Rat tarmkäx Angiogenes analys

Summary

Normal vuxen vaskulariserad däggdjur som saknar fysiologiska angiogenes och som inte utsatts för kirurgiska ingrepp används för att studera: (i) inledande och utveckling av angiogenes efter intraperitoneal administrering av test-agenter, och (ii) ändring av angiogenes efter systemisk administrering av valda testet agenter.

Abstract

Den vuxna råttor tarmkäx fönster angiogenes analysen är biologiskt lämpligt och är utomordentligt väl lämpad för studier av spirande angiogenes in vivo [se översiktsartiklar], som är den dominerande formen av angiogenes i mänskliga tumörer och icke-tumörvävnad, vilket diskuteras i inbjuden recension papper ^1,2. Angiogenes induceras i membranös mesenteriala delar av intraperitoneal (ip) injektion av en pro-angiogena faktor kan moduleras genom subkutan (sc), intravenöst (iv) eller oralt (PO) behandling med modifierande ämnen val. Varje membranös del av krös är genomskinlig och ramas in av fettvävnad, ger det ett fönster-liknande utseende.

Analysen har följande fördelaktiga egenskaper: (i) testet vävnaden är native vaskulariserad, om än glest, och eftersom det är extremt tunn, är microvessel nätverket nästan tvådimensionella, vilket gör att hela nätverket som ska bedömas mikroskopiskt på plats; ( ii) hos vuxna råttor testet vävnaden saknar betydande fysiologiska angiogenes, som präglar de flesta normala vuxna däggdjursvävnader, graden av infödda vaskularisering är dock korrelerade med ålder, vilket diskuteras i ^1, (iii) försumbar nivå av trauma-inducerad angiogenes garanterar hög känslighet, (iv) analysen replikerar den kliniska situationen, eftersom angiogenes-modulerande testa läkemedel ges systemiskt och svaren observerade speglar nettoeffekten av alla metaboliska, cellulära och molekylära förändringar som induceras av behandlingen, (v) analysen gör bedömningar av objektiva, kvantitativa, objektiva variabler av mikrovaskulära rumslig utsträckning, densitet och nätverk mönster bildas, samt kapillär groning, vilket möjliggör robusta statistiska analyser av dos-effekt och molekylär struktur-aktivitetssamband, samt (vi ) analysen avslöjar med hög känslighet för toxiska eller skadliga effekter av behandlingar i form av lägre frekvens av fysiologiska kroppen viktökning, som vuxna råttor växa stadigt.

Mast-cell-medierad angiogenes för första gången visat med hjälp av denna analys ^3,4. Modellen visar på en hög nivå av diskriminering med avseende dosering och effekt och den uppmätta effekten av systemiskt administrerade kemiskt eller funktionellt närbesläktade droger och proteiner, inklusive: (i) med låg dos, metronomically administreras standard kemoterapeutika som ger olika, drog-specifika effekter (dvs, angiogenes-suppressiv, neutral eller angiogenes-stimulerande aktiviteter ^5), (ii) naturligt järn-omättade mänskligt laktoferrin, som stimulerar VEGF-A-medierad angiogenes ^6, och naturligt järn-omättade nötkreatur laktoferrin, som hämmar VEGF-A- medierad angiogenes ^7, och (iii) med låg molekylvikt heparin fraktioner som produceras av olika medel ^8,9. Dessutom är analysen mycket lämpade för studier av de kombinerade effekterna på angiogenes av läkemedel som är systemiskt i en samtidig eller sekventiell mode.

Tanken att göra den här filmen härstammar från slutet av Dr Juda Folkman när han besökte vårt laboratorium och bevittnade den metodik som demonstreras.

Översiktsartiklar (inbjuden) diskutera och bedöma analysen

Norrby, K. In vivo-modeller av angiogenes. J. Cell. Mol. Med. 10, 588-612 (2006).

Norrby, K. drogtester med angiogenes modeller. Expert Opin. Läkemedel. Upptäckt. 3, 533-549 (2008).

Protocol

1. Djur

1. Små gnagare, som råttor, möss och marsvin, har använts som djurmodeller. Tyvärr vuxna möss (många musstammar har bedömts) tenderar att saknar eller har endast en mycket liten antal potentiella föräldrar mikrokärl (från vilket angiogenes kan härröra) inom deras mesenteriska fönster, vilket gör att studier med möss opålitliga. Därför har analysen utvecklats främst för råttor.
2. Råttorna, som acklimatiserat sig till en standard miljö för minst 7 dagar efter leverans från uppfödaren, vanligen inrymt i par i en vanlig bur under en 12-tim ljus / mörker-cykel med fri tillgång till vatten och pellets. Varje djur är märkt. Vi använder mestadels unga vuxna råttor (vanligtvis 7-10 veckors ålder av olika stammar men oftast manliga Sprague-Dawley råttor, råttor är yngre än 5-6 veckors ålder antalet infödda mikrokärl tenderar att vara lågt) som erhållits från olika uppfödare. Under perioden före försöket och under försöket, djuren vägas varannan dag, och alltid samma dag som offret. När djur behandlas samtidigt IP (för induktion av angiogenes, se nedan) och sc eller iv eller po, de vägde varje dag. Detta möjliggör upprättandet av experiment-och kontrollgrupp av lika kroppsvikt i början av experimentet, och tillåter övervakning av påverkan av behandlingen på kroppen viktökning under försöket. Eftersom vuxna hanråttor växa kraftigt fysiologiskt (vinner ca 40-60 g per vecka beroende på typ av stam) är viktökning retardation en känslig ersätta markör för toxicitet, systemisk välbefinnande, anorexi, och underlåtenhet att frodas.

Vi arbetar i en hög standard djurvård anläggningen och betydande ansträngningar görs för att minimera stress upplevs av djuren. De nuvarande etiska riktlinjer är de som fastställts av Workman P. et al. (Riktlinjer för välfärd och användning av djur inom cancerforskningen. Br. J Cancer 102, 1555-77, 2010). The Animal etiska kommittén för Göteborgs universitet godkänt dessa studier.

2. Pro-angiogena intraperitoneal behandling

1. Kandidaten pro-angiogena faktor som ska testas är upplöst och utspätt i endotoxin-fria saltlösning används för infusion av patienterna (även i extremt låga nivåer, är endotoxin pro-angiogena). Alla lösningar är uppbyggda färsk samma dag som injektion, steril-filtreras (Millipore 0,22-ìm filtrering), kontrolleras för neutralt pH (7,1-7,3), och användas vid rumstemperatur.
   Testet agent injiceras vid låga eller mycket låga koncentrationer. Till exempel, råtta rVEGF ₁₆₄ (564-RV/CF, FoU Systems Europe, Ltd, Oxon, Storbritannien) är, som är den dominerande VEGF-A isoformen hos råttor, spädd till 96 pmole / ml i endotoxin-fri salt, frysta och tinade och en volym på 5 ml injiceras ip i råtta. Vi använder oss av en 5-ml spruta med 0,8 mm nål (grön nål, 21G) för ip injektion. Denna behandling, ges två gånger dagligen i 4,5 dagar, dvs., Från måndag morgon (dag 0) till fredag ​​morgon (Dag 4), inducerar en robust spirande angiogenes svar i mesenteriala testet vävnaden, en topp på omkring dag 21.
   Administrera lösningen IP ser till att hela volymen levereras in i bukhålan (och inte i tarmarna, blåsan eller något annat organ). Den snabba injektion av 5 ml ger taktil bekräftelse av operatören att vätskan jet har passerat genom bukväggen in i bukhålan.
   Efter, före eller samtidigt med IP pro-angiogena behandling kan alla testa ombud för val ges systemiskt.

3. Systemisk Administation av angiogenes-modulerande ombud

1. Varje annan resväg än ip route kan användas, eftersom ip behandlingen kan påverka den pågående angiogena reaktionen genom induktion av inflammation eller möjligen genom att aktivera mastceller i testet vävnad, vilket kan leda till en stark pro-angiogena svar. Förutom oral administrering eller injektion sc eller iv använder vi ofta sc administration med hjälp av osmotiska men framförallt minipumpar (en eller flera, med olika volymer och pumpning gånger) för att leverera en lösning med en konstant hastighet på upp till två eller flera veckor.
2. Kontinuerlig subkutan infusion av test-agenter
   Påfyllning och implantation av osmotiska men framförallt minipumpar
   Vanligtvis på 5 dag, dvs dagen efter utgången av undersökningsperioden VEGF behandling, osmotisk men framförallt minipumpar (t.ex. modell 2ML2, med ständig pumpning hastighet av 5,0 l / h för 14-15 dagar, Alzet Osmotisk Pumpar, Mountain View, CA , USA) fylls under sterila förhållanden med testet agent eller de lämpliga fordonen. Efter lagring i steril 0,9% (w / v) NaCl över natten vid 37 ° C, pumpen (s) är inopererade fm på ryggen (vid sidan av spinal column i regionen av scapulae) hos råttor som har sövda med isofluran gas (Isoba veterinär, Schering-Plough Animal Health, Merck & Co, Inc., Whitehouse Station, NJ, USA), inledningsvis i en lufttät transparent kammare och därefter via en mask (för att minimera den stress som orsakas av följande djur är kammaren spolas med luft innan den återanvänds). Huden snitt för pump implantation sys direkt efter implantation med silkestråd.
   Eftersom djuren upp i vikt fysiologiskt under försöksperioden och testet agenter administreras med en konstant hastighet är den faktiska doseringen ut till prov läkemedel per kg kroppsvikt är högre än den genomsnittliga dosen i början av infusionen perioden och är lägre än genomsnittet dosering vid slutet av infusionsperioden.
   Kontinuerlig infusion, som beskrivs här, kan ses som en utökad form av metronomic behandling.

4. Avsluta Experiment

1. Ett djur i taget placeras i en genomskinlig lufttät kammare, som spolas med CO _2-gas, som snabbt dödar djuret. Kammaren spolas med luft innan de används igen.

5. Skörd vävnadsprover

1. Som framgår av DVD är bukväggen öppnas och de små-gut tarmkäxet identifieras, inklusive de mest distala delen som når ileoanal reservoar-cecal ventilen (korsningen av tunntarmen och tjocktarmen). Fyra (eller flera) av de mest distalt belägen "Windows" är numrerade och sprids på objektiv standard obehandlade SuperFrost Plus-slides (DAKO Danmark A / S, Glostrup, Danmark). Det är viktigt att undvika, om möjligt, förorena prover med blod, tarminnehåll eller andra kroppsvätskor, eftersom dessa material kan vara färgade icke-specifikt, även om detta inte upphäver den påföljande immunhistokemiska visualisering av mikrokärl.
2. Varje mesenteriska fönster exemplar med bifogad liten tarm segment är utspridda på en bild och torkas vid rumstemperatur i 20 minuter. Då är den intestinala stubben avskuren, medan den intakta membranös krös prover förvaras vid -20 ° C under längre perioder. Detta visas i DVD-skivan.

Det bör nämnas att vävnaden och patentet kärlsystemet kan visualiseras före skörd med ljus intravital mikroskopi.

6. Protokoll för immunhistokemisk färgning av mikrokärl

1. Dag 0
   Proverna får tina från -20 ° C till rumstemperatur, torkas i ett skåp vid 60 ° C under 1 timme och förvaras i rumstemperatur över natten.
2. Dag 1
   Placera objektglasen i färgning hållare (i varannan låt) i en färgning burk och tvätta två gånger med TBS (pH 7,8) i 10 minuter vid rumstemperatur. Lösningen är kasseras och ersättas med nästa lösning, och så vidare för alla följande steg.
3. Trypsin behandling
   Fyll färgning burken som kommer hamnen innehavaren färgning bilden med trypsin lösning (25 ° C i 20 minuter). Kassera lösningen och inkubera två gånger med 2,5% sackaroslösning (rumstemperatur i 10 minuter varje gång). Kassera lösningen och skölj ett par gånger i dest (rumstemperatur i ett par minuter vardera).
4. Blockering
   Fyll färgning burken som kommer hamnen innehavaren färgning bilden med 0,5% H ₂ O ₂ i metanol (rumstemperatur i 30 minuter). Kassera lösningen och skölj med dest (rumstemperatur i några minuter). Kassera lösningen och skölj två gånger med TBS (pH 7,4) (rumstemperatur i 8 minuter varje gång).
5. Inkubation
   Alla inkubationer är i en fuktig kammare vid rumstemperatur. Cirka 150 l av varje lösningarna nedan används per bild. Bilderna placeras i en fuktig kammare och lösningarna är pipetteras på de prover (de icke-membranös delar behöver inte omfattas av lösningar).
   För varje följande steg försiktigt skaka av sig all lösning innan den efterföljande lösning har tillsatts.
   1. Inkubation med Normal (blockering) i serum (häst) (ABC-kit) 3 droppar gul lösning / 10 ml spädningsbuffert i 20 minuter.
   2. Inkubation med primär antikropp ARU0181, vilka etiketter råtta vaskulära endotelceller. Antikroppen späds 1:600 ​​med spädningsbuffert (Biosource) (100 l utspätt 40-faldig [frysta] plus 900 l spädningsbuffert) och inkubering sker över natten i 4 ° C.
6. Dag 2
   Bilderna tas bort från fuktad kammaren, är den primära antikroppen kasseras och bilderna är placerade i en färgning diapositivhållaren, som är nedsänkt i färgning burken och sköljas två gånger med TBS(PH 7,8) i 8 minuter.
   1. Inkubation med biotinylerad antikropp (ABC kit)
      Bilderna placeras horisontellt i en fuktig kammare och inkuberas med en droppe blå lösning / 10 ml spädningsbuffert i 30 minuter. Kassera lösningen och placera glasen i en färgning hållare nedsänkt i färgning burken och skölj två gånger med TBS (pH 7,4) i 8 minuter.
   2. Inkubation med ABC-reagens
      Bilderna är åter placeras horisontellt i en fuktig kammare och följande lösningar är pipetteras på membranös delar av prover: 2 droppar orange lösning plus 2 droppar brun lösning / 10 ml TBS (pH 7,4) i 30 minuter. Blanda försiktigt 30 minuter före användning! Kassera lösningen och placera bilderna i diapositivhållaren i färgning burken och skölj två gånger med TBS (pH 7,4) i 8 minuter.
7. Färgning med DAB (0,05%)
   Detta steg måste utföras i ett ventilerat kemisk huva!
   Placera bilderna och lägg till 3,3-Diaminobenzidin (DAB, Sigma-Aldrich) lösningen med en pipett: 0,1% DAB-lösning i TBS (pH 7,4) [frysta] är utspädd 1:1 med en blandning av 10 l H ₂ O ₂ och 7,5 ml TBS (pH 7,4). Denna lösning är steril-filtreras innan användning (för att eliminera alla partiklar som kan dölja den mikroskopiska bilden). Färga exemplar i 8 minuter. Kassera lösningen och placera bilderna i färgning diapositivhållaren nedsänkt i färgning burken. Skölj under rinnande kranvatten och sedan i dest i några minuter.
8. Dehydrering
   Bilderna förvaras i färgning diapositivhållaren. Skölj genom att kasta och påfyllning av färgning burken som innehåller dest / etanol: dest, 70% alkohol, 95% alkohol, absolut alkohol, med 2 minuter i varje lösning.

7. Imaging och utvärdera Microvascular nätverket i varje Mesenteric Fönster Prov Efter immunhistokemisk färgning of Vascular endotelceller

Som visas i filmen, är mikrokärl mikroskopiskt visualiseras på plats i den intakta vävnaden.

1. Först använder vi en ritning mikroskop med förstoring från 14 till 34 (Leica Wild M 3Z) till blyerts på vitt papper hela fönstret området, liksom hela vaskulariserad området (VA) per mesenteriska fönster. VA, i procent av hela området, är lätt att mäta med hjälp av datorsystem eller icke-datoriserat PLANIMETRI (eller helt enkelt genom att skära ut och viktning bilden av hela fönstret, och bilderna av alla dess vaskulariserad delar).
2. Med en annan ritning mikroskop, individuella microvessel profiler, som lätt kan identifieras, dras i svart bläck på vitt papper vid 80 gångers förstoring i slumpmässigt utvalda områden. Detta är utgångspunkten för den följande datoriserade morfometriska bedömning av mikrovaskulära längd (MVL), vilket egentligen är ett mått på mikrovaskulära densitet.
3. Alternativt, variabler relaterade till mikrovaskulära mönster bildas kan liksom de för bedömning av antalet mikrovaskulära groddar och längd av enskilda mikrovaskulära groddar (nr SP och Le. SP, respektive) bestämmas. -Den optimala kontrasten mellan de avbildade svarta fartyget strukturer och den vita bakgrunden underlättar detaljerade analyser av de bilder som i de flesta kommersiella morfometriska datoriserade program.
4. I de flesta fall stora variablerna VA och MVL, som när den multipliceras generera den totala mikrovaskulära längd (TMVL).

8. Statistisk analys

Vi använder vanligtvis standard icke-parametriska Mann-Whitney U-test för att analysera oparade (tvåsidiga) observationer. Ett medelvärde på fyra mesenteriala fönster per djur används som oberoende data-poäng för varje variabel i mesenteriala fönster. Kriteriet för statistisk signifikans är p ≤ 0,05.

Discussion

Analysen infördes 1986 ³ och har successivt vidareutvecklats och förfinats i vårt laboratorium ^7,10-12. Som diskuterades i översiktsartiklar (inbjuden) ^{1, 2,} jämför analysen bra med andra däggdjur in vivo angiogenes test när det gäller särskilt viktiga funktioner som vuxna testa vävnad är native vaskulariserad och saknar fysiologisk angiogenes, minimalt trauma, om någon, är tillfogat vävnaden, verkligen kvantitativa variabler mäts, vilket gör att ljudet statistisk analys av dos-respons-och molekylär-aktivitet studier, groning angiogenes sker, som dominerar i normal vävnad och tumörer, och toxicitetsdata anrikas lätt i råttor som växer kraftigt fysiologiskt i vuxen ålder. Ofördelaktigt funktioner kan omfatta det faktum att analysen är relativt tidskrävande, särskilt vid bedömningen av antal och längd enskilda microvessel segment och microvessel groddar, att den inte tillåter real-time/serial observationer, och att det knappast är lämplig för möss eftersom många mesenteriska fönster hos möss saknar potentiell förälder mikrokärl från vilket den nya kapillärer kan komma.

Real-time observationer är dock, vilket möjliggörs genom intravital mikroskopi där exteriorized men intakt mesenteriska fönster är utspärrade ut över ett mikroskop skede medan djuret bedövas, vilket diskuteras i ^1.

Betydande framsteg inom angiogenes forskning har uppnåtts under de senaste decennierna med modeller som hornhinnan micropocket, chick chorioallantoic membran, och SC Matrigel analyser kontakten, som är användbara men som i slutändan begränsade verktyg. Framtida kliniska tillämpningar av anti-angiogena och pro-angiogena terapier det nödvändigt att upprätta och validering av mer känsliga och biologiskt relevanta, verkligen kvantitativa prekliniska modeller, såsom den som beskrivs i den aktuella rapporten.

Materials

Buffers and reagents

0.5 M Tris-HCl (pH 7.8) stock solution Tris (hydroxymethyl) aminomethan (60.57 g) is dissolved in ~900 ml aqua dest and ~45 ml of 25% HCl (concentrated) is added to achieve pH 7.8 followed by dilution to 1 liter with aqua dest.

Tris-buffer saline (TBS; pH 7.8) To 200 ml of the stock solution is added 18 g NaCl dissolved in ~1800 ml aqua dest with adjustment of pH to 7.8 using the stock solution, followed by dilution to 2 liter with aqua dest.

TBS (pH 7.4) To 200 ml of the stock solution is added 18 g NaCl dissolved in dissolved in ~1800 ml aqua dest with adjustment of pH to 7.4 using the stock solution, followed by dilution to 2 liter with aqua dest.

Trypsin solution (0.05% trypsin, 0.1% CaCl2) Contains 0.1 g trypsin and 0.2 g CaCl2 in 200 ml TBS (pH 7.8).

Sucrose solution 2.5% Contains 5 g sucrose in 200 ml TBS (pH 7.8).

Stock solution of 1% Sodium azide in TBS (pH 7.4) Contains 1 g Na-azide in 100 ml with TBS (pH 7.4).

Diluting buffer: 0.1% BSA, 0.01% Na-azide (Used to dilute antibodies in the Vectastain ABC kit). Contains 0.1 g bovine serum albumin (BSA) and 1 ml of 1% Na-azide, diluted to 100 ml with TBS (pH 7.4).

ABC kit Vectastain PK 4002, ABC peroxidase mouse IgG Normal horse serum; blocking serum; yellow solution: 3 drops/10 ml dilution buffer. Biotinylated antibody; anti-mouse IgG; blue solution: 1 drop/10 ml dilution buffer. ABC-reagent: orange solution, 2 drops plus brown solution 2 drops/10 ml TBS (pH 7.4).

Mix these solutions 20 minutes before use!

Mouse (monoclonal) anti-rat endothelium(Biosource International, Camarillo, CA, U.S.A.)

This antibody is directed against all vascular endothelial cells in the rat, with the exception of those in the brain.

Vectastain peroxidase Avidin Biotin Complex (ABC) kit The kit contains primary antibody, biotinylated secondary antibody, avidin-biotinylated enzyme complex (ABC), and enzyme substrate. See www.vectorlabs.com or www.immunkemi.se for protocols.

Bovine serum albumin(BSA) (Sigma-Aldrich, catalog # A-4503). DAB= 3,3’-Diaminobenzidine Isopac (Sigma-Aldrich, catalog # D 9015). Trypsinfrom Bovine Pancreas (Sigma-Aldrich, catalog # T 4665). Vectastain peroxidase ABC-kit, Mouse IgG (Immunkemi F & D AB, Jarfalla, Sweden)