Summary
Универсальный метод литографии плазмы был разработан для создания стабильной модели поверхности для направления сотовой привязанности. Этот метод может быть применен для создания сотовых сетей, включая те, которые имитируют натуральных тканей и была использована для изучения нескольких, различных типов клеток.
Abstract
Систематическое манипуляции ячейки микроокружения с микро-и наноразмерных разрешение часто требуется для расшифровки различных клеточных и молекулярных явлений. Чтобы удовлетворить это требование, мы разработали технику литографии плазмы манипулировать сотовой микроокружения путем создания узорчатой поверхности с функцией размером от 100 нм до миллиметров. Целью этого метода является, чтобы иметь возможность учиться, контролируемым образом, поведение отдельных клеток, а также группы клеток и их взаимодействие.
Этот метод плазменной литографии основана на селективной модификации химии поверхности на подложку с помощью защитного контакта низкотемпературной плазмы с физической формы. Это селективная защита листьев химической картины, которые могут направлять вложений клеток и движения. Эта модель, или поверхность шаблона, затем может быть использован для создания сетей клеток, структура которых может имитировать, что встречается в природе и производит управляемой среды для экспериментальных исследований. Метод хорошо подходит для изучения биологического явления, как она производит устойчивые закономерности поверхности на прозрачных полимерных подложек в биосовместимых образом. Образцы поверхности длиться несколько недель или месяцев и, таким образом руководство взаимодействия с клетками в течение длительного периода времени, что облегчает изучение долгосрочных клеточные процессы, такие как дифференциация и адаптации. Модификация поверхности в основном химического вещества в природе и, следовательно, не вносит топографических или физического вмешательства для интерпретации результатов. Он также не содержит никаких жестких или ядовитых веществ для достижения структурирование и совместим для тканевой культуры. Кроме того, он может быть применен для изменения различных типов полимерных подложках, которые из-за возможность настройки их свойств и идеально подходит для широко используется в биологических приложений. Разрешение достижимо также полезно, как изоляция конкретных процессов, таких как миграция, адгезия, или привязка позволяет для дискретных, ясные наблюдения на одном уровне с многоклеточные.
Этот метод был использован для формирования разнообразных сетей различных типов клеток для исследований, проведенных с миграцией, сигнализации, ткани образования, а также поведение и взаимодействие нейронов предъявлено обвинение в сети.
Protocol
1. Создание формы используются для структурирования
- Концептуальное проектирование моделей. Модели создаются, которые служат для формирования сотовых сетей, контролирующих клеточное контакт, изолировать клетки, имитирующие природные структуры, или иным образом руководство клеточной адгезии и расстановки кадров.
- Системы автоматизированного проектирования CAD или основанные создание шаблона и создание фотошаблонов. Желаемую модель выполнена в САПР, таких как AutoCAD, и затем отправляется за пределы компании по производству фотошаблонов.
- Фотолитографии для создания мастер узор. Стекло слайды по образцу или с тонкими положительными сопротивляться или толстой отрицательное сопротивление в зависимости от размера структуры создаются. Стекло слайдов, используемых для их преимущества быть низкой стоимости, сильнее, чем кремниевые пластины, а не производить столько пыли, когда нарушена. Кроме того, другим удобным структур, таких как дифракционные решетки могут быть использованы как мастер модель.
- Слайд узорной прилагается к стопку слайдов, которые не были узорные. Все действия выполняются внутри чистым капотом потоком для минимизации пыли.
- Создание мастер форм. Контейнер фольгу чуть больше, чем стопку слайдов создается провести 30 г полидиметилсилоксана (PDMS), который затем облили photolithographically узорной поверхности для создания начальной формы. PDMS дегазируют и отверждение в течение одного-двух дней.
- После отверждения PDMS является снимают мастера узора и формы формы для следующего шага.
- 6 г 2 части эпоксидной (Devcon # 14310 (6 г) смешивают в течение 1 минуты, а затем выливают в мастер формы, дегазации и позволили, чтобы вылечить. Дегазация эпоксидной должно быть сделано быстро (<8 мин) с использованием многих пузыря нарушение циклов и используя только тонкий слой, прежде чем она эпоксидной множеств и пузыря удаление становится невозможным, чтобы удалить пузырьки. 6 г использованы производит тонкий слой, который облегчает быстрое удаление пузыря.
- Через час, 2 части эпоксидной будет частично вылечить и более эпоксидной могут быть добавлены на вершине без дегазации производить толще структура, которая проще для ручки в последующих действиях. Эпоксидной затем дают лекарство от одного до двух дней.
- После отверждения эпоксидных удаляется из формы мастера PDMS и лентой оборачивается вокруг эпоксидной формы для формирования контейнера. Рабочая форма будет создано путем заливки PDMS на эпоксидной плесени, дегазации PDMS, и лечения в течение одного-двух дней.
- После отверждения, рабочие пресс-формы снимают из эпоксидной смолы и хранится для поддержания чистоты.
2. Структурирование поверхности пресс-форм для ячейки руководством
- Малый слоев рабочего формы вырезаются и помещали на чашки Петри полистирола. Расположение этих форм разделы помечены.
- Штатив формируется из небольших участков и взвешенные обеспечения конформных контакта между рабочим формы и поверхности чашки Петри. Хорошо размещения можно наблюдать, глядя на дно тарелки.
- Сборка помещается в камере плазмы. Плазменная обработка инициируется и продолжали при 150 Па при 29,6 Вт (макс. мощность) в течение 10 минут с использованием воздуха плазмы.
- После обработки плазмы, формы и веса обвинения снимаются.
- Чашки Петри помещают под ультрафиолетовым светом в течение 10 минут стерилизации внутри шкафа биобезопасности и хранятся там до засеяно клетками.
3. Посев поверхности с ячейками
- SH-SY5Y CRL-2266 нейробластомы человека или иные клетки культивируют с использованием стандартных протоколов для типа клеток.
- Слиянии SH-SY5Y CRL-2266 Человеческие клетки нейробластомы оценить визуально перед посевом на поверхность узорные.
- Стандартное разделение ячейки осуществляется для отделения клеток от поверхности их чашке Петри.
- Клетки, как только свободное плавание, высевают на поверхность блюдо узорной Петри после того, разбавляют до достижения желаемого слияния при размещении на поверхности узорные.
- Ячейки могут поселиться и приложить к поверхности.
- Блюдо узорной Петри инкубировали в течение нескольких часов до нескольких дней, пока клетки собираются на образец создан плазмы.
- При культивировании клеток нейробластомы, ретиноевая кислота (10 мкМ) добавляется ежедневно для того, чтобы побудить клетки к дифференцировке в нейрон-подобного состояния. Добавление ретиноевой кислоты происходит в темноте.
- Ретиноевая кислота добавляется ежедневно в течение нескольких дней, после чего дифференциация будет наблюдать.
- Медиа менять каждые 3-4 дней.
4. Наблюдение и анализ
- Периодические изображения живых клеток или видео принимаются для того, чтобы наблюдать поведение клеток с течением времени. Для изображения в реальном времени, клетки располагаются в верхнем столике микроскопа инкубатор который держит клетки при 37 ° С, влажность 100%, и 5% СО 2. Клетки могут быть также фиксировали и окрашивали для наблюдения под флуоресценции
5. Представитель Результаты:
Типичный результат реализации технике литографии плазмы является формирование структуры клеток, которые напоминают некоторые произвольные или природную структуру. Это видно на рисунке 1а-б, где линии и сети нейронов, которые были созданы. Другие типы клеток могут быть использованы так же как показано на рисунке 1c-й, который показывает, пупочной вены человека эндотелиальных клеток (HUVEC) и C2C12 скелетные мышечные клетки формирования сетки. Материалы, такие как поли-L-лизин может быть с рисунком, рис 1e для облегчения вложения определенных типов клеток и для других целей. В случае нейронов показал, что было создано в сети клеток, которые имеют связи между ними. Это повторяет то, что происходит естественно в мозг, где нейроны имеют дискретные связи между соседними клетками, который влияет на работу головного мозга. С созданием такой структуры в лаборатории, числа, положения, частоты и других факторов связи могут быть систематически контролируется. Результатом этих arraignments можно оценить визуально и дополнительных ресурсов, таких как химическая или электрическая стимуляция может быть реализовано, чтобы исследовать поведение сети.
Отрицательный результат был бы заросших или неполную картину или загрязненные образцы. Неполной или заросшие модель будет результатом посева субстрат либо слишком мало или слишком много клеток, который не будет поставлять модель с идеальным количеством клеток. Кроме того, если модель не рассчитана правильно (например, линий слишком узкое) клетки не смогут подключаться и успешно развиваться на нем. В случае загрязнения образца, надлежащим чистоты не было бы поддерживать во время одного из шагов, хотя это бывает редко, когда после надлежащего протокола культуре клеток связано с тем, что плазма структурирование также стерилизует подложки.
Рисунок 1. Структурирование клеток и белка.
Discussion
Метод ячейки расследования, представленные здесь позволяет создавать сложные структуры многоклеточных сетей, которые имитируют биологические структуры, а также предоставляет метод для создания стимулов, которые субклеточных в природе, которые затем облегчает исследования сгруппированы как поведение клеток и одного-клеточные реакции к факторам среды. Использование этого метода прост, но надежен, как она может быть быстро выполнена с низкой стоимости оборудования в той же лаборатории, культуре клеток. Кроме того, настоятельно клетка чувствительна, позволяет легко наблюдения результирующая поведения и по своей природе является стабильной в течение длительного периода времени, что позволяет исследовать долгосрочное поведение клетки. Это дополнительно позволяет для разнообразных экспериментов, которые будут выполняться, как это совместимо со многими типами клеток и может создавать произвольные узоры. Долгосрочной стабильности техники проистекает из того факта, что поверхность функционализации, предоставленная плазмы является частью поверхности, а не покрытие или другого слоя, который может быть удален или деградировали. Если держать под жидким, этот тип модификации может сохранить свою ячейку руководящие способности в течение нескольких месяцев.
Наиболее важной частью эксперимента, необходимых для обеспечения значимых результатов в том, что создание мастер образец, который в конечном итоге будут использованы для сотовых руководства. Если эта картина не является должным образом спроектированы, клетки не будут надлежащих ответных мер в образец и не может производить полезную поведение. Такие параметры, как ширина линии, сеткой скважин, и другие могут сильно влиять на ячейки совместимость с определенной схеме, и, как правило ряд таких параметров могут быть созданы на начальном фотошаблонов для выявления наиболее подходящий дизайн.
Другие важные параметры, связанные с проведением структурирование включают формы создания, поддержания пыли окружающей среды, клетка посева и общей стерильности культуре клеток. Mold создание может быть осуществлено путем различных стадиях процесса, которые предпринимаются для обеспечения повторяется PDMS сбросив эпоксидной плесени. Эпоксидной формы создается потому что он не будет деградировать так же, как противостоять формы с маленьким, высоким соотношением сторон структур при повторном кастинге. Если литьевого прессования сделано правильно, размеров и доходности, не будут затронуты, но если сделано неправильно такими как плохо дегазации, неполное лечение, или чрезмерного перегревания, пузыри, шероховатости и деформации картина может произойти что влияет на конечный результат. В отношении поддержания пыли окружающей среды, формы должна быть как можно более чистым, как пыль может вмешиваться в надлежащий контакт между плесень рабочие PDMS и поверхности и тем самым надлежащий плазмы экранирование и химический кучность стрельбы. Плотность посева клеток, также должны быть оптимизированы, чтобы обеспечить, чтобы ни слишком мало или слишком много клеток населяют области образца и стерильность должна быть сохранена, чтобы избежать бактериальных и других загрязнений клеток используются.
Метод также может быть объединена с другими элементами, такими как микрофлюидики, микроэлектродов и механических датчиков. Это дает дополнительные стимулы к клеткам, чтобы лучше повторить различных физиологических условиях во время экспериментов и будущей работы направлена на изучение воздействия этих комбинаций
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasma Cleaner And Vacuum Chamber | Harrick Scientific Products, Inc. | PDC-001 | |
| Inverted fluorescence and phase contrast microscope | Nikon Instruments | TE2000-U | |
| Microscope stage top incubator | AmScope | Model TCS-100 | Modified to include an enclosure that supplies an appropriate atmosphere |
| Polystyrene Petri dish | VWR international | 25384-090 | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Epoxy | Devcon Inc. | 2 ton clear epoxy #14310 | |
| Cell culture media | Various | Media follows standard formulations for cell type | |
| Retinoic acid | Sigma-Aldrich | R2625 |
References
- Junkin, M., Watson, J., Vande Geest, J. P., Wong, P. K. Template-Guided Self-Assembly of Colloidal Quantum Dots Using Plasma Lithography. Adv Mater. 21, 1247-1251 (2009).
- Junkin, M., Wong, P. K. Probing cell migration in confined environments by plasma lithography. Biomaterials. 32, 1848-1855 (2011).
- Keyes, J., Junkin, M., Cappello, J., Wu, X., Wong, P. K.
- Langowski, B. A., Uhrich, K. E.
- Tourovskaia, A., Barber, T., Wickes, B. T., Hirdes, D., Grin, B., Castner, D. G. Micropatterns of Chemisorbed Cell Adhesion-Repellent Films Using Oxygen Plasma Etching and Elastomeric Masks. Langmuir. 19, 4754-4764 (2003).
- Chen, C. S., Mrksich, M., Huang, S., Whitesides, G. M., Ingber, D. E. Geometric Control of Cell Life and Death. Science. 276, 1425-1428 (1997).
- Johansson, B. -L., Larsson, A., Ocklind, A., Ohrlund, A. Characterization of Air Plasma-Treated Polymer Surfaces by ESCA and Contact Angle Measurements for Optimization of Surface Stability and Cell Growth. Journal of Applied Polymer Science. 86, 26185-26185 (2002).
- Murakami, T., Kuroda, S. -i, Osawa, Z. Dynamics of Polymeric Solid Surfaces Treated with Oxygen Plasma: Effect of Aging Media after Plasma Treatment. Journal of Colloid and Interface Science. 202, 37-44 (1998).
- Strobel, M., Lyons, C. S., Mittal, K. L. Plasma surface modification of polymers: Relevance to adhesion. , VSP. Utrecht, Netherlands. (1994).
- Xia, Y., Whitesides, G. M.
- Song, M., Uhrich, K. R. Optimal Micropattern Dimensions Enhance Neurite Outgrowth Rates, Lengths, and Orientations. Annals of Biomedical Engineering. 35, 1812-1820 (2007).
- Zhao, F., Wu, T., Lau, A., Jiang, T., Huang, Z., Wang, X. -J. Nrf2 promotes neuronal cell differentiation. Free Radical Biology and Medicine. 47, 867-879 (2009).
- Ohl, A., Schroder, K. Plasma-induced chemical micropatterning for cell culturing applications: a brief review. Surface and Coatings Technology. 116-119, 820-830 (1999).
- van Kooten, T. G., Spijker, H. T., Busscher, H. J. Plasma-treated polystyrene surfaces: model surfaces for studying cell-biomaterial interactions. Biomaterials. 25, 1735-1747 (2004).
- Loesberg, W. A., te Riet, J., van Delft, F., Schön, P., Figdor, C. G., Speller, S. The threshold at which substrate nanogroove dimensions may influence fibroblast alignment and adhesion. Biomaterials. 28, 3944-3951 (2007).
