الفئران الفحص مساريق الأوعية الدموية

Summary

لم تكن طبيعية نسيج أوعية دموية الكبار الثدييات التي تفتقر الأوعية الدموية الفسيولوجية والتي تتعرض لتدخل جراحي يستخدم لدراسة : (ط) بدء وتطوير الأوعية الدموية داخل الصفاق التالية من وكلاء الإدارة الاختبار ، و (ب) تعديل الأوعية الدموية التالية للادارة الشاملة اختيار وكلاء الاختبار.

Protocol

1. الحيوانات

1. وقد استخدمت القوارض الصغيرة مثل الجرذان والفئران وخنازير غينيا ، حيث أن النماذج الحيوانية. للأسف ، الفئران البالغة (وقد تم تقييم سلالات كثيرة الماوس) تميل إلى انعدام أو يكون لها سوى عدد قليل جدا من إمكانات الوالد microvessels (من الأوعية الدموية التي يمكن أن تنشأ) داخل نوافذ منازلهم المساريقي ، الأمر الذي يجعل الدراسات باستخدام الفئران غير موثوق بها. لذلك ، فقد وضعت أساسا لفحص الفئران.
2. ويعيش عادة في الفئران ، والتي هي متأقلمة مع البيئة القياسية ل7 أيام على الأقل بعد الولادة من المربي ، في أزواج في قفص موحدا تحت دائرة الضوء / الظلام 12 ساعة مع حرية الوصول إلى المياه والكريات. ويتميز كل حيوان. نستخدم معظمها الفئران الشباب البالغين (عادة 7-10 أسابيع من العمر من سلالات مختلفة ولكن عادة الجرذان الذكور سبراغ داولي ؛ في الفئران الذين تقل أعمارهم عن سن 5-6 أسابيع من عدد microvessels الأم تميل إلى أن تكون منخفضة) تم الحصول عليها من مربي متنوعة. في الفترة السابقة على التجربة وطوال هذه التجربة ، يتم وزن الحيوانات كل يوم الثاني على التوالي ، ودائما في يوم التضحية. عندما يتم التعامل مع الحيوانات الملكية الفكرية في وقت واحد (لتحريض الأوعية الدموية ، أنظر أدناه) والشوري أو الرابع أو بريد ، يتم وزن كل منهم اليوم. هذا يتيح إنشاء مجموعات تجريبية والسيطرة على وزن الجسم على قدم المساواة في بداية التجربة ، ويتيح رصد تأثير العلاج على الجسم كسب الوزن أثناء التجربة. منذ الفئران الذكور البالغين ينمو بقوة من الناحية الفسيولوجية (اكتساب حوالي 40-60 غ لكل أسبوع اعتمادا على نوع من سلالة) ، وزن كسب التخلف هو علامة بديلا الحساسة من السمية ، النظمية الرفاه ، وفقدان الشهية ، والفشل في تحقيق الازدهار.

ونحن نعمل في منشأة الرعاية الحيوانية عالية المستوى وتبذل جهود كبيرة لتقليل مستويات التوتر التي يمر بها الحيوانات. المبادئ التوجيهية الحالية الأخلاقية هي تلك التي أنشأتها ركمان P. آخرون (المبادئ التوجيهية لرعاية واستخدام الحيوانات في أبحاث السرطان. برازيلي. J. السرطان 102 ، 1555-1577 ، 2010). وافقت لجنة أخلاقيات الحيوان من جامعة جوتنبرج هذه الدراسات.

2. الموالية للعلاج داخل الصفاق عائية

1. تم حل المرشح المؤيد للعائية عامل لفحصها والمخففة في المالحة الذيفان الداخلي المستخدمة في الحقن مجانا من المرضى (حتى عند مستويات منخفضة للغاية ، هو الذيفان الداخلي الموالية للعائية). تتم جميع الحلول تصل طازجة يوم الحقن المعقمة ، التي تمت تصفيتها (0.22 - ميليبور الترشيح ميكرون) ، التحقق من الرقم الهيدروجيني محايدة (7،1-7،3) ، وتستخدم في درجة حرارة الغرفة.
   يتم حقن عامل الاختبار في تركيزات منخفضة أو منخفضة جدا. على سبيل المثال ، الفئران rVEGF ₁₆₄ (564-RV/CF ؛ R & D أنظمة أوروبا المحدودة ، أوكسون ، المملكة المتحدة) هو الواحد ، وهو VEGF - A شكل الإسوي الغالبة على الفئران ، إلى 96 pmole / مل في المالحة الذيفان الداخلي مجانا ، مجمدة وتجمدها ويتم حقن حجم 5 مل الملكية الفكرية في الفئران. نستخدم حقنة 5 مل مع 0.8 ملم إبرة (إبرة الخضراء ، 21G) للحقن الملكية الفكرية. هذا العلاج ، نظرا مرتين يوميا لمدة 4.5 يوم ، أي ، من صباح يوم الاثنين (اليوم 0) وحتى صباح يوم الجمعة (يوم 4) ، ويدفع قوية استجابة الأوعية الدموية التي تنتشر في الأنسجة اختبار المساريقي ، وتبلغ ذروتها عند حوالي 21 يوما.
   إدارة الملكية الفكرية حل يضمن أن يتم تسليم وحدة التخزين بالكامل داخل التجويف البريتوني (وليس في المثانة والأمعاء ، أو أي جهاز آخر). الحقن السريع للتأكيد 5 مل يسمح اللمس من قبل المشغل أن طائرة السائل قد مرت من خلال جدار البطن في تجويف البطن.
   التالية ، قبل أو بالتزامن مع العلاج الموالية للعائية الملكية الفكرية ، ويمكن أن تدار أي وكيل من خيار اختبار النظام ككل.

3. Administation النظامية من الأوعية الدموية ، وكلاء تحوير

1. ويمكن استخدام أي طريق أخرى غير الطريق الملكية الفكرية ، لأن المعاملة الملكية الفكرية قد تؤثر على رد الفعل المستمر عائية من خلال تحريض التهاب أو ربما عن طريق تنشيط الخلايا البدينة في الأنسجة الاختبار ، الذي يمكن أن يؤدي إلى استجابة قوية مؤيدة للعائية. إلى جانب تناوله عن طريق الفم أو الحقن أو واحد الشوري الرابع ، ونحن غالبا ما تستخدم SC الادارة باستخدام minipumps التناضحي (واحد أو أكثر ، مع اختلاف الكميات والضخ مرات) لتقديم حل بمعدل ثابت لمدة تصل إلى سنتين أو عدة أسابيع.
2. التسريب المستمر تحت الجلد من العوامل اختبار
   الملء وغرس minipumps التناضحي
   عادة ، 5 يوم ، أي بعد يوم واحد في نهاية العلاج VEGF IP ، minipumps التناضحي (على سبيل المثال ، الموديل 2ML2 ، مع معدل ثابت من ضخ 5.0 ميكرولتر / ساعة عن 14-15 يوما ؛ مضخات تنافذي Alzet ، ماونتن فيو ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة) تمتلئ تحت ظروف معقمة مع وكيل أو اختبار السيارة المناسبة. بعد التخزين في 0.9 ٪ بين عشية وضحاها (ث / ت) كلوريد الصوديوم في 37 معقمة يتم زرعها جراحيا درجة مئوية ، ومضخة (ق) SC على ظهور (على جانبي العمود الفقري coluمليون في منطقة الكتف) من الفئران التي تم تخدير باستخدام الغاز isoflurane (Isoba البيطري ؛ شيرينغ بلاو صحة الحيوان ، ميرك وشركاه ، وشركة ، وايتهاوس محطة ، نيوجيرسي ، الولايات المتحدة) ، في البداية في غرفة محكمة الإغلاق وشفافة an في وقت لاحق عن طريق القناع (للحد من التوتر الذي يلحق الحيوان التالي ، يتم مسح الغرفة مع الهواء قبل أن يتم إعادة استخدامها). وخياطة شق الجلد التي لزرع مضخة فورا بعد زرع باستخدام خيط الحرير.
   منذ الحيوانات وزيادة الوزن من الناحية الفسيولوجية خلال الفترة التجريبية وتدار وكلاء اختبار بمعدل ثابت ، والجرعة الفعلية المختارة لاختبار دواء لكل كيلوغرام من وزن الجسم أعلى من متوسط ​​الجرعة في بداية فترة التسريب وأقل من الجرعة المتوسط ​​في نهاية فترة التسريب.
   يمكن الاطلاع على التسريب المستمر ، كما هو موضح هنا ، كما شكل موسع من العلاج metronomic.

4. إنهاء التجربة

1. يوضع حيوان واحد في وقت واحد في غرفة محكمة الإغلاق شفافة ، والتي يتم مسح بغاز ثاني أكسيد الكربون ₂ ، والتي تقتل الحيوان بسرعة. يتم مسح الغرفة مع الهواء قبل ان يتم استخدامها مرة أخرى.

5. عينات الأنسجة الحصاد

1. كما هو موضح في دي في دي ، يتم فتح جدار البطن ويتم التعرف على مساريق الأمعاء الصغيرة ، بما في ذلك الجزء الأكثر البعيدة التي تصل إلى صمام اللفائفي الأعوري (تقاطع من الأمعاء الدقيقة والأمعاء الغليظة). أربعة (أو أكثر) من "ويندوز" معظم تقع بشكل أقصى مرقمة وانتشارها على مستوى المعالجة Superfrost الهدف بلس الشرائح - (داكو الدانمارك A / S ، جلوستروب ، الدانمارك). من المهم أن تتجنب ، إذا كان ذلك ممكنا ، وتلوث عينات الدم مع محتويات القناة الهضمية ، أو غيرها من سوائل الجسم ، حيث أن هذه المواد قد تكون ملطخة غير محدد ، رغم أن هذا لا يفسد لاحقة التصور المناعى من microvessels.
2. وينتشر في كل عينة نافذة المساريقي المرفقة مع الجزء الأمعاء الصغيرة على شريحة وتجفيفها في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة. ثم يتم قطع الجذع قبالة المعوية ، بينما يتم تخزين العينات سليمة مساريق الغشائي في -20 درجة مئوية لفترات طويلة. ويظهر هذا في دي في دي.

تجدر الإشارة إلى أن الأوعية الدموية في الأنسجة وبراءات الاختراع يمكن تصور مسبق لجني مع المجهري المنقولة intravital الخفيفة.

6. بروتوكول لتلطيخ المناعى من Microvessels

1. اليوم 0
   يسمح للذوبان من العينات إلى -20 درجة مئوية إلى درجة حرارة الغرفة ، والمجففة في مجلس الوزراء في 60 درجة مئوية لمدة 1 ساعة ، والاحتفاظ بها في درجة حرارة الغرفة بين عشية وضحاها.
2. اليوم 1
   ضع الشرائح في تلطيخ أصحاب الشريحة (في كل المسار الثاني) في وعاء وغسل تلطيخ مرتين مع TBS (الرقم الهيدروجيني 7.8) لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. يتم تجاهل حل واستبدال الحل التالي ، وهكذا دواليك لكافة الخطوات التالية.
3. التربسين العلاج
   ملء جرة تلطيخ التي تبطن حامل الشرائح تلطيخ مع الحل التربسين (25 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة). تجاهل الحل واحتضان مرتين مع حل السكروز 2.5 ٪ (درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق في كل مرة). تجاهل الحل وشطف بضع مرات في ماء مقطر (درجة حرارة الغرفة لبضع دقائق لكل منهما).
4. حظر
   ملء جرة تلطيخ التي تبطن حامل الشرائح تلطيخ مع 0.5 ٪ H ₂ O ₂ في ميثانول (درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة). تجاهل الحل وشطف مع ماء مقطر (درجة حرارة الغرفة لبضع دقائق). تجاهل الحل وشطف مرتين مع TBS (الرقم الهيدروجيني 7،4) (درجة حرارة الغرفة لمدة 8 دقائق في كل مرة).
5. حضانة
   حضانات في كل غرفة ترطيب في درجة حرارة الغرفة. وتستخدم ما يقرب من 150 ميكرولتر من كل من الحلول المذكورة أدناه لكل شريحة. توضع الشرائح في غرفة ترطيب وpipetted الحلول على العينات (الأجزاء غير الغشائي لا تحتاج إلى أن تشملها الحلول).
   لكل من الخطوات التالية ، يهز بعناية قبالة كل من الحل قبل إضافة حل لاحقة.
   1. الحضانة مع المصل (حجب) عادي (الحصان) (ABC الطقم) 3 قطرات حل الأصفر / 10 العازلة تخفيف مل لمدة 20 دقيقة.
   2. الحضانة مع الضد ARU0181 الابتدائية ، التي تصف الفئران خلايا بطانة الأوعية الدموية. غير المخفف مع الجسم المضاد 1:600 ​​العازلة التخفيف (بيوسورس) (100 ميكرولتر المخفف 40 أضعاف [المجمد] زائد 900 العازلة تخفيف ميكرولتر) ويحدث بين عشية وضحاها حضانة في 4 درجات مئوية.
6. اليوم 2
   تتم إزالة الشرائح من غرفة ترطيب ، يتم تجاهل الضد الأولية ، وتوضع الشرائح في تلطيخ حامل الشرائح ، وهي غارقة في جرة تلطيخ وتشطف مرتين مع TBS(الرقم الهيدروجيني 7.8) لمدة 8 دقائق.
   1. الحضانة مع الضد biotinylated (ABC الطقم)
      توضع الشرائح أفقيا في غرفة ترطيب وحضنت مع 1 قطرة من حل الزرقاء / 10 العازلة تخفيف مل لمدة 30 دقيقة. تجاهل حل ووضع الشرائح في تلطيخ حامل الشرائح المغمورة في الجرة تلطيخ وشطف مرتين مع TBS (الرقم الهيدروجيني 7.4) لمدة 8 دقائق.
   2. الحضانة مع كاشف ABC
      توضع الشرائح أفقيا مرة أخرى في غرفة ترطيب وpipetted الحلول التالية على الأجزاء الغشائي من العينات : 2 قطرات من محلول البرتقال بالإضافة إلى 2 قطرات من مل البني TBS حل / 10 (الرقم الهيدروجيني 7،4) لمدة 30 دقيقة. مزيج بعناية قبل 30 دقيقة من الاستخدام! تجاهل حل ووضع الشرائح في حامل الشرائح في الجرة تلطيخ وشطف مرتين مع TBS (الرقم الهيدروجيني 7.4) لمدة 8 دقائق.
7. تلطيخ مع DAB (0.05 ٪)
   يجب تنفيذ هذه الخطوة في غطاء التهوية الكيميائية!
   مكان الشرائح وإضافة 3،3 - diaminobenzidine (DAB ؛ سيغما الدريخ) حل باستخدام ماصة : 0.1 ٪ في حل DAB TBS (7.4 درجة الحموضة) [المجمد] هو المخفف 01:01 بمزيج من 10 ميكرولتر O ₂ H ₂ و 7.5 مل TBS (الرقم الهيدروجيني 7.4). هذا الحل هو عقيم ، تمت تصفيتها قبل استخدامها (للقضاء على أي الجزيئات التي يمكن أن تحجب صورة مجهرية). وصمة عار على العينات لمدة 8 دقائق. تجاهل حل ووضع الشرائح في حامل الشرائح تلطيخ الغارقة في الجرة تلطيخ. شطف تحت صنبور الماء الجاري ثم في ماء مقطر لبضع دقائق.
8. جفاف
   يتم الاحتفاظ الشرائح في تلطيخ حامل الشرائح. شطف وإعادة تعبئتها من قبل رميه في جرة تحتوي على ماء مقطر تلطيخ / الايثانول : ماء مقطر ، 70 ٪ كحول والكحول 95 ٪ ، الكحول المطلق ، مع 2 دقيقة في كل حل.

7. التصوير وتقييم شبكة الاوعية الدموية الدقيقة في كل نموذج نافذة مساريقي بعد تلطيخ المناعى للخلايا بطانة الأوعية الدموية

كما يظهر في الفيلم ، هي المجهر microvessels تصور في موقعها الأصلي في أنسجة سليمة.

1. أولا ، نحن نستخدم المجهر الرسم مع مجموعة التكبير 14-34 (لايكا البرية 3Z M) للقلم على ورقة بيضاء في إطار منطقة بأكملها ، فضلا عن المنطقة بأسرها أوعية دموية (VA) في إطار المساريقي. VA ، كنسبة مئوية من المنطقة بأكملها ، ويقاس بسهولة باستخدام planimetry المحوسبة أو غير محوسبة (أو ببساطة عن طريق الاستغناء عن والترجيح صورة الإطار كله ، والصور من جميع أنحاء أوعية دموية بها).
2. يتم رسمها باستخدام المجهر أخرى الرسم ، وملامح microvessel الفردية ، التي يتم تحديدها بسهولة ، بالحبر الأسود على الورق الأبيض في 80 التكبير داخل حقول تم اختيارهم عشوائيا. هذه هي نقطة الانطلاق لتقييم لاحق morphometric المحوسبة طول الاوعية الدموية الدقيقة (MVL) ، والذي هو في الأساس وسيلة لقياس كثافة الاوعية الدموية الدقيقة.
3. اختياريا ، والمتغيرات ذات الصلة لتشكيل نمط الاوعية الدموية الدقيقة ، يمكن تحديد وكذلك تلك الخاصة بتقييم عدد من الاوعية الدموية الدقيقة وبراعم براعم طول الاوعية الدموية الدقيقة الفردية (رقم SP و Le. SP ، على التوالي). وعلى النقيض الأمثل ، بين هياكل السفن السوداء وصورت على خلفية بيضاء يسهل تحليلات مفصلة للصور في معظم البرامج التجارية morphometric المحوسبة.
4. في معظم الحالات ، فإن المتغيرات الرئيسية هي وزارة شؤون المحاربين القدامى MVL ، والتي تضاعفت عندما معا تولد الاوعية الدموية الدقيقة طول الكلي (TMVL).

8. التحليل الإحصائي

نحن عادة استخدام معيار غير بارامترية مان ويتني U - اختبار لتحليل المفردة (اثنان الذيل) الملاحظات. ويستخدم متوسط ​​أربع نوافذ المساريقي لكل حيوان والمستقلة بيانات نقطة لكل متغير من النافذة المساريقي. المعيار هو للدلالة إحصائية P ≤ 0.05.

Discussion

وقد قدم في عام 1986 فحص ⁽³⁾ ولقد تم تطويرها تباعا وصقلها في مختبرنا ^7،10-12. كما نوقشت في ورقات الاستعراض (دعوة) ^{1 ، 2} ، مقايسة يقارن جيدا مع الثدييات الأخرى في مقايسة الأوعية الدموية في الجسم الحي الصدد ولا سيما إلى ميزات هامة مثل النسيج اختبار الكبار أصلا أوعية دموية ويفتقر إلى الأوعية الدموية الفسيولوجية ؛ الحد الأدنى من الصدمة ، إن وجد ، هو لحقت النسيج ؛ تقاس المتغيرات الكمية حقا ، والذي يسمح التحليل الإحصائي السليم بشأن الاستجابة للجرعة والدراسات الجزيئية النشاط ؛ تنتشر الأوعية الدموية يحدث ، وهو غلبة في الأنسجة الطبيعية والأورام ، ويتم تجميع البيانات بسهولة السمية في الفئران التي تنمو بقوة من الناحية الفسيولوجية في مرحلة البلوغ. قد تتضمن ميزات غير ملائم حقيقة أن مقايسة نسبيا تستغرق وقتا طويلا ، وخصوصا عندما تقدير عدد وطول قطاعات microvessel الفردية وبراعم microvessel ، وأنه لا يسمح real-time/serial الملاحظات ، وأنه لا يصلح بالمرة لالفئران منذ العديد من النوافذ المساريقي في الفئران عدم microvessels الأصل المحتملة من الشعيرات الدموية الجديدة التي يمكن أن تنشأ.

هي ، في الوقت الحقيقي الملاحظات ومع ذلك ، تمكين بواسطة المجهر intravital حيث مفلطحة النوافذ سليمة المساريقي exteriorized لكن على مدى مرحلة المجهر بينما الحيوان هو تخدير ، كما نوقش في ^1.

وقد تم تحقيق تقدم كبير في مجال البحوث الأوعية الدموية في العقود الماضية باستخدام نماذج مثل micropocket القرنية ، والغشاء فرخ مشيمائي ، والمقايسات SC Matrigel المكونات ، والتي هي أدوات مفيدة لكنها محدودة في نهاية المطاف. التطبيقات السريرية في المستقبل من العلاجات المضادة للعائية وعائية الموالية - يستلزم إنشاء والتحقق من صحة أكثر حساسية وأهمية من الناحية البيولوجية ، ونماذج ما قبل السريرية الكمية حقا ، مثل تلك التي وصفها في التقرير الحالي.

Materials

Buffers and reagents

0.5 M Tris-HCl (pH 7.8) stock solution Tris (hydroxymethyl) aminomethan (60.57 g) is dissolved in ~900 ml aqua dest and ~45 ml of 25% HCl (concentrated) is added to achieve pH 7.8 followed by dilution to 1 liter with aqua dest.

Tris-buffer saline (TBS; pH 7.8) To 200 ml of the stock solution is added 18 g NaCl dissolved in ~1800 ml aqua dest with adjustment of pH to 7.8 using the stock solution, followed by dilution to 2 liter with aqua dest.

TBS (pH 7.4) To 200 ml of the stock solution is added 18 g NaCl dissolved in dissolved in ~1800 ml aqua dest with adjustment of pH to 7.4 using the stock solution, followed by dilution to 2 liter with aqua dest.

Trypsin solution (0.05% trypsin, 0.1% CaCl2) Contains 0.1 g trypsin and 0.2 g CaCl2 in 200 ml TBS (pH 7.8).

Sucrose solution 2.5% Contains 5 g sucrose in 200 ml TBS (pH 7.8).

Stock solution of 1% Sodium azide in TBS (pH 7.4) Contains 1 g Na-azide in 100 ml with TBS (pH 7.4).

Diluting buffer: 0.1% BSA, 0.01% Na-azide (Used to dilute antibodies in the Vectastain ABC kit). Contains 0.1 g bovine serum albumin (BSA) and 1 ml of 1% Na-azide, diluted to 100 ml with TBS (pH 7.4).

ABC kit Vectastain PK 4002, ABC peroxidase mouse IgG Normal horse serum; blocking serum; yellow solution: 3 drops/10 ml dilution buffer. Biotinylated antibody; anti-mouse IgG; blue solution: 1 drop/10 ml dilution buffer. ABC-reagent: orange solution, 2 drops plus brown solution 2 drops/10 ml TBS (pH 7.4).

Mix these solutions 20 minutes before use!

Mouse (monoclonal) anti-rat endothelium(Biosource International, Camarillo, CA, U.S.A.)

This antibody is directed against all vascular endothelial cells in the rat, with the exception of those in the brain.

Vectastain peroxidase Avidin Biotin Complex (ABC) kit The kit contains primary antibody, biotinylated secondary antibody, avidin-biotinylated enzyme complex (ABC), and enzyme substrate. See www.vectorlabs.com or www.immunkemi.se for protocols.

Bovine serum albumin(BSA) (Sigma-Aldrich, catalog # A-4503). DAB= 3,3’-Diaminobenzidine Isopac (Sigma-Aldrich, catalog # D 9015). Trypsinfrom Bovine Pancreas (Sigma-Aldrich, catalog # T 4665). Vectastain peroxidase ABC-kit, Mouse IgG (Immunkemi F & D AB, Jarfalla, Sweden)