Summary
Listeria monocytogenes är en modell organism för att studera immunsvaret och genetisk känslighet för intracellulära bakterier i möss. Denna metod gör en att mäta bakteriehalten och generera encelliga suspensioner av levern och mjälten från möss för FACS-analys för att fastställa förändringar i immunceller grund av Listeria infektion.
Abstract
Listeria monocytogenes (Listeria) är en Gram-positiv fakultativt intracellulär patogen 1. Mus studier vanligtvis använder intravenös injektion av Listeria, vilket resulterar i systemisk infektion 2. Efter injektionen sprider Listeria snabbt till mjälten och levern på grund av upptag av CD8α + dendritiska celler och Kupfferceller 3,4. När fagocyteras, olika bakteriella proteiner att Listeria att undkomma phagosome, överleva i cytosolen, och infektera angränsande celler 5. Under de tre första dagarna av infektion, olika medfödda immunförsvaret celler (t ex monocyter, neutrofiler, NK-celler, dendritiska celler) medla bakteriedödande mekanismer som minimerar Listeria spridning. CD8 + T celler senare rekryteras och ansvarig för den slutliga godkännande av Listeria från värden, vanligtvis inom 10 dagar efter infektion 6.
Framgångsrik clearance av Listeria från infekterade möss beror på lämpliga uppkomsten av värd immunsvar 6. Det finns ett brett spektrum av känslighet hos inavlade musstammar 7,8. Generellt möss med ökad mottaglighet för Listeria infektion är mindre möjlighet att kontrollera bakteriell spridning, visar ökad bakteriell belastning och / eller fördröjd clearance jämfört med resistenta möss. Genetiska studier, inklusive koppling analyser och knockout stammar mus, har identifierat olika gener som sekvensen variation påverkar värd svar på Listeria infektion 6,8-14. Fastställande och jämförelse av infektion kinetik mellan olika musstammar är därför en viktig metod för att identifiera värd genetiska faktorer som bidrar till att immunsvaret mot Listeria. Jämförelse av värden svar på olika Listeria stammar är också ett effektivt sätt att identifiera bakteriella virulensfaktorer som kan fungera som potentiella mål för behandling med antibiotika eller vaccin design.
Vi beskriver här en enkel metod för att mäta bakteriehalten (kolonibildande enheter [CFU] per vävnad) och förbereda encelliga suspensioner av levern och mjälten för FACS analys av immunsvar hos Listeria-infekterade möss. Den här metoden är särskilt användbart för första karakterisering av Listeria infektion i stammar roman mus, samt jämförande av immunsvaret mellan olika musstammar infekterade med Listeria. Vi använder Listeria monocytogenes EGD stam 15 som när den odlade på blodagar, uppvisar en karakteristisk gloria zon runt varje koloni på grund av β-hemolys 1 (Figur 1). Bakteriehalten och immunsvar kan fastställas när som helst-punkt efter infektion genom odling av vävnad homogenatet på tallrikar blodagar och förbereda vävnad suspensioner cell för FACS-analys med de protokoll som beskrivs nedan. Vi vill påpeka att personer som har nedsatt immunförsvar och gravida ska inte hantera Listeria, och de relevanta institutionella biosäkerhet kommittén och djur fastighetsförvaltning bör konsulteras innan arbetet påbörjas.
Protocol
1. Odling och långtidslagring av Listeria monocytogenes (Listeria)
- Gör eller köp färdiga häst blodagar (HBA) plattor. Torra plattor före användning av på förhand inkubera vid 37 ° C över natten eller att placera upptäckts i ett laminärt flöde skåp i 1 timme.
- Skaffa livskraftiga Listeria från en av följande: en infekterad mus vävnad homogenatet, en frystorkad lager, en frusen glycerol lager, eller en koloni från en nyligen Listeria kultur (dvs mindre än en vecka gammal och inte sub-odlade mer än 10 generationer) . Alla Listeria bör erhållas med hjälp av en steril inokulering loop och använda aseptisk teknik för alla metoder som beskrivs i detta protokoll.
- Streak Listeria på en HBA platta som visas i figur 1 med en steril inokulering loop: strimmig Listeria över ¼ av plattan som den primära inokulat spridning. Gör en serie enkelriktad ränder från den primära spridningen. Upprepa strimmor 2-3 gånger med en färsk eller omsteriliseras slingan före varje uppsättning streck. Inkubera plattorna vid 37 ° C över natten.
- Förvara Listeria HBA plattan vid 4 ° C i högst 1 månad eller gå till steg 1,5 för att förbereda listeria kultur för långsiktig lagring.
- Välj en enda koloni från en färsk Listeria kultur på ett HBA tallrik med en steriliserad inokulering slinga och inokulera 10 ml hjärnan hjärtat infusion (BHI) buljong (förbereder enligt tillverkarens anvisningar) i en 30 ml McCartney flaska.
- Inkubera Listeria kultur i en roterande skak vid 180rpm vid 37 ° C över natten.
- Tillsätt steril 80% glycerol (v / v) till vätska Listeria kulturen på förhållandet 1:1 för att få en slutlig glycerol koncentration av 40% (v / v). Överför 0,5-1 ml-portioner i cryovials och lagra Listeria / glycerol lager vid -70 ° C.
Tips och konstaterar:
- Tillväxten av Listeria kan stödjas på olika icke-selektiva media, såsom en rad blodagar (kompletteras med häst, får, marsvin eller blod), hjärnan hjärtat infusion (BHI) agar eller buljong, eller Tryptic soja buljong med jäst extrakt (TSB-YE). Förorena tillväxt kan minimeras i kulturen genom att lägga till antibiotika till medierna för Listeria stammar med definierade antibiotikaresistens (t.ex. L. monocytogenes 10403S), eller genom att använda Oxford media, som selektivt stödja tillväxten av Listeria.
- Om Listeria har erhållits från en oprövad källa, rekommenderas att ytterligare undersökningar utförs för att bekräfta identiteten av Listeria (L. monocytogenes är grampositiva, icke sporbildande, rörliga vid <30 ° C, fakultativt anaeroba, katalas positiv och oxidasnegativ). De erhållna kulturen kan också odlas på Listeria selektiva medier för att säkerställa att en renkultur erhålls.
- Torkning HBA plattorna ser till att det är optimal separation av kolonier på plattan.
- Vid frysta glycerol lager av Listeria, använd färska HBA Listeria kulturer som är mindre än 1 vecka gamla och sub-odlade för så få generationer som möjligt (<5 är bäst).
- När härrör färska Listeria kulturer från en frusen glycerol lager, bör det första passagen göras på fast medium (dvs. HBA plattor) eftersom listeria från frysta glycerol lager växa svagt då direkt subkultiveras i flytande medium.
2. Beredning och lagring av listeria smittsamma lager för in vivo-infektion studier
- Streak Listeria från en frusen glycerol lager (Steg 1,7) på en HBA skylt som beskrivs i steg 1,3. Inkubera plattorna vid 37 ° C över natten för användning på nästa dag.
- Välj en enda Listeria koloni från en strimma kultur och inokulera en 10 ml BHI buljong. Undvika att överföra agar i buljongen.
- Inkubera Listeria BHI kultur i en roterande skak vid 180 rpm och 37 ° C till mitten av logaritmiska fas (OD600 = ~ 0,4). Detta tar normalt 3-4 timmar.
- Ta en 0,9 mL alikvot aseptiskt och få en OD avläsning vid 600 nm vid 3-4 timmars skakning. Om OD läsning är <0,3 och fortsätt sedan att kultur i en roterande skak vid 180 rpm och 37 ° C tills OD läsning är ~ 0,4.
- Tillsätt 1 mL steril 80% glycerol (v / v) till 10 ml Listeria BHI buljong kultur (OD600 ~ 0,4). Blanda försiktigt och överför till 1,5 ml mikrofugrör rör i 0,5-1 ml alikvoter.
- Placera delprover på is i 10 min och förvara vid -70 ° C. Lämna en alikvot ofrusen att bestämma koncentrationen av listeria i den smittsamma lager, vilket är typiskt i storleksordningen 10 9 CFU / mL.
- Utför 1:10 seriella spädningar av unfroZen Listeria smittsamma lager i PBS till 10 -8 utspädning. Sprid 100 mikroliter av outspädda och varje efterföljande utspädning till förtorkas HBA plattor (steg 1,1) användes i duplikat för ett glas spridare. Inkubera plattorna vid 37 ° C över natten.
- Räkna antalet kolonier på varje platta och bestämmer Listeria koncentrationen av frysta smittsamma lagerhållna odlingen med hjälp av följande beräkning: koncentration (CFU / mL) = antal kolonier x spädningsfaktorn / 0,1 ml. Plattorna som väljs för att räkna bör helst ha 3-30 kolonier för att säkerställa en tillförlitlig uppskattning av CFU koncentration av livskraftiga bakterier.
- Några dagar efter lagring Listeria smittsamma lager vid -70 ° C, tina upp en tub. Bestäm koncentrationen av livskraftiga listeria som beskrivs i steg 2,7 och 2,8. Denna koncentration bör vara liknande den som fastställs för den nytillagade smittsamma lager i steg 2,8.
Tips och konstaterar:
- Listeria smittsamma lager är frysas vid en lägre andel glycerol (8%) än för listeria frysta för allmän långtidsförvaring (40%).
- Frysta Listeria smittsamma lagren är normalt stabilt vid -70 ° C i upp till 3 månader. Om du använder mer än 3 månader, rekommenderas att en ny smittsam lager beredas av en ny Listeria kultur på ett HBA tallrik.
- Om koncentrationen av tinat Listeria smittsamma lager (steg 2,9) skiljer sig från den nylagade beståndet som beskrivs i steg 2,7 och 2,8 (dvs> 20% minskning av CFU), sedan en ny fryst smittsamma lager bör utarbetas.
- Även initialt mer tidskrävande än att förbereda en ny bakterie inokulum för ett enda experiment, förbereda frysta Listeria smittsamma lager möjliggör noggrann bestämning av CFU koncentration före infektionen och bättre överensstämmelse mellan experiment när möss är smittad från samma frysta lager.
3. Beredning av Listeria inokulat och intravenös injektion av möss
- Bestäm koncentrationen av Listeria som injiceras per mus. För intravenös injektion CFU i 200 mikroliter inokulat per musen används.
- Tina upp en frusen alikvot av Listeria smittsamma lager (från steg 2,6). Späd smittsamma beståndet i PBS till önskad Listeria CFU koncentration. Dubbla volymen som behövs för att injicera all möss för att säkerställa att det finns tillräckligt med inokulatet för injektion och bestämning av Listeria CFU före och efter injektion (steg 3,3 och 3,7).
- Ta bort 2x 0,1 mL alikvoter från den färdiga Listeria inokulatet, och förbereda en 1:10 spädning i PBS för varje delprov innan injektion av möss. Plate 0,1 mL varje utspädning på HBA tallrikar, och inkubera plattorna vid 37 ° C. Räkna antalet kolonier och bestämma före injektionen koncentrationen av Listeria inokulat: koncentration (CFU / mL) = (antal kolonier x spädningsfaktorn) / ml klädd för det utspädningsfaktorn.
- Överför musen för att injiceras i en ren bur. Varm musen genom att placera buren ~ 50 cm under en 250 W infraröd lampa för 5 min (annan lämplig termisk enheter som inte brinner med musen eller öka temperaturen i buren över 40 ° C kan också användas). Placera musen i en återhållande enhet för injektionsvätskor svansvenen.
- Blanda försiktigt den Listeria fjädring att upprätthålla en konsekvent avstängning varje gång en spruta är laddad.
- Leta i sidled svansvenen av musen, torka försiktigt med en 70% etanol torka och injicera 200 mikroliter av Listeria inokulat (vid önskad koncentration) med hjälp av en spruta med en 27 gauge nål. Kortfattat gäller tryck in såret med en steril gasbinda. Återgå musen till sin bur.
- När injektion av alla möss är klar, upprepa steg 3,3 hjälp av återstående mängd inokulat att bestämma efter injektion koncentrationen av Listeria inokulat.
- Mängden av Listeria injiceras i möss redovisas som den genomsnittliga CFU bestäms utifrån före och efter injektion Listeria inokulat prover.
Tips och konstaterar:
- Vi injicera typiskt 500 - 3000 CFU (200 mikroliter av 2500 CFU / mL - 15.000 CFU / mL inokulatet) när man jämför bakteriehalten och immunsvar mellan en resistent musstam (t.ex. C57BL / 6) och en mottaglig musstam (t.ex. BALB / c ).
- Om det smittförande beståndet kommer att spädas i PBS med minst 10 5, då en tvätt som inte krävs i allmänhet att avlägsna rester av media / glycerol. Om det smittförande beståndet inte kommer att spädas i PBS med minst 10 5, då en tvätt bör läggas i steg 3,2 för att avlägsna rester media / glycerol enligt följande: Add 9 ml PBS för att tinas smittsamma lager och bakterier som samlas in genom centrifugering vid 2100 xgi 10 minuter vid 4 ° C. Avlägsna supernatanten och suspendera pelleterat bakteriecellerna i 10 ml sterila PBS, upprepa centrifugering och resuspendera bakteriell cellpelleten i önskad volym. Bestäm den genomsnittliga CFU från före och efter injektion Listeria inokulat prov som beskrivs i steg 3,3 och 3,7. Det noteras att denna tvätt kan resultera i en viss förlust av bakterier, och det rekommenderas att en sådan förlust i förväg fastställas och redovisas för att göra inokulat som krävs koncentration.
- Säker kassera sprutan och nålen efter injektion mus med Listeria.
4. Borttagning av lever och mjälte från Listeria-infekterade möss för analys
- Euthanase den infekterade musen på önskad tidpunkt efter infektion med en metod som godkänts av den lokala Animal etikkommittén, t.ex. CO 2 kvävning.
- Utför hjärt blöder direkt efter dödshjälp använda en 1 ml spruta och 25 gauge nål. Samla så mycket blod som möjligt. Ta bort gallblåsan och skilja de underlägsna hålvenen.
- Exponera venen nedsatt portalen genom att försiktigt trycka tarmarna till höger, vänd levern loberna mot huvudet och till vänster så att levern sitter där membranet finns. Den lever portvenen matas in i botten av levern från nedre högra sida.
- BEGJUTA levern genom att injicera 10 ml PBS i levern portalen ven med en 26 gauge nål. PBS injiceras genom portalen ven kommer ut ur avhuggna sämre hålvenen. Lever perfusion ser till att skördas celler från levern och inte det cirkulerande blodet.
- Ta bort perfusion levern från musens kroppshålighet plats i FACS buffert, och förvara på is. Gå till steg 5,1 för beredningen av levern för FACS analys.
- Ta bort mjälten från mus, plats i FACS buffert, och förvara på is.
- Väg hela mjälten, halverades, och väger en av halvorna. Placera en halv i FACS buffert och gå till steg 6,1. Placera den andra hälften i en Stomacherpåse på is och gå till steg 7,1.
Tips och konstaterar:
- I steg 4,5 och 4,6, användas tillräckligt FACS buffert för att helt dränka den vävnad för att minimera exponeringen av någon del av vävnaden till luft.
- En ½ tum lång 26 gauge nål som är böjd med ~ 30 grader kan bättre underlätta injektion av PBS i levern portalen ven.
- När perfusion ordentligt, vänder levern från en mörk röd färg till ljusbrun efter injektion 1-2 ml PBS.
- Om levern inte krävs för FACS-analys, perfusion inte nödvändigt. Levern kan isoleras och samlas direkt i en Stomacherpåse och bearbetas enligt beskrivningen i steg 7.
- För dödshjälp av möss, är CO 2 kvävning att föredra eftersom det har minimal påverkan på bakteriella CFU och immunceller livskraft i mjälten och levern. Om blodinsamling inte krävs, kan halsdislokation användas som alternativ dödshjälp metod. Det rekommenderas att dödshjälp metoder som kan påverka organ vikt eller immunceller livskraft inte användas (t.ex. thiobarbiturates).
5. Beredning av nedsatt cellsuspension för FACS analys
- Generera encelliga suspensioner genom att placera levern med FACS buffert (steg 4.5) i en 70 ìm cell sil som är inne i en 60 mm petriskål. Tryck vävnaden genom cellen sil med hjälp av kolven av en 5 ml spruta tills en encelliga suspension bildas.
- Överför levern encelliga avstängning från petriskålen till en 50 ml konisk skruvkork rör och att den totala mängden till 40 ml med kall FACS buffert.
- Vortex cellsuspension och ta en 1 mL alikvot att bestämma bakteriehalten för levern. Gå till steg 7,3 och använda denna 1 mL alikvot i stället för vävnad homogenatet i Stomacherpåse.
- Pellets cellerna genom centrifugering vid 500 xgi 5 minuter vid 4 ° C, kassera supernatanten, återsuspendera pelleten i 40 ml kallt FACS buffert, pellets cellerna genom centrifugering vid 500 xgi 5min vid 4 ° C, och kassera supernatanten.
- Resuspendera cellpelleten i 20 ml isoton Percoll vid rumstemperatur. Centrifugera cellsuspension vid 700 xg under 12 minuter vid rumstemperatur. Kassera supernatanten och skiva-liknande blad av celler som flyter ovanpå (dvs hepatocyter). Resuspendera leukocyt som innehåller pelleten i 4 ml TAC buffert Lyse erytrocyter och inkubera celler i rumstemperatur i upp till 10 minuter med täta inversion.
- Filtrera cellsuspension genom en 100 ìm nylon membran i en ny 10 ml centrifugrör.
- Underlag filtreras cellsuspension med 1 ml FCS / EDTA-buffert. Centrifugera vid 350 xgi5 min vid 4 ° C, kassera supernatanten och återsuspendera i 5 ml FACS / EDTA-buffert.
- Centrifugera cellsuspension vid 350 xg under 5 minuter vid 4 ° C, kassera supernatanten och resuspendera cellpelleten i 0,5-3 ml FACS / EDTA-buffert beroende på storleken av pelleten.
- Späd 1:05 till 01:20 cellsuspensionen i trypan blått beroende på fjädring volym i steg 5,8. Räkna livskraftiga nedsatt leukocyter med hjälp hemacytometer (Figur 4A) och bestämning av de totala livskraftiga celler som följer: livskraftiga celler / organ = antal celler i räkningen området x spädningsfaktorn x 10 4 x Volym (ml). Lever encelliga suspensioner kan sedan märkas med antikroppar specifika för önskad cellytan markörer och analyseras av FACS.
Tips och konstaterar:
- Håll celler på is om inget annat anges.
6. Beredning av mjälten encelliga suspension för FACS analys
- Generera encelliga suspensioner genom att placera en halv av mjälte (steg 4,7) med FACS buffert i ett 70 ìm cell sil som är inne i en 60 mm petriskål. Tryck försiktigt vävnaden genom cellen sil med hjälp av kolven av en 5 ml spruta tills en encelliga suspension bildas.
- Överför mjälten encelliga avstängning från petriskålen till en 10 ml centrifugrör och att den totala mängden till 10 ml med kallt FACS buffert.
- Pellets cellerna genom centrifugering vid 350 xgi 5 minuter vid 4 ° C, kassera supernatanten, återsuspendera cellpelleten i 4 ml TAC buffert Lyse erytrocyter och inkubera celler i rumstemperatur i upp till 10 minuter med täta inversion.
- Filtrera cellsuspension genom en 100 ìm nylon membran i en ny 10 ml centrifugrör.
- Underlag filtreras cellsuspension med 1 ml FCS / EDTA-buffert. Centrifugera vid 350 xgi 5 minuter vid 4 ° C, kassera supernatanten och resuspendera cellpelleten i 5 ml FACS / EDTA-buffert.
- Centrifugera cellsuspension vid 350 xg under 5 minuter vid 4 ° C, kassera supernatanten och resuspendera cellpelleten i 3-8 ml FACS / EDTA-buffert beroende på storleken av pelleten.
- Späd 1:10 cellsuspensionen - 1:20 i trypan blått (0,4% i destillerat vatten) beroende på fjädring volym i steg 7,6. Räkna livskraftiga splenocytes med hemacytometer - se steg 5,9 för att beräkna totala lönsamma celler per encelliga organ Spleen suspensioner kan sedan märkas med antikroppar specifika för önskad cellytan markörer och analyseras av FACS.
Tips och konstaterar:
- Håll celler på is om inget annat anges.
7. Mätning av bakteriehalten i vävnader från Listeria-infekterade möss
- Vik toppen av Stomacherpåse innehåller mjälten halv. Håll Stomacherpåse stängas för att förhindra läckage, lägga den platt på en ren bänk eller i ett laminärt flöde skåp. Rulla en tjock runt pennan över vävnaden tills vävnaden är mosade i väskan.
- Tillsätt 5 ml PBS till varje Stomacherpåse innehåller mosade vävnad. Placera Stomacherpåse i Stomacher, och kör Stomacher på hög hastighet i 10 minuter.
- Blanda homogenatet i Stomacherpåse (eller 1 mL alikvot av nedsatt cellsuspension) med en pipett. Gör följande i dubbletter. Överför 300 mikroliter till ett 96-bra plan botten plattan. Inom brunnarna i 96-brunnar utföra 1:10 seriespädningar (30 mikroliter till 270 mikroliter PBS) till en 10 -5 utspädning för varje vävnad homogenatet prov.
- Noggrant sprids 0,1 ml av varje utspädning till en förtorkas HBA tallrik med ett glas spridare. Inkubera plattorna vid 37 ° C över natten.
- Räkna antalet CFU för varje spädning och beräkna CFU per vävnaden med hänsyn till den del av vävnaden (t ex en halv mjälte), spädningsfaktorn, och den totala volymen av vävnad homogenatet (5 ml eller 40 ml): CFU / vävnad = CFU/0.1 ml x spädningsfaktorn x ml / vävnad, för mjälte dividera detta tal med den procentuella vikten av mjälte urval som används för vävnad homogenisering (se steg 4.7).
Tips och anteckningar:
- Mer än en Stomacherpåse kan placeras i Stomachern i taget så länge som den totala volymen inte överstiger högsta volym som anges av tillverkaren
- Om en Stomacher inte är tillgänglig, kan en vävnad homogeniseringsapparat användas i stället. Alternativt kan följande metod, dock inte lika effektiv, också användas för att manuellt blöta orgeln i stället för steg 7,1 och 7,2: placera orgeln i en steriliserad förseglad plastpåse och lägg på en ren bänk medan du håller väskan stängas för att förhindra läckage . Rulla en 500 ml flaska laboratorieglas upprepade över påsen tills vävnaden är ordentligt mosade. Tillsätt 5 ml PBS till varje väska och gå vidare till steg 7,3.
- Det är mycket viktigt i steg 7,4 att HBA plattorna torkas noga(Dvs ingen fukt på agar). Annars kan det vara svårt att få tydliga Listeria kolonier som kan räknas på rätt sätt.
- Om det finns begränsade HBA plattor, är ett alternativt steg 7,4: Rita linjer på botten av en förtorkas HBA platta (steg 1,1) för att dela upp den i 5-6 sektioner, en för varje utspädning. Försiktigt pipettera 25 mikroliter av varje utspädning till motsvarande avsnitt på HBA plattan för varje vävnad homogenatet - inte sprids med en spridare. Vänta tills droppar av vävnad homogenatet är torra innan vända plattan. Inkubera plattan vid 37 ° C över natten. Upp till 80 kolonier kan urskiljas på grund av en droppe på en agarplatta.
- Spädning av vävnad homogenat kan bero på Listeria tillväxten i djuret och kan uppskattas utifrån de symtom som visas av djuret vid dödshjälp. För möss som är märkbart döende, sedan ytterligare spädningar kan vara nödvändigt att mer exakt bestämma bakteriehalten. För möss inokuleras med låga doser av Listeria eller möss avlivas i slutet av infektionen perioden kan outspädd vävnad homogenatet användas för att bestämma den bakteriella belastningen.
- Plattorna kan inkuberas vid 37 ° C över natten eller i rumstemperatur i 2-3 dagar.
8. Representativa resultat:
För en vanlig infektion experiment var listeria från en frusen glycerol lager och streckad på en HBA platta som visas i figur 1. Om få kolonier erhålls efter strimmor, kan det tyda på dålig ränder eller en mindre än optimal frysta lager. En Listeria smittsamma lager var beredd från en nyligen strimmig HBA plattan och förvaras vid -70 ° C. För mätning av bakteriella clearance och immunsvar, späd vi rutinmässigt tinade Listeria smittsamma lager till 2500 CFU / mL - 15.000 cfu / ml och injicera möss med 200 mikroliter att smitta dem med 500 - 3000 CFU. Vi observerar att möss infekterade med sub-dödliga doser av Listeria använda detta protokoll tillfälligt kan uppvisa ruggig päls, krökt kroppshållning och viktminskning inom de första dagarna. Dessa symtom erbjuder visuell på hur allvarligt en person mus påverkas av infektionen, om det reagerar olika på resten av gruppen (dvs. en "uppenbar" avvikare) och om dödshjälp är nödvändigt för att förhindra onödigt lidande och förestående död på grund av infektion.
I de resultat som representeras av figur 2-5, möss infekterade med hjälp av en nyligen upptinad alikvot av Listeria smittsamma lager. Vid olika tidpunkter efter infektion, möss avlivas och lever och mjälte togs bort. Figur 2 visar en HBA platta som spätts mjälte homogenatet från en enda mus var odlade. Det bör finnas en tydlig minskning av antalet kolonier som spädningsfaktorn blir högre, så att räkna distinkt CFU är möjligt för minst två spädningar. Om musen har rensat Listeria-infektion (dvs. detektionsgräns = 100 CFU / vävnad), därefter <5 Listeria kolonier kommer finnas på HBA-plattan som spreds med 200 mikroliter i outspätt vävnad homogenatet. Om lever-och / eller mjälte blivit förorenade med tarm eller andra externa bakterier under isolering kolonierna på HBA plattan kommer sannolikt att uppvisa olika morfologi (dvs kommer inte att ha karakteristiska gloria och blek färg Listeria kolonier) och / eller kan vara olika i kolonin räknas till vad som förväntas för listeria (dvs för få eller för många). Figur 3 visar en typisk listeria clearance kurvan för C57BL / 6 möss - observera att Listeria normalt elimineras snabbare från mjälten än levern och att klarering inte ske förrän fem dagar efter infektion.
Figur 4 visar celltal baserat på encelliga suspensioner beretts av mjälte och lever av infekterade möss vid olika tidpunkter efter infektion. Denna metod kan uppnå> 95% leukocyt renhet i encelliga suspensioner beretts av lever och> 80% från mjälten. Leukocyte renhet kan bestämmas med FACS analys med en monoklonal antikropp specifik för pan-leukocyt markör CD45 (klon 30-F11). Vanligtvis antalet splenocytes och leukocyter nedsatt öka under perioden det tar att rensa infektion med levern uppvisar en större faldig ökning av nedsatt leukocyter, men en betydligt mindre total, jämfört med ökningen av splenocytes i mjälten. Den typ och antal immunceller kan bestämmas genom märkning av encelliga suspensioner med antikroppar specifika för cellytan markörer. Märkta celler kan sedan detekteras med FACS analys. Figur 5 ger representativa resultat för CD8 + T-celler. Under en standard Listeria infektion i C57BL / 6 möss, minskar antalet CD8 + T-celler övergående grund lymfopeni i mjälten på dagar 2-3 before ökar märkbart från dag 5 efter infektion i både mjälten och levern.
Figur 1. HBA platta strimmig med Listeria. En steril ympa loop användes för att göra strimmig Listeria från en frusen glycerol lager. Plattan var inkuberas vid 37 ° C över natten. Den karakteristiska gloria kring enskilda kolonier beror på att β-hemolys.
Figur 2. Tissue homogenatet från en Listeria-smittade musen odlade på HBA-plattor. En lever har skördats från ett Listeria-smittade C57BL / 6 musen på 3 dagar efter infektion. Tissue homogenatet var beredd och utspädning placerade sig som 100 l full tallrik spreaden för 10 -4 utspädning (A) och 10 -5 utspädning (B) samt 25 l droppar på en HBA plåt för varje 1:10 utspädning från outspädd till 10 -5 (C). Plattorna inkuberades vid 37 ° C över natten. De spädningar som möjliggör räkning av enskilda kolonier används för att bestämma bakteriehalten (dvs CFU / vävnad) vid denna tidpunkt efter infektion.
Figur 3. Listeria belastning i mjälte och lever av infekterade C57BL / 6 möss vid 3 och 7 dagar efter infektion. C57BL / 6 möss infekterade med ~ 2000 CFU av Listeria. Vid varje tidpunkt, möss avlivas, levern var perfusion och skördas med mjälten och spädningar av mjälten homogenatet (A) eller nedsatt encelliga fjädring (B) odlades på HBA plattor för att bestämma bakteriehalten. Heldragna linjer visar geometriska medelvärdet och vertikala staplar indikerar SEM. Den streckade linjen visar att detektionsgränsen för noggrann mätning av bakteriehalten är 100 cfu / orgel för detta experiment.
Figur 4. Livskraftiga blodkroppar för vävnader från infekterade möss. C57BL / 6 möss infekterade med ~ 2000 CFU av Listeria. Vid varje tidpunkt, möss avlivas, lever perfusion och skördas med mjälten. Cellerna färgades med trypan blå och räknade med en hemacytometer som beskrivs i steg 5,9 (A). Splenocyte (B) och nedsatt leukocyt (C) räknas från encelliga suspensioner beretts av Listeria-infekterade möss. Linjer anger geometriska medelvärdet.
Figur 5. FACS analys av CD8 + T-celler i Listeria-infekterade möss. C57BL / 6 möss infekterade med ~ 2000 CFU av Listeria. Vid varje tidpunkt, möss avlivas, lever perfusion och skördas med mjälten. Encelliga suspensioner färgades med antikroppar mot T-celler (CD3, TCRβ, CD4, CD8). (A) representant FACS profiler med% CD8 + T-celler + / - SEM. (B) Total CD8 + T-celler i mjälten. (C) Totalt CD8 + T-celler i levern.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Anna Walduck, Christina Cheers, Stuart Berzins, Dale Godfrey, Yifan Zhan och Jonathan Wilksch för råd och reagenser. Detta arbete har finansierats av Juvenile Diabetes Research Foundation (1-2008-602) och den australiska nationella hälso-och medicinska forskningsrådet (575.552). NV stöds av en australisk Forskarutbildning Award. OW stöds av en RD Wright stipendium från Australian National Health Medical Research Council.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Horse blood agar base No.2 | Oxford Labware | CM0271 | Preparation of agar base for HBA plates |
| Horse blood (defibrinated) | Oxford Labware | HB1000 | Add 5-10% to agar base |
| Brain heart infusion (BHI) broth (10 mL) | Oxford Labware | TM456 | |
| Brain heart infusion dehydrated media | Oxford Labware | CM1135 | |
| 96-well flat bottom plate | BD Biosciences | 353072 | |
| 70 μm cell strainer | BD Biosciences | 352350 | |
| Small petri dish | BD Biosciences | 351007 | |
| Stomacher 80 biomaster lab system | Seward | ||
| Plastic Stomacher bags | Sarstedt Ltd | 86 9924 530 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A3912 | |
| FACS buffer | 0.1% (w/v) bovine serum albumin in PBS | ||
| Isotonic Percoll (33.75% Percoll in PBS) | GE Healthcare | 17-0891-01 | 33.75mL Percoll, 3.75mL 10x PBS, 62.5mL 1x PBS makes 100mL isotonic Percoll |
| TAC Buffer | 17mM Tris, 140mM ammonium chloride in distilled water | ||
| FCS/EDTA buffer | Fetal calf serum with 10mM EDTA | ||
| FACS/EDTA buffer | FACS buffer + 5mM EDTA | ||
| Trypan blue | Sigma-Aldrich | T6146 | 0.4% (w/v) in PBS, filter sterilized |
| 2mL Cryovial | Greiner Bio-One | 121263 | |
| 27 gauge/1mL insulin syringe | Terumo Medical Corp. | SS10M2713 | |
| Needle | Terumo Medical Corp. | NN-2516R (25G 5/8in) NN-2613R (26G 1/2in) | |
| Syringe | Terumo Medical Corp. | SS-01T (1mL), SS-053 (5mL), SS-10S (10mL) |
References
- Wing, E. J., Gregory, S. H. Listeria monocytogenes: clinical and experimental update. J Infect Dis. 185, Suppl 1. S18-S24 (2002).
- Conlan, J. W. Early host-pathogen interactions in the liver and spleen during systemic murine listeriosis: an overview. Immunobiology. 201, 178-187 (1999).
- Neuenhahn, M., Busch, D. H. Unique functions of splenic CD8alpha+ dendritic cells during infection with intracellular pathogens. Immunol Lett. 114, 66-72 (2007).
- Cousens, L. P., Wing, E. J. Innate defenses in the liver during Listeria infection. Immunol Rev. 174, 150-159 (2000).
- Hamon, M., Bierne, H., Cossart, P. Listeria monocytogenes: a multifaceted model. Nat Rev Microbiol. 4, 423-434 (2006).
- Pamer, E. G. Immune responses to Listeria monocytogenes. Nat Rev Immunol. 4, 812-823 (2004).
- Cheers, C., McKenzie, I. F. Resistance and susceptibility of mice to bacterial infection: genetics of listeriosis. Infect Immun. 19, 755-762 (1978).
- Garifulin, O., Boyartchuk, V. Listeria monocytogenes as a probe of immune function. Brief Funct Genomic Proteomic. 4, 258-269 (2005).
- Gervais, F., Stevenson, M., Skamene, E. Genetic control of resistance to Listeria monocytogenes: regulation of leukocyte inflammatory responses by the Hc locus. J Immunol. 132, 2078-2083 (1984).
- Gervais, F., Desforges, C., Skamene, E. The C5-sufficient A/J congenic mouse strain. Inflammatory response and resistance to Listeria monocytogenes. J Immunol. 142, 2057-2060 (1989).
- Boyartchuk, V. L. Multigenic control of Listeria monocytogenes susceptibility in mice. Nat Genet. 27, 259-260 (2001).
- Boyartchuk, V. The host resistance locus sst1 controls innate immunity to Listeria monocytogenes infection in immunodeficient mice. J Immunol. 173, 5112-5120 (2004).
- Pan, H. Ipr1 gene mediates innate immunity to tuberculosis. Nature. 434, 767-772 (2005).
- Garifulin, O. Irf3 polymorphism alters induction of interferon beta in response to Listeria monocytogenes infection. PLoS Genet. 3, 1587-1597 (2007).
- Hof, H. Virulence of different strains of Listeria monocytogenes serovar 1/2a. Med Microbiol Immunol (Berl. 173, 207-218 (1984).
- Wollert, T. Extending the host range of Listeria monocytogenes by rational protein design. Cell. 129, 891-902 (2007).
- Lecuit, M. A transgenic model for listeriosis: role of internalin in crossing the intestinal barrier. Science. 292, 1722-1725 (2001).
- Marco, A. J. Penetration of Listeria monocytogenes in mice infected by the oral route. Microb Pathog. 23, 255-263 (1997).
- Busch, D. H., Vijh, S., Pamer, E. G. Animal model for infection with Listeria monocytogenes. Curr Protoc Immunol. Chapter. 19, 19-19 (2001).
- Neuenhahn, M., Schiemann, M., Busch, D. H. DCs in mouse models of intracellular bacterial infection. Methods Mol Biol. 595, 319-329 (2010).
- Conlan, J. W., North, R. J. Neutrophils are essential for early anti-Listeria defense in the liver, but not in the spleen or peritoneal cavity, as revealed by a granulocyte-depleting monoclonal antibody. J Exp Med. 179, 259-268 (1994).
- Czuprynski, C. J., Brown, J. F., Wagner, R. D., Steinberg, H. Administration of antigranulocyte monoclonal antibody RB6-8C5 prevents expression of acquired resistance to Listeria monocytogenes infection in previously immunized mice. Infect Immun. 62, 5161-5163 (1994).
