Rata mesenterio ensayo angiogénesis

Summary

Adultos normales tejido vascularizado mamífero que carece de la angiogénesis fisiológica y que no ha sido expuesto a la intervención quirúrgica se utiliza para estudiar: (i) el inicio y desarrollo de la angiogénesis tras la administración intraperitoneal de agentes de prueba, y (ii) la modificación de la angiogénesis tras la administración sistémica de seleccionados agentes de pruebas.

Abstract

El mesenterio rata adulta ventana de ensayo de la angiogénesis es biológicamente adecuado y está excepcionalmente bien adaptado para el estudio de brotes angiogénesis in vivo [ver artículos de revisión], que es la forma dominante de la angiogénesis en los tumores y tejidos humanos no tumorales, como se discutió en la revisión de invitados artículos ^1,2. Angiogénesis inducida en las partes mesentérica membranosa por vía intraperitoneal (ip) la inyección de un factor pro-angiogénico puede ser modulada por vía subcutánea (sc), por vía intravenosa (iv) u oral (po) el tratamiento con agentes modificadores de la elección. Cada parte membranosa del mesenterio es transparente y enmarcado por el tejido adiposo, dándole una apariencia similar a la ventana.

El ensayo tiene las características ventajosas siguientes: (i) el tejido vascularizado prueba de forma nativa, aunque poco, y ya que es muy delgada, la red de microvasos es prácticamente bidimensional, que permite a toda la red para ser evaluados microscópicamente in situ; ( ii) en ratas adultas del tejido prueba carece de la angiogénesis fisiológica importante, que caracteriza a la mayoría de los tejidos normales de los mamíferos adultos, el grado de vascularización materna es, sin embargo, en correlación con la edad, como se discutió en ^una, (iii) el nivel insignificante de la angiogénesis inducida por el trauma asegura una alta sensibilidad, (iv) el ensayo reproduce la situación clínica, como los medicamentos de prueba de la angiogénesis modulación se administran por vía sistémica y las respuestas observadas reflejan el efecto neto de todos los metabólicos, celulares y alteraciones moleculares inducidos por el tratamiento; (v) el ensayo permite la evaluación de los objetivos, las variables cuantitativas, sin prejuicios de la extensión espacial microvascular, la densidad y la formación de patrones de la red, así como de brotes capilares, lo que permite robusto análisis estadísticos de la relación dosis-efecto y molecular relaciones estructura-actividad, y (vi ) el ensayo pone de manifiesto con una alta sensibilidad a los efectos tóxicos o perjudiciales de los tratamientos en términos de disminución de la tasa fisiológica del peso corporal, como las ratas adultas creciendo sólidamente.

Mastocitos mediada por la angiogénesis se demostró por primera vez utilizando este ensayo ^3,4. El modelo muestra un alto nivel de discriminación respecto a los efectos de dosis-relaciones y los efectos medidos de la administración sistémica de química ni funcionalmente medicamentos estrechamente relacionados y las proteínas, incluyendo: (i) de baja dosis, administrada metronomically quimioterapéuticos estándares que producen diversos efectos específicos de drogas (es decir, las actividades de la angiogénesis-supresores, neutral o estimular la ^{angiogénesis-5),} (ii) naturales de hierro-insaturados lactoferrina humana, que estimula el VEGF-A la angiogénesis mediada por ^6, y natural de hierro-insaturados lactoferrina bovina, lo que inhibe el VEGF-A- angiogénesis mediada por ^7, y (iii) de bajo peso molecular fracciones de heparina producida por diversos medios ^8,9. Por otra parte, el ensayo resulta muy adecuado para los estudios de los efectos combinados de la angiogénesis de los agentes que se administran por vía sistémica en forma simultánea o secuencial.

La idea de hacer este video se originó a partir de finales de los años el doctor Judah Folkman, cuando visitó nuestro laboratorio y fue testigo de la metodología que se ha demostrado.

Revisión de los documentos (invitado) discutir y evaluar el ensayo

Norrby, K. En los modelos in vivo de la angiogénesis. J. Cell. Mol. Medicina 10, 588-612 (2006).

Norrby, las pruebas con modelos K. Drogas angiogénesis. Opin experto. De drogas. Descubrimiento. 3, 533 a 549 (2008).

Protocol

1. Los animales

1. Pequeños roedores, como ratas, ratones y cobayas, se han utilizado como modelos animales. Por desgracia, los ratones adultos (muchas cepas de ratón han sido evaluados) tienden a carecer o tener sólo un número muy bajo de potencial de los padres microvasos (a partir de que la angiogénesis puede originar) dentro de sus ventanas mesentérica, lo que hace que los estudios con ratones confiable. Por lo tanto, el ensayo ha sido desarrollado principalmente para las ratas.
2. Las ratas, que están aclimatados a un medio ambiente normal durante al menos 7 días después de la entrega del criador, suelen alojarse en parejas en una jaula estándar en un 12 hr luz / oscuridad ciclo con acceso libre al agua y pellets. Cada animal está marcada. Utilizamos principalmente ratas adultas jóvenes (por lo general 7-10 semanas de edad de las distintas cepas, pero las ratas Sprague-Dawley, generalmente de sexo masculino, en las ratas más jóvenes de 5-6 semanas de edad el número de microvasos nativos tienden a ser bajos) obtenidos de diversos criadores. En el período anterior a la prueba y durante todo el experimento, se pesan los animales cada dos días, y siempre en el día del sacrificio. Cuando los animales son tratados de forma concurrente ip (para la inducción de la angiogénesis, ver abajo) y sc o iv o po, se pesan cada día. Esto permite el establecimiento de grupos experimentales y de control del peso corporal igual al comienzo del experimento, y permite el seguimiento de la influencia del tratamiento en el cuerpo, aumento de peso durante el transcurso del experimento. Dado que las ratas macho adultas creciendo sólidamente fisiológicamente (ganando aproximadamente 40 a 60 g por semana, dependiendo del tipo de cepa), la ganancia de peso retraso es un marcador sustituto sensibles de toxicidad, sistémica el bienestar, la anorexia, y la falta de desarrollo.

Trabajamos en una instalación para animales de alto nivel de atención y un esfuerzo considerable para reducir al mínimo los niveles de estrés experimentado por los animales. Las directrices éticas actuales, son los establecidos por Workman P. et al. (Directrices para el bienestar y el uso de animales en la investigación del cáncer. Br. J. Cáncer 102, 1555-1577, 2010). El Comité de Ética Animal de la Universidad de Gotemburgo aprobó estos estudios.

2. Pro-angiogénicos tratamiento intraperitoneal

1. El candidato pro-angiogénicos factor a ser probado se disuelve y se diluye en la endotoxina libre de solución salina utilizada para la perfusión de los pacientes (incluso en niveles extremadamente bajos, la endotoxina es pro-angiogénico). Todas las soluciones están formadas por recién en el día de la inyección, esterilizada por filtración (Millipore 0,22 micras de filtración), se verificó su pH neutro (7,1-7,3), y se utiliza a temperatura ambiente.
   El agente de prueba se inyecta en concentraciones bajas o muy bajas. Por ejemplo, la rata rVEGF ₁₆₄ (564-RV/CF, R & D Systems Europe, Ltd., Oxon, Reino Unido), que es el VEGF-A isoforma predominante en ratas, se diluye a 96 pmol / ml de solución salina libre de endotoxinas, congelados y descongelado y un volumen de 5 ml se inyecta ip en la rata. Nosotros usamos una jeringa de 5 ml con aguja de 0,8 mm (aguja verde, 21G) para la inyección ip. Este tratamiento, dos veces al día durante 4,5 días, es decir., Desde la mañana del lunes (día 0) hasta la mañana del viernes (día 4), ​​induce una respuesta contundente al surgimiento de la angiogénesis en el tejido mesentérico prueba, alcanzando un máximo alrededor del día 21.
   La administración de la solución IP se asegura de que todo el volumen se entrega en la cavidad peritoneal (y no en los intestinos, la vejiga o cualquier otro órgano). La inyección rápida de 5 ml permite la confirmación táctil por el operador que el chorro de fluido ha pasado a través de la pared abdominal en la cavidad abdominal.
   Siguientes, antes o simultáneamente con la ip pro-angiogénicos tratamiento, cualquier agente de la prueba de elección puede administrar por vía sistémica.

3. Administación sistémica de la angiogénesis, la modulación de los agentes

1. Cualquier otra vía que la vía IP se pueden utilizar, ya que el tratamiento ip puede afectar a la reacción en curso angiogénicos a través de la inducción de la inflamación o posiblemente por la activación de los mastocitos en el tejido de prueba, que puede conducir a un fuerte pro-angiogénicos respuesta. Además de la administración oral o inyección única subcutánea o intravenosa, a menudo utilizamos la administración subcutánea utilizando minibombas osmóticas (uno o más, con diferentes volúmenes de bombeo y los tiempos) para ofrecer la solución a una velocidad constante durante un máximo de dos o varias semanas.
2. Infusión subcutánea continua de los agentes de pruebas
   Llenado y la implantación de minibombas osmóticas
   Por lo general, el día 5, es decir, un día después del final del tratamiento con VEGF ip, minibombas osmóticas (por ejemplo, el modelo 2ML2, con velocidad constante bombeo de 5,0 l / h de 14 a 15 días; Alzet bombas osmóticas, Mountain View, CA , EE.UU.) se llenan en condiciones estériles con el agente de ensayo o el vehículo apropiado. Después de un almacenamiento en estéril al 0,9% (w / v) NaCl la noche a 37 ° C, la bomba (s) se implantan quirúrgicamente sc en la espalda (en el lado de la columna vertebral Column en la región de la escápula) de las ratas que han sido anestesiados con gas isoflurano (veterinario Isoba, Schering-Plough Animal Health, Merck & Co., Inc., Whitehouse Station, NJ, EE.UU.), inicialmente en una cámara transparente y hermético Posteriormente, a través de una máscara (para minimizar el estrés causado al animal siguiente, la cámara se llena con aire antes de que se reutiliza). La incisión de la piel hecha para la implantación de la bomba se sutura inmediatamente después de la implantación del uso de hilo de seda.
   Puesto que los animales el aumento de peso fisiológicamente durante el período experimental y los agentes de prueba se administra a una velocidad constante, la dosis real seleccionado para una prueba de drogas por kg de peso corporal es superior a la dosis media al comienzo del período de infusión y es menor que la dosis media al final del periodo de perfusión.
   La infusión continua, como se describe aquí, puede ser visto como una forma extendida de tratamiento metronómica.

4. Poner fin a la experimentación

1. Un animal a la vez que se coloca en una cámara hermética transparente, que se llena con _gas CO2, que rápidamente se mata al animal. La cámara se purga con aire antes de ser utilizados de nuevo.

5. La recolección de muestras de tejido

1. Como se muestra en el DVD, la pared abdominal se abre, y el mesenterio del intestino pequeño es identificado, incluyendo la parte más distal que llega a la válvula íleo-cecal (la unión del intestino delgado y el intestino grueso). Cuatro (o más) de los más distal localizado "ventanas" se numeran y se extendió hacia el objetivo estándar sin tratar Superfrost Plus diapositivas (Dako Denmark A / S, Glostrup, Dinamarca). Es importante evitar en lo posible, la contaminación de las muestras con contenido de sangre intestinal, u otros fluidos corporales, ya que estos materiales se pueden teñir de forma no específica, aunque esto no invalida la posterior visualización inmunohistoquímica de microvasos.
2. Cada muestra ventana mesentérica con el segmento de intestino delgado es adjunta extiende sobre un portaobjetos y se secan a temperatura ambiente durante 20 minutos. Entonces, el tronco intestinal se corta, mientras que las muestras intactas membranosa mesenterio se almacenan a -20 ° C durante períodos prolongados. Esto se muestra en el DVD.

Cabe mencionar que la vascularización del tejido y las patentes se puede visualizar antes de la cosecha con la transmisión de microscopía intravital luz.

6. Protocolo para la tinción inmunohistoquímica de microvasos

1. Día 0
   Las muestras se dejan descongelar de -20 ° C a la temperatura ambiente, se seca en un armario a los 60 ° C durante 1 hora, y se mantiene a temperatura ambiente durante la noche.
2. Día 1
   Colocar los portaobjetos en la tinción de los titulares de diapositivas (en cada segunda pista) en una cubeta y lavar dos veces con TBS (pH 7,8) durante 10 minutos a temperatura ambiente. La solución se desecha y se sustituye por la siguiente solución, y así sucesivamente para todos los pasos siguientes.
3. Tripsina tratamiento
   Llene el recipiente de tinción que albergará el soporte de diapositivas tinción con solución de tripsina (25 ° C durante 20 minutos). Deseche la solución e incubar dos veces con solución de sacarosa al 2,5% (a temperatura ambiente durante 10 minutos cada vez). Deseche la solución y aclarar un par de veces en agua destilada (a temperatura ambiente durante unos minutos cada uno).
4. Bloqueo de
   Llene el recipiente de tinción que albergará el soporte de diapositivas tinción con 0,5% de H ₂ O ₂ en metanol (temperatura ambiente durante 30 minutos). Deseche la solución y enjuagar con agua destilada (a temperatura ambiente durante unos minutos). Deseche la solución y enjuagar dos veces con TBS (pH 7,4) (temperatura ambiente durante 8 minutos cada vez).
5. Incubación
   Todas las incubaciones se encuentran en una cámara húmeda a temperatura ambiente. Alrededor de 150 l de cada una de las soluciones que se indican a continuación se utilizan en cada diapositiva. Las diapositivas se colocan en una cámara húmeda y las soluciones son pipeta en las muestras (las partes no membranoso no tiene que ser cubierto por las soluciones).
   Para cada uno de los siguientes pasos, cuidadosamente deshacerse de toda la solución antes de que la solución posterior, se añade.
   1. Incubación con el normal (bloqueo) en suero (caballo) (ABC kit) 3 gotas de solución de color amarillo / 10 ml de tampón de dilución durante 20 minutos.
   2. Incubación con el anticuerpo primario ARU0181, que las etiquetas de rata células endoteliales vasculares. El anticuerpo se diluye 1:600 ​​con tampón de dilución (Biosource) (100 l diluido 40 veces [congelado] más 900 l de tampón de dilución) y la incubación se lleva a cabo la noche a 4 ° C.
6. Día 2
   Las diapositivas se retiran de la cámara húmeda, el anticuerpo primario se descarta y las diapositivas se colocan en un portaobjetos de tinción, que se sumerge en la cubeta y se lavaron dos veces con TBS(PH 7,8) durante 8 minutos.
   1. La incubación con anticuerpos con biotina (ABC kit)
      Las diapositivas se colocan horizontalmente en una cámara húmeda y se incubaron con 1 gota de solución de azul / 10 ml de tampón de dilución durante 30 minutos. Deseche la solución y colocar los portaobjetos en un soporte de diapositivas tinción sumergido en la cubeta y lavar dos veces con TBS (pH 7,4) durante 8 minutos.
   2. La incubación con el reactivo ABC
      Las diapositivas de nuevo en posición horizontal en una cámara húmeda y las soluciones siguientes pipeta en la parte membranosa de las muestras: 2 gotas de solución de naranja y 2 gotas de solución de TBS marrón / 10 ml (pH 7,4) durante 30 minutos. Mezclar cuidadosamente 30 minutos antes de usar! Deseche la solución y coloque las diapositivas en el soporte de diapositivas en la cubeta y lavar dos veces con TBS (pH 7,4) durante 8 minutos.
7. La tinción con DAB (0,05%)
   Este paso debe realizarse en una campana de ventilación química!
   Coloque las diapositivas y añadir el 3,3-diaminobencidina (DAB, Sigma-Aldrich) solución con una pipeta: solución al 0,1% en TBS DAB (pH 7,4) [congelado] se diluye 1:1 con una mezcla de 10 l H ₂ O ₂ y 7,5 ml de TBS (pH 7,4). Esta solución es esterilizada por filtración antes de su uso (para eliminar cualquier partícula que pueda oscurecer la imagen microscópica). Tinción de las muestras durante 8 minutos. Deseche la solución y coloque las diapositivas en el soporte de diapositivas manchas sumergidas en el tarro de las manchas. Enjuague con agua corriente y luego en agua destilada durante unos minutos.
8. Deshidratación
   Las diapositivas se mantienen en el soporte de diapositivas manchas. Enjuague por desechar y volver a llenar la jarra de tinción con agua destilada / etanol: agua destilada, alcohol al 70%, 95% de alcohol, alcohol absoluto, con 2 minutos en cada solución.

7. Imágenes y Evaluación de la red microvascular en cada muestra la ventana mesentérica Después de la tinción inmunohistoquímica de las células endoteliales vasculares

Como se muestra en la película, los microvasos son microscópicamente visualizar in situ en el tejido intacto.

1. En primer lugar, se utiliza un microscopio de dibujo con rango de aumento 14 a 34 (Leica M salvaje 3Z) a lápiz sobre papel blanco el área de la ventana entera, así como toda la zona vascularizada (VA) por la ventana mesentérica. VA, como porcentaje de toda el área, es fácil de medir mediante planimetría computerizada o no informáticos (o simplemente cortando y ponderación de la imagen de toda la ventana, y las imágenes de todas sus partes vascularizado).
2. El uso de otro microscopio de dibujo, los perfiles individuales de microvasos, que se identifican con facilidad, se dibujan en negro de tinta sobre papel blanco de 80 aumentos en los campos elegidos al azar. Este es el punto de partida para la posterior evaluación computarizada morfométrico de la longitud de complicaciones microvasculares (MVL), que es básicamente una medición de la densidad microvascular.
3. Opcionalmente, las variables relacionadas con la formación de patrones microvasculares, así como los de la evaluación del número de brotes microvascular y la longitud de cada uno de los brotes microvascular (N º SP y Le. SP, respectivamente) se puede determinar. -El contraste óptimo entre las estructuras de los vasos representado negro y el fondo blanco facilita el análisis detallado de las imágenes en la mayoría de los programas comerciales computarizados morfométricos.
4. En la mayoría de los casos, las variables más importantes son VA y MVL, que cuando se multiplica en conjunto generan la longitud total de microvasculares (TMVL).

8. Análisis estadístico

Por lo general, utilizan el estándar no paramétrico de Mann-Whitney U-test para analizar impares (dos colas) observaciones. Un promedio de cuatro ventanas mesentérica por animal se utiliza como punto de datos independientes para cada variable de la ventana mesentérica. El criterio de significación estadística p ≤ 0,05.

Discussion

El ensayo fue presentado en 1986 ³ y sucesivamente ha sido desarrollado y perfeccionado en el laboratorio ^7,10-12. Como se discutió en los documentos de revisión (invitado) ^{1, 2,} el ensayo se compara bien con otros mamíferos en el ensayo de angiogénesis in vivo en lo que se refiere en particular a las características importantes tales como el tejido de la prueba para adultos es de forma nativa vascularizado y carece de la angiogénesis fisiológica, un traumatismo mínimo, en su caso, se infligidos a los tejidos, y las variables cuantitativas se miden realmente, lo que permite el análisis de estadística sólida relación dosis-respuesta y los estudios moleculares de actividad, la angiogénesis brote ocurre, que es predominante en los tejidos normales y tumores, y los datos de toxicidad se acumula fácilmente en las ratas que crecen robustamente fisiológicamente en la edad adulta. Características desfavorables pueden incluir el hecho de que el ensayo es relativamente lento, especialmente cuando se evalúa el número y la longitud de los segmentos individuales de microvasos y los brotes de microvasos, que no permite observaciones real-time/serial, y que no es adecuado para ratones ya que muchas ventanas mesentérica en ratones carecen de microvasos potenciales padres de nuevos capilares que se pueden originar.

Observaciones en tiempo real, sin embargo, posible gracias a la microscopía intravital donde las ventanas mesentérica exteriorizado, pero intacta, son extendidas a lo largo de una platina del microscopio, mientras que el animal esté anestesiado, como se indica en ^1.

Avances significativos en la investigación de la angiogénesis se han logrado en las últimas décadas el uso de modelos como el micropocket la córnea, la membrana corioalantoidea de pollo, y sc ensayos plug Matrigel, que son herramientas útiles, pero limitado en última instancia. Futuras aplicaciones clínicas de terapias anti-angiogénicas y pro-angiogénicos requieren el establecimiento y validación de los más sensibles y relevantes biológicamente, verdaderamente cuantitativa modelos preclínicos, como la descrita en el informe actual.

Materials

Buffers and reagents

0.5 M Tris-HCl (pH 7.8) stock solution Tris (hydroxymethyl) aminomethan (60.57 g) is dissolved in ~900 ml aqua dest and ~45 ml of 25% HCl (concentrated) is added to achieve pH 7.8 followed by dilution to 1 liter with aqua dest.

Tris-buffer saline (TBS; pH 7.8) To 200 ml of the stock solution is added 18 g NaCl dissolved in ~1800 ml aqua dest with adjustment of pH to 7.8 using the stock solution, followed by dilution to 2 liter with aqua dest.

TBS (pH 7.4) To 200 ml of the stock solution is added 18 g NaCl dissolved in dissolved in ~1800 ml aqua dest with adjustment of pH to 7.4 using the stock solution, followed by dilution to 2 liter with aqua dest.

Trypsin solution (0.05% trypsin, 0.1% CaCl2) Contains 0.1 g trypsin and 0.2 g CaCl2 in 200 ml TBS (pH 7.8).

Sucrose solution 2.5% Contains 5 g sucrose in 200 ml TBS (pH 7.8).

Stock solution of 1% Sodium azide in TBS (pH 7.4) Contains 1 g Na-azide in 100 ml with TBS (pH 7.4).

Diluting buffer: 0.1% BSA, 0.01% Na-azide (Used to dilute antibodies in the Vectastain ABC kit). Contains 0.1 g bovine serum albumin (BSA) and 1 ml of 1% Na-azide, diluted to 100 ml with TBS (pH 7.4).

ABC kit Vectastain PK 4002, ABC peroxidase mouse IgG Normal horse serum; blocking serum; yellow solution: 3 drops/10 ml dilution buffer. Biotinylated antibody; anti-mouse IgG; blue solution: 1 drop/10 ml dilution buffer. ABC-reagent: orange solution, 2 drops plus brown solution 2 drops/10 ml TBS (pH 7.4).

Mix these solutions 20 minutes before use!

Mouse (monoclonal) anti-rat endothelium(Biosource International, Camarillo, CA, U.S.A.)

This antibody is directed against all vascular endothelial cells in the rat, with the exception of those in the brain.

Vectastain peroxidase Avidin Biotin Complex (ABC) kit The kit contains primary antibody, biotinylated secondary antibody, avidin-biotinylated enzyme complex (ABC), and enzyme substrate. See www.vectorlabs.com or www.immunkemi.se for protocols.

Bovine serum albumin(BSA) (Sigma-Aldrich, catalog # A-4503). DAB= 3,3’-Diaminobenzidine Isopac (Sigma-Aldrich, catalog # D 9015). Trypsinfrom Bovine Pancreas (Sigma-Aldrich, catalog # T 4665). Vectastain peroxidase ABC-kit, Mouse IgG (Immunkemi F & D AB, Jarfalla, Sweden)