
Abstract
Listeria monocytogenes (Listerien) ist ein Gram-positive fakultativ intrazellulären Erregers 1. Maus-Studien typischerweise intravenöser Injektion von Listeria, was zu einer systemischen Infektion 2. Nach der Injektion Listeria schnell verbreitet, die Milz und Leber durch die Aufnahme durch CD8α + dendritischen Zellen und Kupffer-Zellen 3,4. Sobald phagozytiert, ermöglichen verschiedene bakterielle Proteine Listeria dem Phagosom entkommen, überleben im Cytosol und infizieren benachbarte Zellen 5. In den ersten drei Tagen der Infektion, vermitteln verschiedene angeborene Immunsystem-Zellen (zB Monozyten, Neutrophilen, NK-Zellen, dendritische Zellen) bakterizide Mechanismen, Listeria Verbreitung zu minimieren. CD8 + T-Zellen werden anschließend rekrutiert und für den eventuellen Clearance von Listerien aus dem Host, in der Regel innerhalb von 10 Tagen der Infektion 6.
Erfolgreiche Clearance von Listerien aus infizierten Mäusen hängt von der entsprechenden Auftreten von Host Immunantwort 6. Es gibt ein breites Spektrum an Empfindlichkeiten unter Inzucht-Mausstämmen 7,8. Generell sind Mäuse mit einer erhöhten Anfälligkeit für Listeria Infektion weniger in der Lage, bakterielle Vermehrung steuern, zeigen erhöhte bakterielle Belastung und / oder verzögerte Clearance im Vergleich zu resistenten Mäusen. Genetische Studien, einschließlich Kopplungsanalyse und Knockout-Maus-Stämme wurden verschiedene Gene für die Sequenzvariation betrifft Host Reaktionen auf Listeria Infektion 6,8-14 identifiziert. Ermittlung und Vergleich der Infektion Kinetik zwischen verschiedenen Mausstämmen ist daher eine wichtige Methode zur Identifizierung von Host-genetischen Faktoren, die die Immunantwort gegen Listeria beitragen. Vergleich der Host-Reaktionen auf verschiedene Listeria-Stämme ist auch ein effektiver Weg zur bakteriellen Virulenzfaktoren, die als potenzielle Ziele für Antibiotika-Therapie oder Impfstoff-Design dienen könnten, zu erkennen.
Wir beschreiben hier eine einfache Methode zur Messung der Keimbelastung (Kolonie bildende Einheiten [KBE] pro Gewebe) und die Vorbereitung Single-Cell-Suspensionen der Leber und der Milz für FACS-Analyse von Immunantworten in Listeria-infizierten Mäusen. Diese Methode ist besonders nützlich für die erstmalige Charakterisierung von Listeria-Infektionen bei neuartigen Maus-Stämme, sowie Vergleich der Immunantworten zwischen verschiedenen Mausstämmen mit Listeria infiziert. Wir nutzen die Listeria monocytogenes EGD-Stamm 15, die, wenn sie auf Blutagar kultiviert, weist eine charakteristische halo-Zone um jede Kolonie durch β-Hämolyse 1 (Abbildung 1). Bakterielle Belastung und Immunreaktionen können jederzeit-Punkt nach der Infektion durch Kultivierung Gewebehomogenat auf Blutagarplatten und Vorbereitung Gewebe Zellsuspensionen für FACS-Analyse unter Verwendung der Protokolle im Folgenden beschrieben wird. Wir möchte darauf hinweisen, dass Personen, die immungeschwächte oder schwanger sind, sollten nicht mit Listeria, und die einschlägigen institutionellen Kommission für Biosicherheit und Tier Facility Management sollte konsultiert werden, bevor die Arbeit beginnt werden.
Protocol
1. Kultivierung und Langzeitlagerung von Listeria monocytogenes (Listerien)
- Machen oder kaufen vorgefertigte Pferdeblut-Agar (HBA)-Platten. Dry Platten vor, die von Pre-Inkubation bei 37 ° C zu verwenden Nacht oder Platzierung entdeckt in einem Reinraumgehäuse für 1 Stunde.
- Erhalten lebensfähig Listerien aus einer der folgenden: eine infizierte Maus Gewebehomogenat, eine lyophilisierte Lager, ein gefrorenes Glycerin Lager, oder eine Kolonie aus einer aktuellen Listeria Kultur (dh weniger als eine Woche alt und nicht subkultiviert mehr als 10 Generationen) . Alle Listeria sollte unter Verwendung einer sterilen Impföse und beschäftigt aseptische Techniken für alle Methoden in diesem Protokoll beschrieben werden.
- Streak Listeria auf einem HBA Platte wie in Abbildung 1 dargestellt mit einer sterilen Impföse: Streifen Listeria über ¼ der Plattenoberfläche als primäres Inokulum zu verbreiten. Machen Sie eine Reihe von unidirektionalen Streifen aus dem primären verbreiten. Wiederholen Sie die Streifenbildung 2-3 mal mit einem frisch oder erneut sterilisiert Schleife vor jedem Satz von Schlieren. Die Platten bei 37 ° C über Nacht.
- Shop Listeria HBA Platte bei 4 ° C für einen Zeitraum von 1 Monat oder gehen zu 1,5 Schritt, um Listeria Kultur für Langzeitlagerung vorbereitet.
- Wählen Sie eine einzelne Kolonie von einem frischen Listeria Kultur auf einem HBA Platte mit einem sterilisierten Impföse und Animpfen von 10 ml Brain Heart Infusion (BHI) Brühe (Vorbereitung nach den Anweisungen des Herstellers) in einem 30 mL McCartney-Flasche.
- Inkubieren Sie die Listeria Kultur in einem Schüttler bei 180rpm bei 37 ° C über Nacht.
- Add sterile 80% Glycerin (v / v), flüssige Listeria Kultur im Verhältnis 1:1, um eine endgültige Glycerin-Konzentration von 40% (v / v) zu erhalten. Transfer 0,5-1 ml Aliquots in Kryoröhrchen und speichern Listeria / Glycerin Aktien bei -70 ° C.
Tipps & Hinweise:
- Wachstum von Listeria kann bei verschiedenen nicht-selektiven Medien, wie eine Reihe von Blut-Agar (supplementiert mit Pferd, Schaf, Meerschweinchen oder menschlichem Blut), Brain Heart Infusion (BHI)-Agar oder Bouillon oder CASO-Bouillon mit Hefe unterstützt werden extract (TSB-YE). Kontaminierende Wachstum in der Kultur, indem Antibiotika zu den Medien für Listeria-Stämme mit definierten Antibiotika-Resistenz (zB L. monocytogenes 10403S), oder durch Verwendung Oxford Medien, die selektiv unterstützen das Wachstum von Listeria minimiert werden.
- Wenn Listerien aus einer ungeprüften Quelle erhalten wird, empfiehlt es sich, dass zusätzliche Tests durchgeführt, um die Identität der zu bestätigen Listeria (L. monocytogenes ist Gram-positive, nicht sporenbildende, bewegliche bei <30 ° C, fakultativ anaerobe, Katalase-positiv, und Oxidase negativ). Die erhaltenen Kultur kann auch auf Listeria-Selektiv-Medium gezüchtet werden, um sicherzustellen, dass eine reine Kultur gewonnen wird.
- Das Trocknen der HBA Platten gewährleistet, dass es eine optimale Trennung von Bakterienkolonien auf der Platte.
- Bei der gefrorenen Glycerin Aktien von Listeria, verwenden Sie frisches HBA Listeria Kulturen, die weniger als 1 Woche alt und subkultiviert für so wenige Generationen wie möglich (<5 am besten) sind.
- Bei der Ableitung von frischen Listeria Kulturen aus einem gefrorenen Glycerin Lager, sollte der erste Durchgang auf festem Medium (dh HBA-Platten) hergestellt werden, da Listeria erhalten aus gefrorenen Glycerin Aktien wachsen schlecht, wenn sie direkt in flüssigen Medium subkultiviert.
2. Zubereitung und Aufbewahrung von Listeria infektiöse Material für in-vivo-Infektion Studien
- Streak Listeria aus einem gefrorenen Glycerin Lager (Schritt 1,7) auf einen HBA Platte wie in Schritt 1.3 beschrieben. Die Platten bei 37 ° C über Nacht für den Einsatz auf den nächsten Tag.
- Wählen Sie ein einzelnes Listeria Kolonie von einer Ader Kultur und impfen einem 10 ml BHI-Bouillon. Vermeiden Sie die Übertragung Agar in die Brühe.
- Inkubieren Sie die Listeria BHI Kultur in einem Schüttler bei 180 rpm und 37 ° C bis Mitte logarithmischen Phase (OD600 = ~ 0,4). Dies dauert in der Regel 3-4 Stunden.
- Nehmen Sie ein 0,9 ml Aliquot aseptisch und erhalten eine OD Lesen bei 600 nm in 3-4 Stunden zu schütteln. Wenn OD Lesung ist <0,3, dann die Kultur weiterhin in einem Schüttler bei 180 rpm und 37 ° C bis OD Lesung ist ~ 0,4.
- 1 ml sterile 80% Glycerin (v / v) zu 10 ml Listeria BHI-Bouillon-Kultur (OD600 ~ 0,4). Vorsichtig mischen und Transfer in 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen in 0,5-1 ml Aliquots.
- Legen Sie die Aliquots auf Eis für 10 min und bei -70 ° C. Lassen Sie ein Aliquot aufgetaut, um die Konzentration von Listeria in die infektiösen Lager, die typischerweise in der Größenordnung von 10 9 CFU / ml zu bestimmen.
- Führen 01.10 serielle Verdünnungen der unfrozen Listeria infektiöse Lager in PBS bis 10 -8 Verdünnung. Verbreiten Sie 100 ul unverdünnter und jede weitere Verdünnung auf vorgetrocknet HBA-Platten (Schritt 1,1) in zweifacher Ausfertigung mit einem Glas Streuer. Die Platten bei 37 ° C über Nacht.
- Zählen Sie die Anzahl der Kolonien auf jeder Platte und bestimmen Sie die Listeria Konzentration des gefrorenen infektiösen Stammkultur mit folgender Berechnung: Konzentration (KBE / ml) = Anzahl der Kolonien x Verdünnungsfaktor / 0,1 mL. Die Platten für die Zählung gewählt werden sollte idealerweise 30-300 Kolonien, um eine zuverlässige Schätzung der CFU-Konzentration von lebensfähigen Bakterien zu gewährleisten.
- Ein paar Tage nach dem Speichern Listeria infektiöse Lager bei -70 ° C, auftauen einer Röhre. Bestimmen Sie die Konzentration an lebensfähigen Listeria wie in den Schritten 2.7 und 2.8 beschrieben. Diese Konzentration sollte ähnlich sein wie für die frisch zubereiteten infektiösen Lager in Schritt 2,8 ermittelt.
Tipps & Hinweise:
- Listeria infektiöse Aktie bei einem niedrigeren Prozentsatz Glycerin (8%) als für Listeria für allgemeine langfristige Lagerung (40%) eingefroren eingefroren.
- Gefrorene Listeria infektiöse Aktien sind in der Regel bei -70 ° C stabil bis zu 3 Monaten. Wenn Sie länger als 3 Monate, ist es empfehlenswert, einen neuen infektiösen Lager aus einer frischen Listeria Kultur auf einem HBA Platte vorbereitet werden.
- Wenn die Konzentration des aufgetauten Listeria infektiöse Lager (Schritt 2,9) unterscheidet sich von den frisch zubereiteten Lager wie in den Schritten 2.7 und 2.8 beschrieben (dh> 20% Rückgang in CFU), dann eine neue eingefroren infektiösen Material sollte vorbereitet werden.
- Obwohl anfangs mehr Zeit in Anspruch als die Vorbereitung einer frischen Bakterienkultur Inokulum für ein einzelnes Experiment, Zubereitung von Tiefkühl-Listeria infektiöse Aktien ermöglicht eine genaue Bestimmung der CFU-Konzentration vor der Infektion und eine bessere Kohärenz zwischen den Experimenten bei Mäusen aus dem gleichen eingefroren Lager infiziert sind.
3. Vorbereitung von Listeria Inokulum und intravenöse Injektion von Mäusen
- Bestimmen Sie die Konzentration von Listeria pro Maus injiziert werden. Zur intravenösen Injektion wird CFU in 200 ul Inokulum pro Maus.
- Tauen Sie eine gefrorene Aliquot Listeria infektiöse Lager (aus Schritt 2.6). Verdünnen Sie die ansteckende Lager in PBS auf die gewünschte Listeria CFU-Konzentration. Doppelklicken Sie die Lautstärke für die Injektion alle Mäuse, um sicherzustellen, dass genügend Impfstoff zur Injektion und Bestimmung der benötigten die Listeria CFU Pre-und Post-Injektion (Schritt 3,3 und 3,7).
- Entfernen Sie 2x 0,1 ml Aliquots aus den vorbereiteten Listeria Inokulum und bereiten eine 1:10 Verdünnung in PBS für jedes Aliquot vor der Injektion von Mäusen. Platte 0,1 ml jeder Verdünnung auf HBA-Platten, und inkubieren Sie die Platten über Nacht bei 37 ° C. Zählen Sie die Anzahl der Kolonien und bestimmen die Voreinspritzung Konzentration der Listeria Inokulum: Konzentration (CFU / ml) = (Anzahl der Kolonien x Verdünnungsfaktor) / mL für diesen Verdünnungsfaktor überzogen.
- Übertragen Sie die Maus in einen sauberen Käfig injiziert werden. Warm mit der Maus, indem Sie den Käfig ~ 50 cm unter einer 250 Watt Infrarotlampe für 5 min (andere geeignete thermische Geräte, die nicht brennen mit der Maus oder erhöhen Sie die Temperatur des Käfigs über 40 ° C kann ebenfalls verwendet werden). Platzieren Sie die Maus in einer Rückhalteeinrichtung für Schwanzvene Injektionen.
- Vorsichtig mischen die Listeria Suspension eine konsistente Federung jedes Mal eine Spritze geladen wird.
- Suchen Sie die laterale Schwanzvene der Maus, vorsichtig mit einem 70% igem Ethanol abwischen und injizieren 200 ul der Listeria Inokulum (bei gewünschten Konzentration) mit Hilfe einer Spritze mit einer 27-Gauge-Nadel zu wischen. Kurz Druck auf Eintrag Wunde mit einer sterilen Gaze. Bringen Sie die Maus an seinem Käfig.
- Wenn Injektion von allen Mäusen abgeschlossen ist, wiederholen Sie Schritt 3.3 mit der restlichen Menge des Inokulums auf die post-Injektion Konzentration der Listeria Inokulum zu bestimmen.
- Die Höhe der Listeria injiziert in Mäuse wird als Mittelwert CFU aus der Vor-und Nacheinspritzung Listeria Inokulum Proben bestimmt gemeldet.
Tipps & Hinweise:
- Wir typischerweise injizieren 500 - 3.000 CFU (200 ul von 2.500 CFU / ml - 15.000 KBE / mL Inokulum) beim Vergleich von bakteriellen Belastung und Immunreaktionen zwischen einem resistenten Mausstämmen (zB C57BL / 6) und einer empfänglichen Mausstämmen (zB BALB / c ).
- Wenn der infektiösen Lager wird in PBS von mindestens 10 5 verdünnt werden, dann ein Waschschritt wird in der Regel nicht erforderlich, um restliches Medium / Glycerin zu entfernen. Wenn der infektiösen Lager nicht in PBS von mindestens 10 5 verdünnt werden, dann ein Waschschritt sollte in Schritt 3.2 hinzugefügt werden, um restliches Medium / Glycerin wie folgt zu entfernen: Eindd 9 mL PBS aufgetaut infektiösen Material und Bakterien durch Zentrifugation bei 2100 xg gesammelt für 10 min bei 4 ° C. Überstand entfernen und Resuspendieren der pelletierten Bakterienzellen in 10 mL sterilem PBS, wiederholen Zentrifugation und Resuspendieren der bakteriellen Zell-Pellet in der gewünschten Lautstärke. Bestimmen Sie die mittlere CFU aus der Vor-und Nacheinspritzung Listeria Inokulum Proben wie in Schritt 3.3 und 3.7 beschrieben. Es wird darauf hingewiesen, dass dieser Waschschritt kann in einem gewissen Verlust von Bakterien führen, und es wird empfohlen, dass dieser Verlust im Voraus bestimmt werden und betrug bei der Herstellung des Inokulums der erforderlichen Konzentration.
- Sicher entsorgen Spritze und Nadel nach der Injektion Maus mit Listeria.
4. Entfernung von Leber und Milz von Listeria-infizierten Mäusen zur Analyse
- Euthanase der infizierten Maus an den gewünschten Zeitpunkt nach der Infektion mit einem Verfahren durch die lokale Tier-Ethik-Kommission, wie CO 2 Ersticken genehmigt.
- Führen Herz bluten unmittelbar nach Euthanasie mit einer 1 ml Spritze und 25-Gauge-Nadel. Sammeln Sie so viel Blut wie möglich. Entfernen der Gallenblase und durchtrennen die untere Hohlvene.
- Expose der Pfortader durch vorsichtiges Drücken Darm nach rechts, drehen Sie den Leberlappen zum Kopf und auf der linken Seite, so dass die Leber sitzt, wo die Membran befindet. Die Pfortader-Feeds in die Unterseite der Leber von der unteren rechten Seite.
- Perfundieren der Leber durch die Injektion von 10 ml PBS in die Pfortader mit einer 26-Gauge-Nadel. PBS über die Pfortader injiziert wird aus den abgetrennten unteren Hohlvene zu verlassen. Leberperfusion stellt sicher, dass geernteten Zellen aus der Leber und nicht das zirkulierende Blut.
- Entfernen Sie die perfundierten Leber der Maus die Körperhöhle, in FACS-Puffer, und speichern Sie auf dem Eis. Gehe auf 5,1 für die Vorbereitung der Leber für FACS-Analyse Schritt.
- Entfernen der Milz der Maus, in FACS-Puffer, und speichern Sie auf dem Eis.
- Wiegen Sie die ganze Milz, in zwei Hälften geschnitten und wiegen eine der Hälften. Legen Sie eine Hälfte in FACS-Puffer und gehen bis 6,1 Schritt. Legen Sie die andere Hälfte in einem Stomacherbeutel auf Eis und gehen bis 7,1 Schritt.
Tipps & Hinweise:
- In den Schritten 4.5 und 4.6, verwenden Sie ausreichend FACS-Puffer vollständig untertauchen das Gewebe um die Exposition von irgendeinem Teil des Gewebes, um Luft zu minimieren.
- Ein ½-Zoll-Länge 26-Gauge-Nadel, die von ~ 30 Grad gebogen ist besser zu erleichtern Injektion von PBS in die Pfortader.
- Wenn perfundierten richtig, schaltet sich die Leber von einem dunkelroten Farbe braun nach der Injektion von 1-2 ml PBS Licht.
- Wenn die Leber ist nicht für die FACS-Analyse erforderlich ist, Perfusion nicht notwendig. Die Leber kann isoliert und direkt in eine Stomacherbeutel erhoben und verarbeitet, wie in Schritt 7 beschrieben.
- Für Euthanasie der Mäuse, ist der CO 2-Erstickung die bevorzugte Methode, da es nur minimale Auswirkungen auf bakterielle KBE und Immunsystem die Lebensfähigkeit der Zellen in der Milz und Leber. Wenn die Blutentnahme nicht erforderlich ist, kann Genickbruch als alternative Euthanasie-Methode verwendet werden. Es wird empfohlen, dass die Sterbehilfe Methoden, die Orgel Gewicht oder Immunzellen Lebensfähigkeit beeinträchtigen können nicht verwendet werden (z. B. thiobarbiturates) werden.
5. Vorbereitung der Leber Zellsuspension für FACS-Analyse
- Generieren Sie Single-Zellsuspensionen, indem Leber mit FACS-Puffer (Schritt 4,5) in einem 70 um Zellsieb, die innerhalb einer 60 mm Petrischale wird. Schieben Sie das Gewebe durch die Zelle Sieb mit dem Kolben einer 5 ml Spritze, bis ein Single-Cell-Suspension entsteht.
- Übertragen Sie die hepatische Einzel-Zellsuspension aus der Petrischale zu einem konischen 50 ml mit Schraubverschluss Rohr und bringt das Gesamtvolumen auf 40 ml mit kaltem FACS-Puffer.
- Vortex Zellsuspension und werfen Sie einen 1 mL Aliquot auf bakterielle Belastung für die Leber zu bestimmen. Gehe auf 7,3 Schritt und verwenden Sie diese 1 mL Aliquot statt Gewebehomogenat in Stomacherbeutel.
- Pellet-Zellen durch Zentrifugation bei 500 xg für 5 min bei 4 ° C, Überstand verwerfen, Pellet in 40 ml kaltem FACS-Puffer, Pellet die Zellen durch Zentrifugation bei 500 xg für 5 min bei 4 ° C und Überstand verwerfen.
- Zellpellet in 20 ml isotonischer Percoll bei Raumtemperatur. Centrifuge Zellsuspension bei 700 xg für 12 min bei Raumtemperatur. Überstand verwerfen und scheibenförmigen Blatt schwimmende Zellen auf der Oberseite (dh Hepatozyten). Resuspendieren Leukozyten-Pellet in 4 ml TAC-Puffer an Erythrozyten und Inkubation Zellen bei Raumtemperatur lysiert für bis zu 10 min mit häufigen Inversion.
- Filter Zellsuspension durch ein 100 um Nylonmembran in eine neue 10 ml Zentrifugenröhrchen.
- Underlay gefiltert Zellsuspension mit 1 ml FCS / EDTA-Puffer. Zentrifuge bei 350 xg für5 min bei 4 ° C, Überstand verwerfen und Resuspension in 5 ml FACS / EDTA-Puffer.
- Centrifuge Zellsuspension bei 350 xg für 5 min bei 4 ° C, Überstand verwerfen und Zellpellet resuspendieren in 0,5-3 ml FACS / EDTA-Puffer, je nach Größe des Pellets.
- Verdünnen Zellsuspension von 1.05 bis 01.20 Uhr in Trypanblau je nach Suspensionsvolumen in Schritt 5.8. Graf lebensfähig hepatische Leukozyten mit Hämazytometer (Abbildung 4A) und Bestimmung der gesamten lebensfähigen Zellen wie folgt: lebensfähigen Zellen / Organ = Anzahl der Zellen in die Zählung Bereich x Verdünnungsfaktor x 10 4 x Volumen (ml). Leber-Single-Cell-Suspensionen können dann mit spezifischen Antikörpern für die gewünschten Zell-Oberflächen-Markern versehen werden und mittels FACS.
Tipps & Hinweise:
- Keep Zellen auf Eis, sofern nicht anders angegeben.
6. Vorbereitung der Milz Einzel-Zell-Suspension für die FACS-Analyse
- Generieren Sie Single-Zellsuspensionen, indem die eine Hälfte der Milz (Schritt 4,7) mit FACS-Puffer in einem 70 um Zellsieb, die innerhalb einer 60 mm Petrischale wird. Schieben Sie das Gewebe durch die Zelle Sieb mit dem Kolben einer 5 ml Spritze, bis ein Single-Cell-Suspension entsteht.
- Übertragen Sie die Milz Einzel-Zellsuspension aus der Petrischale in ein 10 ml Zentrifugenröhrchen und bringen das Gesamtvolumen auf 10 ml mit kaltem FACS-Puffer.
- Pellet-Zellen durch Zentrifugation bei 350 xg für 5 min bei 4 ° C, Überstand verwerfen, Zellpellet resuspendieren in 4 ml TAC-Puffer an Erythrozyten, und inkubieren Zellen bei Raumtemperatur lysiert für bis zu 10 min mit häufigen Inversion.
- Filter Zellsuspension durch ein 100 um Nylonmembran in eine neue 10 ml Zentrifugenröhrchen.
- Underlay gefiltert Zellsuspension mit 1 ml FCS / EDTA-Puffer. Zentrifuge bei 350 xg für 5 min bei 4 ° C, Überstand verwerfen und Zellpellet resuspendieren in 5 ml FACS / EDTA-Puffer.
- Centrifuge Zellsuspension bei 350 xg für 5 min bei 4 ° C, Überstand verwerfen und Zellpellet resuspendieren in 3-8 ml FACS / EDTA-Puffer, je nach Größe des Pellets.
- Verdünnen Zellsuspension 1.10 bis 01.20 Uhr in Trypanblau (0,4% in destilliertem Wasser), je nach Suspensionsvolumen in Schritt 7.6. Graf lebensfähig Splenozyten mit Hämazytometer - siehe Schritt 5.9 für die Berechnung insgesamt lebensfähige Zellen pro Organ Milz Einzel-Zellsuspensionen können dann mit spezifischen Antikörpern für die gewünschten Zell-Oberflächen-Markern versehen werden und mittels FACS.
Tipps & Hinweise:
- Keep Zellen auf Eis, sofern nicht anders angegeben.
7. Messung der bakteriellen Belastung in Geweben von Listeria-infizierten Mäusen
- Falten Sie die Spitze des Stomacherbeutel mit der Milz die Hälfte. Halten Sie die Stomacherbeutel geschlossen, um ein Auslaufen zu verhindern, legen Sie ihn flach auf eine saubere Bank oder in einer laminaren Strömung Schrank. Wirf einen dicken runden Stift über das Gewebe, bis das Gewebe innerhalb des Beutels püriert ist.
- 5 ml PBS in jedes Stomacher Beutel mit zerdrückten Gewebes. Legen Sie die Stomacherbeutel in den Stomacher, und führen Sie den Stomacher bei hoher Geschwindigkeit für 10 Minuten.
- Mix das Homogenat in der Stomacherbeutel (oder 1 ml Aliquot der Leber Zellsuspension) mit einer Pipette. Führen Sie die folgenden in Duplikaten. Transfer-300 ul einer 96-well ebenen Bodenplatte. Im Brunnen der 96-Well-Platte durchführen 01.10 serielle Verdünnungen (30 ul in 270 ul PBS) zu einer 10 -5 Verdünnung für jeden Gewebehomogenat Probe.
- Sorgfältig verteilt 0,1 ml von jeder Verdünnung auf eine vorgetrocknet HBA Platte mit einem Glas Streuer. Die Platten bei 37 ° C über Nacht.
- Zählt die Anzahl der CFU für jede Verdünnung und berechnen Sie die KBE pro Gewebe unter Berücksichtigung der Teil des Gewebes (zB eine halbe Milz), Verdünnungsfaktor, und das Gesamtvolumen der Gewebehomogenat (5 ml oder 40 ml): CFU / Gewebe = CFU/0.1 mL x Verdünnungsfaktor x mL / Gewebe; für Milz teilen diese Zahl durch die prozentuale Gewicht der Milz Probe für die Gewebe-Homogenisierung verwendet werden (siehe Schritt 4.7).
Tipps und Hinweise:
- Mehr als ein Stomacherbeutel können in den Stomacher in einer Zeit, solange Gesamtvolumen platziert werden nicht mehr als maximale Lautstärke, wie vom Hersteller angegeben
- Wenn ein Stomacher nicht verfügbar ist, kann ein Gewebe-Homogenisator verwendet werden. Alternativ kann die folgende Methode, wenn auch nicht so effizient, auch manuell Mazerat die Orgel anstelle der Schritte 7.1 und 7.2 werden: Ort Orgel in einem verschlossenen sterilisiert Plastiktüte und legte sich auf eine saubere Bank, während der Beutel verschlossen, um ein Auslaufen zu verhindern . Wirf einen 500 mL Laborglasflasche wiederholt über den Beutel, bis das Gewebe gründlich püriert ist. 5 ml PBS, um jede Tasche und gehen bis 7,3 Schritt.
- Es ist sehr wichtig in Schritt 7,4, die HBA Platten gründlich getrocknet werden(Dh keine Feuchtigkeit auf dem Agar). Sonst kann es schwierig sein, verschiedene Listerienkolonien, dass richtig gezählt werden können, zu erhalten.
- Wenn es begrenzt HBA Platten sind, ist eine Alternative für Schritt 7.4: Zeichnen von Linien auf dem Boden eines vorgetrocknet HBA-Platte (Schritt 1,1), um sie in fünf Minuten vor sechs Sektionen, eine für jede Verdünnung zu teilen. Sorgfältig Pipette 25 ul jeder Verdünnung in entsprechende Abschnitte auf der HBA Platte für jeden Gewebehomogenat - nicht mit einem Streuer zu verbreiten. Warten Sie, bis Tropfen Gewebehomogenat vor Umdrehen der Platte sind trocken. Inkubieren Platte bei 37 ° C über Nacht. Bis zu 80 Kolonien können durch einen Tropfen auf eine Agarplatte unterschieden werden.
- Eine Verwässerung des Gewebehomogenaten kann auf der Listeria Wachstum in das Tier ab und können auf der Grundlage der Symptome, die durch das Tier zum Zeitpunkt der Euthanasie angezeigt geschätzt werden. Bei Mäusen, die deutlich moribund, sind zusätzliche Verdünnungen kann notwendig sein, genauer zu bestimmen, die bakterielle Belastung. Bei Mäusen mit niedrigen Dosen von Listeria oder Mäuse am Ende der Infektion Zeitraum euthanasiert geimpft, kann unverdünnt Gewebehomogenat verwendet werden, um die bakterielle Belastung zu ermitteln.
- Die Platten können bei 37 ° C über Nacht oder bei Raumtemperatur für 2-3 Tage.
8. Repräsentative Ergebnisse:
Für einen Standard-Infektion Experiment wurde Listeria erhalten aus einem gefrorenen Glycerin Lager und streifig auf einem HBA Platte wie in Abbildung 1 dargestellt. Wenn einige Kolonien nach Schlieren erhalten, kann dies auf schlechte Schlieren oder ein suboptimales eingefroren Lager. Ein Listeria infektiöse Lager war von einer frisch ausgestrichenen HBA Platte hergestellt und gelagert bei -70 ° C. Für die Messung bakterielle Clearance und Immunreaktionen, die wir routinemäßig verdünnen aufgetaut Listeria infektiöse Lager auf 2.500 CFU / ml - 15.000 KBE / mL und injizieren Mäuse mit 200 ul, um sie mit 500 zu infizieren - 3.000 CFU. Wir beobachten, dass Mäuse mit subletalen Dosen von Listeria dieses Protokoll verwenden infiziert vorübergehend weisen zerzauste Fell, gekrümmte Haltung und Gewichtsverlust innerhalb der ersten paar Tage. Diese Symptome geben einen visuellen Hinweis, wie stark ein Individuum mit der Maus durch die Infektion betroffen ist, ob es anders reagiert auf den Rest der Gruppe (dh eine "offensichtliche" Ausreißer), und ob Sterbehilfe ist notwendig, um übermäßige Leiden und bevorstehendem Tod verhindern aufgrund der Infektion.
In den Ergebnissen von Abbildungen 2-5 dargestellt, wurden die Mäuse infiziert mit einem frisch aufgetauten Aliquot Listeria infektiöse Lager. Zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Infektion wurden die Mäuse euthanasiert und Leber und Milz wurden entfernt. Abbildung 2 zeigt einen HBA Platte, auf welcher verdünnt Milz Homogenat aus einer einzigen Maus wurde kultiviert. Es sollte eine deutliche Reduktion in der Anzahl der Kolonien werden als Verdünnungsfaktor wird höher, so dass das Zählen deutliche CFU wird für mindestens zwei Verdünnungen möglich. Wenn die Maus den Listeria-Infektion (dh Nachweisgrenze = 100 KBE / Gewebe) gelöscht wurde, dann <5 Listerienkolonien werden auf dem HBA Platte, die mit 200 ul unverdünnter Gewebehomogenat verbreitet wurde. Wenn die Leber und / oder Milz mit Darm-oder anderen externen Bakterien während der Isolierung kontaminiert werden, werden die Kolonien auf dem HBA Platte wahrscheinlich unterschiedliche Morphologie (dh nicht haben charakteristische Heiligenschein und blasse Farbe Listerienkolonien) und / oder sein Exponat verschiedenen in Koloniezahlen, was für erwartete Listeria (dh zu wenige oder zu viele). Abbildung 3 zeigt eine typische Listeria-Clearance-Kurve für C57BL / 6 Mäuse - beachten Sie, dass Listeria typischerweise schneller von der Milz als die Leber abgebaut und damit die Clearance nicht erst fünf Tage nach der Infektion geschehen.
Abbildung 4 zeigt Zellzahlen auf Einzel-Zellsuspensionen von Milz und Leber von infizierten Mäusen zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Infektion vorbereitet wird. Diese Methode kann> 95% Reinheit Leukozyten in Einzel-Zellsuspensionen aus Leber und> 80% aus Milz vorbereitet zu erreichen. Leukozyten Reinheit kann durch FACS-Analyse unter Verwendung eines monoklonalen Antikörper, der spezifisch für die pan-Leukozyten-Marker CD45 (Klon 30-F11) bestimmt werden. Normalerweise wird die Anzahl von Splenozyten und hepatische Leukozyten während der Zeit es braucht, um die Infektion mit der Leber mit stärker fachen Anstieg der hepatischen Leukozyten deutliche Steigerung, aber eine wesentlich geringere Summe, verglichen mit der Zunahme von Splenozyten in der Milz. Die Art und Anzahl der Immunzellen kann durch Kennzeichnung der Einzel-Zellsuspensionen mit Antikörpern, die spezifisch für Zell-Oberflächen-Marker bestimmt werden. Markierten Zellen können dann durch FACS-Analyse nachgewiesen werden. Abbildung 5 zeigt repräsentative Ergebnisse für CD8 + T-Zellen. Während ein Standard-Listeria-Infektion in C57BL / 6 Mäusen, die Zahl der CD8 + T-Zellen transient sinkt aufgrund Lymphopenie in der Milz an den Tagen 2-3 vore Erhöhung spürbar von Tag 5 nach der Infektion sowohl in der Milz und Leber.
Abbildung 1. HBA-Platte ausgestrichen mit Listeria. Eine sterile Impföse wurde streak Listeria aus einem gefrorenen Glycerin Lager verwendet. Die Platte wurde bei 37 ° C über Nacht inkubiert. Die charakteristischen Nimbus einzelnen Kolonien ist auf β-Hämolyse.
Abbildung 2. Tissue aus einer Listeria-infizierten Maus auf HBA-Platten kultiviert Homogenat. Eine Leber war von einer Listeria-infizierten C57BL / 6 Maus 3 Tage nach der Infektion geerntet. Gewebehomogenat wurde vorbereitet und Verdünnungen als 100 ul volle Platte für 10 -4 Verdünnung (A) und 10 -5 Verdünnung (B) zu verbreiten, sowie 25 ul Tropfen auf einem HBA Platte gelegt für jeden 1:10 Verdünnung von unverdünnt bis 10 -5 (C). Die Platten wurden bei 37 ° C über Nacht inkubiert. Die Verdünnungen, die aus einzelnen Kolonien gezählt ermöglichen werden verwendet, um die bakterielle Belastung (dh CFU / Gewebe) zu diesem Zeitpunkt nach der Infektion zu bestimmen.
Abbildung 3. Listeria Belastung in Milz und Leber von infizierten C57BL / 6 Mäusen nach 3 und 7 Tage nach der Infektion. C57BL / 6 Mäuse wurden mit ~ 2.000 CFU von Listeria infiziert. Zu jedem Zeitpunkt wurden die Mäuse euthanasiert, die Leber perfundiert wurde geerntet und mit der Milz und Verdünnungen der Milz-Homogenat (A) oder Leber-Single-Zell-Suspension (B) wurden auf HBA-Platten kultiviert, um die bakterielle Belastung zu ermitteln. Die durchgezogenen Linien zeigen geometrisches Mittel und vertikalen Balken zeigen SEM. Die gestrichelte Linie zeigt an, dass die Nachweisgrenze für eine genaue Messung der bakteriellen Belastung von 100 KBE / Orgel für dieses Experiment ist.
Abbildung 4. Anzahl der lebensfähigen Zellen für Gewebe infizierter Mäuse. C57BL / 6 Mäuse wurden mit ~ 2.000 CFU von Listeria infiziert. Zu jedem Zeitpunkt wurden die Mäuse euthanasiert, die Leber perfundiert und geerntet mit der Milz. Die Zellen wurden mit Trypanblau gefärbt und gezählt unter Verwendung eines Hämozytometers wie in Schritt 5,9 (A) beschrieben. Splenozyten (B) und hepatische Leukozyten (C) zählt von Einzel-Zellsuspensionen von Listeria-infizierten Mäusen hergestellt wurden. Linien zeigen geometrische Mittel.
Abbildung 5. FACS-Analyse von CD8 + T-Zellen in Listeria-infizierten Mäusen. C57BL / 6 Mäuse wurden mit ~ 2.000 CFU von Listeria infiziert. Zu jedem Zeitpunkt wurden die Mäuse euthanasiert, die Leber perfundiert und geerntet mit der Milz. Einzel-Zell-Suspensionen wurden mit Antikörpern, die spezifisch für T-Zellen (CD3, TCRβ, CD4, CD8) gefärbt. (A) Repräsentative FACS-Profile mit% CD8 + T-Zellen + / - SEM. (B) Total CD8 + T-Zellen in der Milz. (C) Total CD8 + T-Zellen in der Leber.
Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Die Autoren bedanken sich bei Anna Walduck, Christina Cheers, Stuart Berzins, Dale Godfrey, Yifan Zhan und Jonathan Wilksch für Beratung und Reagenzien zu danken. Diese Arbeit wurde von der Juvenile Diabetes Research Foundation (1-2008-602) und die Australian National Health and Medical Research Council (575552) gefördert. NW wird von einem Australian Postgraduate Award unterstützt. OW wird von einer RD Wright Fellowship von der Australian National Health Medical Research Council unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Horse blood agar base No.2 | Oxford Labware | CM0271 | Preparation of agar base for HBA plates |
| Horse blood (defibrinated) | Oxford Labware | HB1000 | Add 5-10% to agar base |
| Brain heart infusion (BHI) broth (10 mL) | Oxford Labware | TM456 | |
| Brain heart infusion dehydrated media | Oxford Labware | CM1135 | |
| 96-well flat bottom plate | BD Biosciences | 353072 | |
| 70 μm cell strainer | BD Biosciences | 352350 | |
| Small petri dish | BD Biosciences | 351007 | |
| Stomacher 80 biomaster lab system | Seward | ||
| Plastic Stomacher bags | Sarstedt Ltd | 86 9924 530 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A3912 | |
| FACS buffer | 0.1% (w/v) bovine serum albumin in PBS | ||
| Isotonic Percoll (33.75% Percoll in PBS) | GE Healthcare | 17-0891-01 | 33.75mL Percoll, 3.75mL 10x PBS, 62.5mL 1x PBS makes 100mL isotonic Percoll |
| TAC Buffer | 17mM Tris, 140mM ammonium chloride in distilled water | ||
| FCS/EDTA buffer | Fetal calf serum with 10mM EDTA | ||
| FACS/EDTA buffer | FACS buffer + 5mM EDTA | ||
| Trypan blue | Sigma-Aldrich | T6146 | 0.4% (w/v) in PBS, filter sterilized |
| 2mL Cryovial | Greiner Bio-One | 121263 | |
| 27 gauge/1mL insulin syringe | Terumo Medical Corp. | SS10M2713 | |
| Needle | Terumo Medical Corp. | NN-2516R (25G 5/8in) NN-2613R (26G 1/2in) | |
| Syringe | Terumo Medical Corp. | SS-01T (1mL), SS-053 (5mL), SS-10S (10mL) |
References
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