Summary
다목적 플라즈마 리소그래피 기술은 휴대폰 첨부 파일을 안내에 대한 안정된 표면 패턴을 생성하기 위해 개발되었습니다. 이 기술은 천연 조직을 모방하고 몇 가지, 서로 다른 세포 유형을 공부에 사용되었음을 포함 셀 네트워크를 만들어 적용할 수 있습니다.
Abstract
마이크로 및 nanoscale 해상도 휴대 microenvironment의 체계적 처리는 종종 다양한 세포 및 분자 현상을 해독 필요합니다. 이러한 요구 사항을 해결하기 위해, 우리는 100 nm의에서 mm에 이르기까지 기능 크기와 패턴 표면을 생성하여 세포 microenvironment를 조작하기 위해 플라즈마 리소그래피 기술을 개발했습니다. 이 기법의 목적은 통제 방법으로, 유학 수 있도록이며, 개별 세포의 행동뿐만 아니라 세포들의 상호 작용 그룹.
이 플라즈마 리소그래피 방법은 물리적인 곰팡이와 저온 플라즈마의 연락처를 차폐에 의해 기판에 표면 화학의 선택 변경에 따라 달라집니다. 이 선택적 차폐는 세포 부착과 운동을 안내 수있는 화학 패턴을 떠납니다. 이 패턴, 또는 표면 템플릿은 다음 구조 자연 속에서 발견을 모방하고 실험 조사를위한 제어 환경을 생산 할 수 세포의 네트워크를 만드는 데 사용할 수 있습니다. 그것이 biocompatible 방식으로 투명 고분자 기판에 안정된 표면 패턴을 생산 등 기술을 잘 생물 학적 현상을 연구하기 위해 적합합니다. 개월까지 주 동안 마지막으로 표면 패턴 따라서 이러한 차별과 adaption과 같은 장기적인 세포 프로세스의 연구를 용이하게 오랜 시간 동안 세포와 상호 작용을 안내하실 수 있습니다. 표면에 수정 자연 주로 화학되고 따라서 결과의 해석에 대한 지형 또는 물리적 간섭을 소개하지 않습니다. 그것은 또한 patterning을 달성하기 위해 어떠한 가혹하거나 독성 물질을 포함하고 조직 문화의 호환되지 않습니다. 또한, 그것은 이상적입니다 널리 생물 학적 응용에 사용되는 그들의 속성을 조정할 수있는 능력으로 인해 고분자 기판의 다양한 유형을 수정하기 위해 적용할 수 있습니다. 이러한 마이 그 레이션, 접착, 또는 구속력과 같은 특정 프로세스 격리가 multicell 수준으로 단일에서 이산, 명확한 관측을 허용으로 달성 해상도도 유용합니다.
이 방법은 마이 그 레이션, 신호, 조직 형성, 그리고 행동과 뉴런의 상호 작용은 네트워크에서 기소 인부 절차를 밟게 관련된 조사에 대해 다른 세포 유형의 다양한 네트워크를 형성하기 위해 채용되었습니다.
Protocol
1. patterning에 사용되는 금형 만들기
- 패턴 개념 설계. 패턴, 제어 세포 접촉을 셀 네트워크를 형성 세포를 분리, 천연 구조를 모방하거나, 그렇지 않으면 세포 접착 및 배치를 안내하는 역할을 만들어집니다.
- 컴퓨터 지원 패턴과 photomask 창조의 디자인이나 CAD 기반으로 작성. 원하는 패턴 등의 AutoCAD와 같은 CAD 소프트웨어의 설계, 다음 photomask 제작을위한 외부 업체로 전송됩니다.
- 마스터 패턴을 생산 석판술. 유리 슬라이드는 두 저항 얇은 긍정적 또는 생성되는 구조의 크기에 따라 저항 두꺼운 부정과 패턴입니다. 유리 슬라이드는 실리콘 웨이퍼보다 강한 저렴한 비용, 존재와 깨진 경우 많은 먼지를 생산하지 자신의 이익을 위해 사용됩니다. 또는 이러한 회절 통같이 등의 편리한 구조는 마스터 패턴으로 사용할 수 있습니다.
- 패턴 슬라이드는 패턴되지 않은 슬라이드 스택에 첨부되어 있습니다. 모든 단계가 먼지를 최소화하기 위해 깨끗한 흐름 후드 안에서 수행됩니다.
- 마스터 금형의 창조. 슬라이드의 스택보다 약간 큰 석박의 컨테이너는 다음 초기 금형을 만들 수 photolithographically 패턴 표면에 부어 Polydimethylsiloxane의 30g (PDMS)을 위해 만든 것입니다. PDMS는 degassed 하나는 이틀 동안 치료 허용됩니다.
- 일단 치유 PDMS는 마스터 패턴에서 벗겨 놓고 다음 단계에 대한 금형을 형성하고있다.
- 이 부분 에폭시 (Devcon # 14310 (6g) 6 G는 1 분 혼합 후 degassed, 마스터 금형에 부어 및 치료 수있었습니다. 에폭시는 사이클을 깨고 많은 거품을 사용하여 (<8 분) 신속하게 이루어져야합니다 Degassing입니다 그리고 전에 단지 얇은 레이어를 사용하여 에폭시 세트 및 거품 제거는 거품을 제거하는 것은 불가능하게됩니다. 사용된 6g 빨리 거품 제거를 용이하게 얇은 레이어를 생산하고 있습니다.
- 일시간 후, 2 부분은 에폭시가 부분적으로 치유되며 더 많은 에폭시는 나중 단계에서 처리하는 easer있는 두꺼운 구조를 생성하는 degassing하지 않고 상단에 추가할 수 있습니다. 에폭시는 다음 하나는 이틀 동안 치료 허용됩니다.
- 일단 치료, 에폭시는 PDMS 마스터 몰드에서 제거하고 테이프는 컨테이너를 형성하기 위해 에폭시 금형을 감싸 수 있습니다. 작업 금형은 다음 에폭시 금형에 PDMS를 따르고 PDMS를 degassing, 하나는 이틀 동안 경화에 의해 생성됩니다.
- 일단 치료, 작업 금형은 에폭시에게서 벗겨과 청결을 유지하기 위해 저장됩니다.
2. 휴대지도를위한 금형과 표면의 Patterning
- 작업 금형의 작은 부분은 잘라 및 폴리스티렌 페트리 접시에 게재됩니다. 이러한 금형 섹션의 위치는 표시됩니다.
- 삼각대는 작은 섹션 및 작업 금형 및 배양 접시의 표면 사이의 등각 접촉을 보장하기 위해 가중치에서 형성됩니다. 좋은 위치는 요리의 하단에 보면 볼 수 있습니다.
- 조립은 플라즈마 챔버에 배치됩니다. 플라즈마 처리는 공기 플라즈마를 사용하여 10 분 동안 29.6 W (최대 전력) 150 파에서 시작하여 계속합니다.
- 플라즈마 처리 후, 금형 및 체중 합의가 제거됩니다.
- 페트리 접시는 biosafety 캐비닛 내부 살균 10 분 동안 자외선 아래에 배치하고 세포와 씨앗을 품고있을 때까지 저장됩니다.
3. 전지 표면을 심는
- SH - SY5Y CRL - 2266 인간 Neuroblastoma 또는 다른 세포는 세포 유형에 대한 표준 프로토콜을 사용하여 양식하고 있습니다.
- SH - SY5Y의 합류는 CRL - 2266 인간 Neuroblastoma 세포는 패턴 표면에 시딩 전에 시각적으로 측정됩니다.
- 표준 셀 분할들은 배양 접시의 표면에서 세포를 제거하는 수행됩니다.
- 세포 한 번 무료로 떠있는, 패턴의 표면에 배치되면 원하는 합류를 달성하기위한 희석 후 패턴 배양 접시의 표면에 씨앗을 품고있다.
- 세포가 정착하고 표면에 첨부할 수 있습니다.
- 세포가 플라즈마에 의해 생성된 패턴에 조립하면서 패턴 페트리 접시는 며칠 몇 시간 동안 incubated입니다.
- culturing neuroblastoma 세포, retinoic 산성 (10 μm의)은 신경 세포와 같은 상태로 차별화하는 세포를 유도하기 위해 매일 추가하는 경우. retinoic 산의 추가는 어둠 속에서 이루어집니다.
- Retinoic의 산성은 차별을 관찰할 수있는 후 몇 일 동안 매일 추가됩니다.
- 미디어는 모든 3-4일 대체됩니다.
4. 관측 및 분석
- 라이브 세포 또는 동영상의 정기적인 이미지는 시간이 지남에 따라 세포의 행동을 관찰하기 위해 이동하고 있습니다. 라이브 영상은 전지 ° C, 100 % 습도, 그리고 5% CO 2 37 세포를 유지하는 현미경 단계에 최고 인큐베이터에 배치됩니다. 세포는 형광 하에서 관찰에 대한 고정 및 스테인드 수 있습니다
5. 대표 결과 :
플라즈마 리소그래피 기술을 구현 전형적인 결과는 어떤 임의의 또는 자연 구조과 유사한 세포의 패턴 형성됩니다. 이것은 뉴런의 라인 및 네트워크가 생성되었습니다 그림 1A - B에서 볼 수 있습니다. 뿐만 아니라 인간 제대 정맥 내피 세포 (HUVEC)와 그리드를 형성 C2C12 골격근 세포를 보여줍니다 그림 1C - D에서 볼 수와 같은 다른 세포 유형에 사용할 수 있습니다. 이러한 폴리 - L - 라이신과 같은 자료는 특정 세포 유형 및 기타 용도로 첨부 파일을 촉진하기 위하여, 그림 1E을 패턴 수 있습니다. 표시된 뉴런의 경우, 어떤 만들어진 것은 그들 사이의 연결을 세포의 네트워크입니다. 이것은 뉴런은 뇌의 작동에 영향을 미친다 이웃 세포 사이에 개별 연결을 가진 두뇌에 자연스럽게 발생하는 어떤 복제합니다. 실험실에서 이러한 구조의 창출과 함께, 숫자, 위치, 주파수 및 연결의 다른 요소가 체계적으로 제어할 수 있습니다. 이 arraignments의 결과는 시각적으로 측정할 수와 같은 화학 물질이나 전기 자극을 같은 추가 입력은 네트워크 동작을 탐사하기 위해 구현할 수 있습니다.
부정적인 결과가 자란 또는 불완전한 패턴이나 오염 샘플 것입니다. 불완전하거나 자란 패턴은 세포의 이상적인 금액으로 패턴을 공급 않았 중 너무 적거나 너무 많은 세포와 기판을 심는로 인한 것입니다. 패턴이 올바르게 설계되지 않은 경우 또한, (예를 들어, 라인도 좁은) 세포가 부착하고 성공적으로 성장 수 없습니다. 플라즈마 patterning 또한 기판 sterilizes 사실로 인해 적절한 세포 배양 프로토콜을 다음과 같은 경우이 드문하지만 오염 샘플의 경우, 적절한 청결이 단계 중 하나에서 유지되지 않았을 것입니다.
그림 1. 세포와 단백질의 Patterning.
Discussion
여기에 제시 세포 조사 방법뿐만 아니라 생물 학적 구조를 모방 다세포 네트워크의 복잡한 패턴의 작성은 다음 그룹화 세포의 행동과 환경 요인 단세포 응답 모두 조사를 용이하게 자연에 subcellular 아르 자극을 생산하는 방법을 제공합니다 수 있습니다. 그것이 신속하게 세포 배양과 같은 실험실에서 저렴한 비용으로 장비를 수행할 수 있듯이이 방법의 사용은 심플하면서도 강력한입니다. 그것은 또한 강력하게 세포를 구분하는 결과 행동을 쉽게 관찰이 가능하고 장기 세포 행동의 조사를 허용 오랜 기간에 대한 안정적인 자연입니다. 그것은 또한 그것은 많은 세포 유형과 호환되며 임의의 패턴을 만들 수로 수행하는 실험의 다양한 범위 수 있습니다. 기술의 장기 안정성은 플라즈마에 의해 이수 표면 작용화는 표면의 한 부분이며, 제거하거나 타락한 수있는 코팅이나 다른 레이어가 아닌 것으로 간주하고있다는 사실에서 유래. 액체 아래에 보관하는 경우, 수정이 유형의 몇 달 동안 자사의 휴대지도 능력을 유지할 수 있습니다.
의미있는 결과를 보장하기 위해 필요한 실험의 가장 중요한 부분은 궁극적으로 휴대지도에 사용되는 마스터 패턴을 만드는 것입니다. 이 패턴이 제대로 설계되지 않은 경우, 세포가 적절하게 패턴에 응답하지 않으며 유용한 행동을 생산하지 않을 수 있습니다. 같은 라인 폭, 패턴 간격, 그리고 다른 사람과 같은 매개 변수는 크게 특정 패턴으로 전지 호환성에 영향을 미칠 수 있으며, 일반적으로 이러한 매개 변수의 범위는 가장 적합한 디자인 화면으로 초기 photomask를 만들 수 있습니다.
patterning 수행에 관련된 다른 중요한 파라미터는 금형 제작, 먼지없는 환경을 유지, 세포 시딩 및 세포 배양의 일반적인 불임을 포함합니다. 몰드 생성은 PDMS는 에폭시 금형을 주조 반복 수 있도록 수행하는 다양한 전송 단계에 의해 영향을 수 있습니다. 반복 주조에 따라 소형, 높은 비율 구조와 곰팡이에 저항으로이 같은 방식으로 저하되지 않습니다 때문에 에폭시 몰드가 생성됩니다. 전송 성형이 제대로되면 크기와 생산량은 아무런 영향을받지 않습니다하지만 저조한 degassing, 불완전 치료하거나, 지나친 난방으로 같은 잘못 한 경우, 패턴의 거품, 거칠기 및 변형은 최종 결과에 영향을 미치는 어떤 발생할 수 있습니다. 어떤 먼지가 작동 PDMS 몰드와 표면 때문에 적절한 차폐 플라즈마 화학 patterning 사이의 적절한 연락처와 방해할 수로 먼지가없는 환경을 유지하기 위해 관계에서 금형이 가능한 깨끗한로 보관해야합니다. 세포의 시딩 밀도 역시도 너무 적거나 너무 많은 세포 패턴 영역을 서식 있도록 최적화해야하며 불임는 사용되는 세포의 세균 및 기타 오염을 피하기 위해 유지되어야합니다.
기술은 또한 microfluidics, microelectrodes, 그리고 기계 프로브와 같은 다른 요소로 포함될 수 있습니다. 이것은이 조합의 영향을 연구에 중점을두고 더 나은 실험 및 미래의 일을하는 동안 다양한 생리 조건을 복제하기 위해 세포에 추가 자극을 제공합니다
Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasma Cleaner And Vacuum Chamber | Harrick Scientific Products, Inc. | PDC-001 | |
| Inverted fluorescence and phase contrast microscope | Nikon Instruments | TE2000-U | |
| Microscope stage top incubator | AmScope | Model TCS-100 | Modified to include an enclosure that supplies an appropriate atmosphere |
| Polystyrene Petri dish | VWR international | 25384-090 | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Epoxy | Devcon Inc. | 2 ton clear epoxy #14310 | |
| Cell culture media | Various | Media follows standard formulations for cell type | |
| Retinoic acid | Sigma-Aldrich | R2625 |
References
- Junkin, M., Watson, J., Vande Geest, J. P., Wong, P. K. Template-Guided Self-Assembly of Colloidal Quantum Dots Using Plasma Lithography. Adv Mater. 21, 1247-1251 (2009).
- Junkin, M., Wong, P. K. Probing cell migration in confined environments by plasma lithography. Biomaterials. 32, 1848-1855 (2011).
- Keyes, J., Junkin, M., Cappello, J., Wu, X., Wong, P. K.
- Langowski, B. A., Uhrich, K. E.
- Tourovskaia, A., Barber, T., Wickes, B. T., Hirdes, D., Grin, B., Castner, D. G. Micropatterns of Chemisorbed Cell Adhesion-Repellent Films Using Oxygen Plasma Etching and Elastomeric Masks. Langmuir. 19, 4754-4764 (2003).
- Chen, C. S., Mrksich, M., Huang, S., Whitesides, G. M., Ingber, D. E. Geometric Control of Cell Life and Death. Science. 276, 1425-1428 (1997).
- Johansson, B. -L., Larsson, A., Ocklind, A., Ohrlund, A. Characterization of Air Plasma-Treated Polymer Surfaces by ESCA and Contact Angle Measurements for Optimization of Surface Stability and Cell Growth. Journal of Applied Polymer Science. 86, 26185-26185 (2002).
- Murakami, T., Kuroda, S. -i, Osawa, Z. Dynamics of Polymeric Solid Surfaces Treated with Oxygen Plasma: Effect of Aging Media after Plasma Treatment. Journal of Colloid and Interface Science. 202, 37-44 (1998).
- Strobel, M., Lyons, C. S., Mittal, K. L. Plasma surface modification of polymers: Relevance to adhesion. , VSP. Utrecht, Netherlands. (1994).
- Xia, Y., Whitesides, G. M.
- Song, M., Uhrich, K. R. Optimal Micropattern Dimensions Enhance Neurite Outgrowth Rates, Lengths, and Orientations. Annals of Biomedical Engineering. 35, 1812-1820 (2007).
- Zhao, F., Wu, T., Lau, A., Jiang, T., Huang, Z., Wang, X. -J. Nrf2 promotes neuronal cell differentiation. Free Radical Biology and Medicine. 47, 867-879 (2009).
- Ohl, A., Schroder, K. Plasma-induced chemical micropatterning for cell culturing applications: a brief review. Surface and Coatings Technology. 116-119, 820-830 (1999).
- van Kooten, T. G., Spijker, H. T., Busscher, H. J. Plasma-treated polystyrene surfaces: model surfaces for studying cell-biomaterial interactions. Biomaterials. 25, 1735-1747 (2004).
- Loesberg, W. A., te Riet, J., van Delft, F., Schön, P., Figdor, C. G., Speller, S. The threshold at which substrate nanogroove dimensions may influence fibroblast alignment and adhesion. Biomaterials. 28, 3944-3951 (2007).
