Summary
生理的な血管新生とそれを欠いている正常な成体血管化哺乳動物の組織を研究するために使用される外科的介入にさらされていません：（i）の開始とテストエージェントの腹腔内投与後の血管新生の開発、との全身投与後の血管新生の（II）修正テストエージェントを選択した。
Abstract
成体ラットの腸間膜のウィンドウの血管新生アッセイは、生物学的に適切であり、非常によく、in vivoで血管新生を萌芽の研究に適している、ヒト腫瘍および非腫瘍組織における血管新生の支配形態である、として招待レビューで議論[総説を参照してください]論文1,2。血管新生促進因子の腹腔内（ip）注射によって膜性腸間膜の部分に誘導される血管新生は、皮下（sc）、静脈内（iv）または経口（PO）の選択の変性剤による処理によって変調することができます。腸間膜の各膜部分は、それをウィンドウのような外観を与え、半透明や脂肪組織に囲まれています。
アッセイは、以下の有利な特徴を持っています：（i）のテストの組織は、まばらとはいえ、ネイティブ血管形成であり、そしてそれは非常に薄いので、微小血管のネットワークは、ネットワーク全体がその場で顕微鏡的に評価することができるようになる、実質的に二次元であり、（ ⅱ）成熟ラットでの試験組織では、ほとんどの正常な成体哺乳動物の組織を特徴づける重要な生理的血 管新生を、欠けている、ネイティブ血管新生の程度は、、しかし、、1で説明した年齢と相関関係である。外傷誘発性の血管新生の（ⅲ）無視できるレベル高感度を確保、血管新生を調節する試験薬を全身投与し、反応はすべての代謝、携帯電話、および処理による分子変化の正味の効果を反映して観察しているとして（IV）アッセイは、臨床状態を複製すること、（v）アッセイは、それによって、用量効果と分子構造活性相関の堅牢な統計分析を可能にするだけでなく、発芽毛細血管のように、微小空間の拡張、密度、およびネットワークのパターン形成の客観的、定量的、公平な変数の評価を可能に、および（vi大人のラットは確実に成長するにつれて）アッセイは、生理学的な体重増加の減少率で、高感度での治療の毒性または有害な影響を明らかにする。
マスト細胞媒介血管新生は、最初にこのアッセイ3,4を用いて実証した。 （i）は、低用量、多様な、薬物特異的な効果をもたらすmetronomically投与標準化学療法：モデルには含め、投与量 - 効果関係と全身投与化学的または機能的に密接に関連する薬物と蛋白質の測定の効果に関する差別の高レベルを示しています（ すなわち 、血管新生抑制、中性または血管新生を刺激する活動5）、（II）阻害VEGF -介した血管新生6を刺激する自然な鉄飽和ヒトラクトフェリン、、そして自然な鉄不飽和ウシラクトフェリン、VEGF -介する血管新生7、及び（iii）様々な手段8,9によって生成された低分子量ヘパリン画分。さらに、このアッセイは非常に同時または順番に全身投与されている薬剤の血管新生に対する複合効果の研究に適しています。
彼は我々の研究室を訪問し、例示されている方法論を目撃したときにこのビデオを作るというアイデアは、故ユダフォークマンに由来する。
レビュー論文は、（招待講演）議論と分析を鑑定
血管新生のin vivoモデルノルビ、K.。 J.セル。モル。メッド。 10、588〜612（2006）。
ノルビ、血管新生モデルとK.薬物検査。専門家Opin。薬。 Discov。 3、533〜549（2008）。
Protocol
1。動物
- このようなラット、マウス、およびモルモットなどの小齧歯類は、動物モデルとして使用されている。残念なことに、成体マウスでは、（多くのマウス系統が評価されている）が不足する傾向があるまたは信頼性の低いマウスを用いた研究を行う彼らの腸間膜窓内電位親血管（血管新生の起源となりうる）、ののみは非常に低い数値を持っている。このため、アッセイは、主にラット用に開発されています。
- ブリーダーからの送達後少なくとも7日間の標準環境に順応しているラットは、通常は水とペレットへの無料アクセス、12時間明/暗サイクル下での標準ケージでペアに収容されています。各動物がマークされます。様々なブリーダーから得られた、私たちは、主に若い成人のラット（生後5-6週より若いラットではネイティブ微小血管の数が低くなる傾向がある、典型的に70から10まで様々な菌株の週齢が、通常雄Sprague - Dawleyラット）を使用します。前の実験と実験を通しての期間では、動物は一日おきに秤量し、常に犠牲の日にされています。動物は同時にIP（血管新生を誘導するために、以下を参照）と皮下または静脈または経口治療をしている場合、それらは毎日秤量する。これは、実験の開始時に同じ体重の実験群と対照群の設置が可能となり、実験の過程で体重ゲインに対する治療の影響のモニタリングが可能になります。成体雄ラットは、（株の種類に応じて週当たり約40〜60 gを得る）生理学的に確実に成長するので、体重増加の遅滞は、毒性、全身幸福、食欲不振、および成長障害の敏感な代替マーカーです。
我々は、高標準の動物管理施設で働くとかなりの努力が、動物が経験するストレスのレベルを最小限に抑えるために作られています。現在の倫理ガイドラインは、ワークマンP. らによって確立されたものです。（がん研究における動物の愛護及び使用に関するガイドライン。 臭素。J.がん102、1555年から1577年、2010）。ヨーテボリ大学の動物倫理委員会は、これらの研究を承認した。
2。血管新生促進腹腔内治療
- テストする候補の血管新生促進因子は、患者の点滴（さらに非常に低レベルで、エンドトキシンが血管新生促進である）のために使用されるエンドトキシンフリーの生理食塩水に溶解し、希釈される。すべてのソリューションは、注射の日、滅菌濾過（ミリポア0.22μmのろ過）に新鮮な構成中性pH（7.1〜7.3）をチェックし、室温で使用されています。
テストエージェントは、低または非常に低い濃度で注入されます。例えば、ラットrVEGF 164（564-RV/CF、R＆Dシステムズヨーロッパ社、オクソン、イギリス）優勢なVEGF -ラットのアイソフォームである、、凍結、エンドトキシンフリーの生理食塩水で96ピコモル/ mlに希釈されそして解凍し、5mlの体積は、ラットへのIP注入されます。我々は腹腔内投与で0.8 mmの針（緑色の針、21G）で5 mlのシリンジを使用してください。 4.5日、 すなわち 1日2回与えられる。、月曜日の朝（0日）から金曜日の朝（4日目）にこの治療法は、、21日目前後をピークに、腸間膜の試験組織で堅牢な萌芽血管新生応答を誘導する。
ソリューションのIPを管理するボリューム全体が腹腔内（としない腸、膀胱や他の臓器への）に配信されることを保証します。 5mlの急速な注入は、液体ジェットが腹腔内に腹壁を通過したことをオペレータによって触覚確認することができます。
以下、前のIP血管新生促進治療にまたは同時に、選択した任意のテストエージェントは、全身的に投与することができます。
3。血管新生調節剤の全身Administation
- IP治療は炎症の誘導を介して、または可能性の強い血管新生促進反応につながることができるテストの組織、の肥満細胞を活性化することによって、継続的な血管新生反応に影響を与える可能性があるので、IPルート以外のルートは、使用することができます。経口投与または単回注射皮下または静脈内に加えて、我々は多くの場合、最大2つまたは数週間のために一定の速度でソリューションを提供するために浸透圧ミニポンプ（1つ以上の、ボリュームを変え、時代をポンピングで）使用して、SCの管理を使用してください。
- テストエージェントの持続皮下注入
浸透圧ミニポンプの充填と注入
Alzet浸透圧ポンプ、マウンテンビュー、カリフォルニア州、通常14から15日間5.0μL/ hの一定の排気速度と5日目、 すなわち、IP VEGFの治療の終了後1日、浸透圧ミニポンプ（例えば、モデル2ML2、上、米国）は、テストエージェントまたは適切な車両との無菌条件下で充填される。 37滅菌0.9％（w / v）のNaClを一晩で貯蔵した後° C、ポンプ（s）は外科（脊椎coluの側の背中に皮下に注入されるイソフルランガスを（Isoba獣医を使用して麻酔されているラットの肩甲骨の地域におけるMn）、気密透明チャンバー内に最初は、シェリングプラウアニマルヘルス、メルク社、ホワイトハウスステーション、ニュージャージー州、米国）とその後、マスクを介して（それが再利用される前に、次の動物に起因するストレスを最小限に抑えるために、チャンバーは、空気でフラッシュされます）。ポンプの注入のために作られた皮膚の切開は、絹糸を使用してすぐに着床後縫合する。
動物は、実験期間中に生理的に体重が増えると、テストエージェントが一定の速度で投与され、体重1kg当たりの試験薬のために選択された実際の用量は、投与期間の開始時の平均投与量よりも高いと低いので注入期間の終了時の平均投与量よりも。
ここで説明するように連続的な注入は、、メトロノームの治療の拡張形式とみなすことができます。
4。実験の終了
- 一度に一匹が急速に動物を殺すCO 2ガスでフラッシュされる透明な気密室に置かれます。チャンバーは、再び使用される前に空気でフラッシュされます。
5。収穫組織サンプル
- DVDに示すように、腹壁が開かれ、小腸腸間膜は、回腸盲腸弁（小腸と大腸の接合部）に達する最も遠位の部分を含めて、識別されます。最も遠位にある"窓"の4つは（またはそれ以上）客観的な基準未処理Superfrostプラス - スライド（DAKOデンマークA / S、グロストラップ、デンマーク）の上に番号が付けられ、広がっています。これは血管のその後の免疫組織化学的可視化を無効にしていないものの、これらの材料は、非特異的に染色されている場合をそれは、血液、腸の内容や他の体液のサンプルを汚染し、可能であれば、避けることが重要です。
- 添付の小腸セグメントと各腸間膜ウィンドウ片をスライド上に広げ、20分間室温で乾燥させる。無傷の膜性腸間膜の標本が長時間-20℃で保存している間にし、腸の切り株は、遮断される。これはDVDに示されています。
それは組織と特許血管が透過光生体顕微鏡を収穫する前に可視化できるという点を考慮する必要があります。
6。血管の免疫組織化学的染色のためのプロトコル
- 0日目
検体を1時間60℃でキャビネットに乾燥し、室温、に-20℃から融解させ、室温で一晩保持されます。 - 日1
染色瓶にスライドホルダーを（秒毎のトラックで）染色でスライドを配置し、室温で10分間TBS（pH7.8）中で2回洗浄。解決策は、次のソリューションで、そしてそのすべては、次のステップのために破棄され、置き換えられます。 - トリプシン処理
トリプシン溶液（25℃20分間）で染色スライドホルダーを抱いているだろう染色瓶を埋める。液を捨て、2.5％ショ糖溶液（各時間10分、室温）で2回インキュベートする。液を捨て、 アクアdestに （数分ごとに、室温）で数回すすぎます。 - ブロッキング
メタノール中のH 2 O 2（30分間、室温）は0.5％の染色スライドホルダーを抱いているだろう染色瓶を埋める。液を捨て、 アクアdestに （数分間、室温）ですすいでください。液を捨て、TBS（pH 7.4）中（各時間8分、室温）で2回すすいでください。 - インキュベーション
すべてのインキュベーションは室温で加湿チャンバーになります。以下のソリューションの各約150μlをスライドごとに使用されています。スライドを湿式チャンバー内に配置され、ソリューションは、標本（非膜部分は、ソリューションでカバーする必要はありません）にピペットでされています。
その後のソリューションが追加される前に、以下のステップのそれぞれについて、慎重にソリューションのすべてを振り落とす。- ノーマル（ブロッキング）血清 （馬）（ABCキット）3 とのインキュベーションでは、 黄色の溶液 / 20分間10 mlの希釈バッファーを廃棄します。
- ラット血管内皮細胞を標識する一次抗体 ARU0181、 とのインキュベーション 。抗体希釈バッファー（バイオソース）（100μlの希釈は40倍[冷凍]に加えて900μlの希釈バッファー）で1:600に希釈し、インキュベーションを4℃で一晩行わ℃をされ
- 日2
スライドを湿式チャンバーから除去され、一次抗体は破棄され、スライドが染色瓶に浸漬し、TBSで2回リンスされる染色スライドホルダーに配置されます8分間（pH7.8）中。- ビオチン化抗体とのインキュベーション （ABCキット）
スライドを加湿チャンバー内に水平に配置され、 青色の溶液 / 30分間10 mlの希釈緩衝液の1滴でインキュベートする。液を捨て、染色瓶に浸漬染色スライドホルダーにスライドを置き、8分間TBS（pH7.4）で二回リンス。 - ABC試薬とのインキュベーション
スライドは再び加湿チャンバー内に水平に配置され、以下の溶液は、試料の膜の部分にピペットでされています： オレンジ色の溶液を2滴加えて30分間茶色の溶液 / 10ミリリットルTBS（pH 7.4）に2滴。 30分使用する前に慎重にミックス！液を捨て、染色瓶にスライドホルダーにスライドを置き、8分間TBS（pH7.4）で二回リンス。
- ビオチン化抗体とのインキュベーション （ABCキット）
- DABで染色し（0.05％）
このステップは、換気、化学フードで実行する必要があります！
スライドを配置し、3,3 -ジアミノベンジジン（DAB; Sigma - Aldrich）を追加するピペットを使用してソリューション：TBSの0.1％DAB溶液（pH 7.4）[冷凍]10μlのH 2 Oの混合液で1:1に希釈され2と7.5ミリリットルTBS（pH 7.4）に。このソリューションは、（顕微鏡写真を不明瞭にする可能性のある粒子を除去するために）使用直前に滅菌ろ過されています。 8分の試料を染色する。液を捨て、染色瓶に浸漬染色スライドホルダーにスライドを配置する。数分間水道水を流して下にしてから、 アクアdestにすすいでください。 - 脱水
スライドは染色のスライドホルダーに保持されます。捨てることで、すすぎ、 水をdest /エタノールを入れた染色瓶補充：各溶液中で2分で、 アクアdestに 、70％アルコール、95％アルコール、無水アルコールを。
7。イメージングと血管内皮細胞の免疫組織化学的染色後の各腸間膜窓標本で微小血管ネットワークの評価
として映画に示すように、微小血管を顕微鏡無傷の組織でin situで可視化されています。
- 最初に、我々は腸間膜ウィンドウごとに（VA）ホワイトペーパーに鉛筆を14から34（ライカワイルドM 3Z）に倍率の範囲をウィンドウ全体の領域だけでなく、全体の血管領域を描画顕微鏡を使用してください。 VAは、全体の面積の割合として、簡単にコンピュータまたは非コンピュータ化された面積測定（または単に切り出すことにより、重みウィンドウ全体の画像、およびそのすべての血管部分の画像）を用いて測定される。
- 別の図面の顕微鏡を使用して、容易に識別される個々の微小血管のプロファイルは、ランダムに選択されたフィールド内の80倍で、白い紙に黒インクで描かれています。これは基本的には微小血管密度の測定である微小長さの、その後のコンピュータ化された形態学的評価（MVL）、のための出発点です。
- オプションで、微小パターン形成に関連する変数だけでなく、 微小血管芽と個々の微小血管芽 （それぞれ第SPとル。SP、） の長さの数を評価するためのものを求めることができる。 - 描かれた黒い容器の構造間の最適なコントラストと白の背景には、ほとんどの市販の形態計測、コンピューターのプログラムで画像の詳細な分析を容易にします。
- ほとんどの場合、主要な変数は、 全体の微小血管の長さ （TMVL）を生成掛け合わVAとMVL、です。
8。統計的分析
我々は通常、不対（両側）の観測を分析する標準的なノンパラメトリックMann - WhitneyのU検定を使用してください。動物ごとに4つの腸間膜の窓の平均値は、腸間膜ウィンドウの各変数の独立したデータポイントとして使用されます。統計的有意性の基準は、P≤0.05である。
Discussion
アッセイは、1986年3で導入され、連続してさらに発展し、我々の研究室7,10-12で洗練されています。としてレビュー論文（招待講演）1、2で説明したように、アッセイは、特に成人の試験組織として重要な機能に関してin vivo での血管新生アッセイでは他の哺乳類とよく比較してネイティブに血管化であり、生理的血 管新生を欠いている、最小限の外傷、もしあれば、です。真に定量的な変数が測定され、用量反応および分子活性研究に関する健全な統計的分析を可能にする;組織には強制正常組織と腫瘍で優位なされている、発芽血管新生は、発生、および毒性のデータが簡単に確実に成長ラットに蓄積されています生理的に成人インチそれはマウスのほとんどに適していることと、それはreal-time/serial観察を許可していないこと、不利な特徴は、個々の微小血管のセグメントと微小血管芽の数と長さを評価する場合は特にアッセイは、比較的時間がかかるという事実が含まれる場合がありますマウスでは多くの腸間膜のウィンドウが新たな毛細血管の起源となりうる潜在的な親の微小血管を欠いているので。
リアルタイム観測が、しかし、動物は麻酔のときに体外が無傷の腸間膜の窓が、1で述べたように、顕微鏡のステージ上からスプレイされている生体顕微鏡で有効になっています。
血管新生研究の著しい進歩は有用ですが、最終的に限られたツールであるような角膜micropocket、ニワトリ漿尿膜、およびSCマトリゲルプラグアッセイのようなモデルを用いて過去数十年間で達成されている。抗血管新生と血管新生促進療法の今後の臨床応用は、現在のレポートで説明したように、より敏感と生物学的に関連した、真に定量的な前臨床モデルの確立と検証を必要とする。
Disclosures
利害の衝突は宣言されません。
Acknowledgments
ほとんどの研究のための財政支援は、スウェーデンの医学研究評議会（助成金5942）によって提供されていました。
Materials
| Buffers and reagents | |||
| 0.5 M Tris-HCl (pH 7.8) stock solution Tris (hydroxymethyl) aminomethan (60.57 g) is dissolved in ~900 ml aqua dest and ~45 ml of 25% HCl (concentrated) is added to achieve pH 7.8 followed by dilution to 1 liter with aqua dest. |
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| Tris-buffer saline (TBS; pH 7.8) To 200 ml of the stock solution is added 18 g NaCl dissolved in ~1800 ml aqua dest with adjustment of pH to 7.8 using the stock solution, followed by dilution to 2 liter with aqua dest. |
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| TBS (pH 7.4) To 200 ml of the stock solution is added 18 g NaCl dissolved in dissolved in ~1800 ml aqua dest with adjustment of pH to 7.4 using the stock solution, followed by dilution to 2 liter with aqua dest. |
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| Trypsin solution (0.05% trypsin, 0.1% CaCl2) Contains 0.1 g trypsin and 0.2 g CaCl2 in 200 ml TBS (pH 7.8). |
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| Sucrose solution 2.5% Contains 5 g sucrose in 200 ml TBS (pH 7.8). |
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| Stock solution of 1% Sodium azide in TBS (pH 7.4) Contains 1 g Na-azide in 100 ml with TBS (pH 7.4). |
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| Diluting buffer: 0.1% BSA, 0.01% Na-azide (Used to dilute antibodies in the Vectastain ABC kit). Contains 0.1 g bovine serum albumin (BSA) and 1 ml of 1% Na-azide, diluted to 100 ml with TBS (pH 7.4). |
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| ABC kit Vectastain PK 4002, ABC peroxidase mouse IgG Normal horse serum; blocking serum; yellow solution: 3 drops/10 ml dilution buffer. Biotinylated antibody; anti-mouse IgG; blue solution: 1 drop/10 ml dilution buffer. ABC-reagent: orange solution, 2 drops plus brown solution 2 drops/10 ml TBS (pH 7.4). |
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| Mix these solutions 20 minutes before use! | |||
| Mouse (monoclonal) anti-rat endothelium(Biosource International, Camarillo, CA, U.S.A.) | |||
| This antibody is directed against all vascular endothelial cells in the rat, with the exception of those in the brain. | |||
| Vectastain peroxidase Avidin Biotin Complex (ABC) kit The kit contains primary antibody, biotinylated secondary antibody, avidin-biotinylated enzyme complex (ABC), and enzyme substrate. See www.vectorlabs.com or www.immunkemi.se for protocols. |
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| Bovine serum albumin(BSA) (Sigma-Aldrich, catalog # A-4503). DAB= 3,3’-Diaminobenzidine Isopac (Sigma-Aldrich, catalog # D 9015). Trypsinfrom Bovine Pancreas (Sigma-Aldrich, catalog # T 4665). Vectastain peroxidase ABC-kit, Mouse IgG (Immunkemi F & D AB, Jarfalla, Sweden) |
References
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