Summary
En metod beskrivs för att individuellt välja, manipulera och bild lever patogener med en optisk fälla kopplad till en snurrande skiva mikroskop. Den optiska fällan ger tid och bekämpning av organismer och placerar dem i anslutning till värdceller. Fluorescensmikroskopi fångar dynamiska intercellulära interaktioner med minimal störning till celler.
Abstract
Dynamisk levande cell imaging möjliggör direkt visualisering av realtidsinformation interaktioner mellan celler i immunsystemet 1, 2, men har bristen på tid och kontroll mellan fagocytiska cellen och mikrob återges fokuserade observationer i den inledande interaktioner mellan värd reaktion på patogener svårt. Historiskt sett har intercellulär kontakta evenemang såsom fagocytos 3 har avbildats genom att blanda två celltyper, och sedan kontinuerligt skanna field-of-view för att hitta serendipitous intercellulära kontakter i rätt skede av interaktion. Den stokastiska karaktären av dessa händelser gör denna process tråkig, och det är svårt att observera tidiga eller hastiga händelser i cell-cell kontakt med denna metod. Denna metod måste man finna cell par som är på gränsen till kontakten och observera dem tills de fulländade sin kontakt, eller inte. För att lösa dessa begränsningar, vi använder optiska fällor som en icke-invasiva, icke-förstörande, men snabb och effektiv metod för att positionera celler i kultur.
Optisk fällor, eller optisk pincett, i allt högre grad används i biologisk forskning att fånga och fysiskt manipulera celler och andra micron stora partiklar i tre dimensioner 4. Strålningstryck observerades först och tillämpas på optisk pincett system i 1970 5, 6, och var först används för att styra biologiska prover i 1987 7. Sedan dess har optisk pincett mognat till en teknik för att undersöka olika biologiska fenomen 8-13.
Vi beskriver en metod 14 som förskott levande cell imaging genom att integrera en optisk fälla med spinning disk konfokalmikroskopi med temperatur och luftfuktighet för att ge utsökt rumsliga och tidsmässiga kontroll av sjukdomsalstrande organismer i en fysiologisk miljö för att underlätta samspel med värdceller, som bestäms av operatören. Live var patogena organismer som Candida albicans och Aspergillus fumigatus, som kan orsaka potentiellt dödliga, invasiva infektioner med nedsatt immunförsvar 15, 16 (t.ex. aids, kemoterapi och organtransplantation patienter), optiskt fångad med icke-förstörande laser intensitet och flyttade i anslutning till makrofager, vilket kan phagocytose patogenen. Hög upplösning, genomlysning och fluorescens-baserade filmer etablerade förmågan att observera tidiga händelserna fagocytos i levande celler. För att visa det breda tillämpbarhet i immunologi, var primära T-celler också fångade och manipulerat för att bilda synapser med anti-CD3 mikrosfärer in vivo och Time-lapse avbildning av synaps bildning erhölls också. Genom att tillhandahålla en metod att utöva fina rumsliga kontrollen av levande patogener med avseende på immunceller kan cellulära interaktioner fångas upp av fluorescensmikroskopi med minimal störning för att celler och kan ge kraftfulla inblick i tidig svar medfödd och adaptiv immunitet.
Protocol
1. Kultur villkor för patogener för optiska fällor
- Grow A. fumigatus (B-5233/RGD12-8) på en halvfast agar media som innehåller SBD (Sabouraud dextros) vid 30 ° C i 3 dagar.
- Väx C. albicans (SC5314) i YPD (jäst-Peptone dextros) flytande kultur som innehåller 100 mikrogram / ml ampicillin över natten i en shaker inkubator vid 30 ° C.
2. Beredning av patogener för fluorescerande märkning
- Harvest önskad mängd av patogener och överför till en 1,5 ml reaktionsrör.
- Tillsätt 300 mikroliter av fosfat saltlösning (PBS) för att reaktionsrör.
- Sonikera blandningen i 30 sekunder.
- Centrifugera vid 4000 rpm i 1 minut.
- Sug ut supernatant och lämnar pellets ostört.
- Upprepa (2,4) och (2,5) två gånger till.
- Resuspendera i 500μL PBS.
3. Märkning av patogener med fluorescerande färg
- Lös upp 1 mg färg av intresse (t.ex. Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 647) i 100 mikroliter dimetylformamid (DMF) (koncentration på 10 mg / ml).
- Tillsätt 3 mikroliter av färg blandningen reaktionsrören innehåller tvättas patogener.
- Rotera eller skaka provet vid 37 ° C i 1 timme.
- Tvätta provet med PBS 3X genom att centrifugera vid 4000 rpm i 1 minut.
- Resuspendera i 300 mikroliter PBS.
4. Skörd T-celler från helblod
- Skaffa helblod (färska).
- Varmt blod, PBS + 2% fetalt bovint serum (FBS) och histopaque till rumstemperatur.
- Lägg RosetteSep Human CD4 + T-cell Anrikning Cocktail på 50 mikroliter / ml helblod.
- Rotera provet och inkubera i 20 minuter vid rumstemperatur.
- Späd provet med en lika stor volym PBS + 2% FBS och blanda försiktigt.
- Layer utspädda provet ovanpå histopaque, minimera blandning
- Centrifugera i 20 minuter vid 1200 xg vid rumstemperatur med bromsen avstängd.
- Ta bort berikade celler.
- Tvätta berikad cellerna 2x med PBS + 2% FBS lösning.
- Lyse röda blodkroppar i 2 minuter med röda blodkroppar lyserings buffert
- Tillsätt 10 mL PBS + 2% FBS och centrifugera lyserade röda blodkroppar vid 1500 rpm i 5 minuter
- Aspirera supernatanten noga med att inte störa pelleten
- Resuspendera i IMDM media som innehåller 10% fetalt bovint serum
5. Beredning av RAW 264,7 makrofager in i kammare diabilder
- Förbered DMEM (Dulbecco ändrade Eagles medium) innehåller 10% FBS, 1% penicillin / streptomycin, och 1% L-glutamin.
- Varma media, trypsin, och PBS i varma badet till 37 ° C.
- Tvätta plattan 2x med PBS
- Aspirera PBS mellan varje tvätt.
- Tillsätt 5 ml Trypsin till tallriken för att täcka ytan (för en 10 cm vävnadsodling tallrik).
- Inkubera 5 minuter vid 37 ° C.
- Försiktigt knacka sidan av plattan för att koppla loss celler från plåtytan. Var noga med att inte stänka trypsin utanför plattan.
- Tillsätt 5 ml eller motsvarande mängd media till trypsin.
- Aspirera blandningen i en reaktionsrör.
- Centrifugera vid 1000 xgi 3 minuter.
- Aspirera media, noga med att inte störa pelleten.
- Resuspendera i 10 ml av media.
- Tillsätt 400 mikroliter av media till varje kammare i kammaren bilden.
- Tillsätt 5 mikroliter cellsuspension till varje kammare.
- Väx övernattning i inkubator vid 37 ° C med 5% CO 2.
6. Tillägg av patogener att prova
- Pipettera 5-10 mikroliter av märkt patogener av intresse (från steg 1-3) in i kammare.
- Blanda noggrant genom pipeting upp och ner, noga med att inte röra vid botten av kammaren att störa följas makrofager.
7. Laddar prov på spinning disk konfokalmikroskop (på video, skanna igenom komponenter)
- Slå på alla komponenter till spinning disk konfokalmikroskop.
- Passa mikroskop för DIC avbildning.
- Ta bort kammare diabild från inkubatorn.
- Sätt kammare glida in specialiserade skede.
- Ta bort toppen av kammaren bild (nödvändigt för DIC imaging).
8. Förberedelse för optiska fällor (i video, skanna genom delar och hur det integreras i mikroskop)
- Slå på slutaren för optisk fälla.
- Slå på IR-laser.
- Öppna slutaren (på laser) till optisk fälla.
- Bekräfta slutare framför IR-laser stängs genom att kontrollera med IR-kort.
9. Urval och manipulation av patogener med optisk fälla
- Fokus på makrofager den följs bild.
- Hitta patogener fritt fluktuerande i lösning i anslutning till makrofager.
- Flytta skede så att patogenen är i närheten av fällan.
- Öppna slutaren och engagera fällan.
- Flytta prov för att få makrofager i kontakt med den stationära fällanPED patogen.
- Bild med snurrande skiva konfokalmikroskop, antingen i DIC, fluorescens, eller en kombination av båda. Normalt är fångst görs i DIC, och i realtid avbildning görs med fluorescens.
10. Representativa resultat:
Att utöva hela rumsliga och tidsmässiga kontroll av patogener och pärlor i en in vivo och in vitro miljö, utformade vi en specialbyggd fånga apparater integrerade på en snurrande skiva konfokalmikroskop (schematiskt visas i bild. 1). Vid full styrka, förutsatt laser 350 mW och efter koppling av ljus med olika optiska komponenter i den optiska fällan apparaten, var ~ 80 mW vid TIRF målet, mätt med en kraftmätare används för att bilda fällan i kammaren.
För att placera ett objekt i kammaren i förhållande till det fångade föremålet, var scenen flyttats medan du håller fångade föremålet stilla med svällning laser. Scenen har flyttats till långsam nog hastigheter, så att dra kraft den fångade partiklar inte överstiger den maximala fångst kraft.
Separat populationer av C. albicans (typisk storlek - ~ 5 mikrometer) var märkta med var och en av tre färger (AF488, AF568 och AF647, motsvarande grön, blå och röd i figuren, respektive) för att illustrera avbildning med flera fluorescens kanaler samtidigt optiskt fånga patogenen. En enda C. albicans fångades och flyttas i ett rutmönster genom ett kluster av andra jäst, vilket framgår av grå arrows, demonstrera förmågan att fånga och manipulera den specifika platsen av en enda patogen väljas av den driftansvarige även i ett trångt miljö (Bild 2a) .
För att illustrera ytterligare flexibilitet i detta system för att fånga de olika form morfologier ut patogena organismer, var optisk pincett också möjlighet att hålla och placera ett C. albicans partikel med en pseudohyphae. C. albicans märkta med AF647 (röd) flyttades längs en bana som den beskrivs av den vita pilen och placeras bredvid fluorescerande GFP-LC3-RAW celler (Fig. 2B). Jästen del av C. albicans fångades som pseudohyphae släpade med sig.
Vi positionerade även Aspergillus fumigatus bredvid en RAW-mus makrofag cell för att analysera den absoluta tidsramen för fagocytos med just denna cellinje och patogen (Fig. 3A). När den patogen tar kontakt med cellen är fällan avstängd, och Time-lapse avbildning är anställd för att observera de efterföljande cellulära händelser (Fig. 3B). Den optiska fällan också användes för att fånga primära T-celler som isolerats från blod och riktat intill pärlor belagda med anti-CD3-antikroppar för att T-cellen att bilda en immunologisk synaps med pärla (bild 4), visa den ytterligare mångsidighet för att direkt fånga och manipulera immunceller.
Figur 1. Översikt och schematiskt kombinerad optisk fälla och spinning disk konfokalmikroskop setup. Instrument layout som visar fånga strålen (lila), belysning väg för brightfield imaging (orange), fluorescens excitation balk (röd), fluorescens utsläpp (grön), charge-coupled device (CCD) kamera, elektron-multiplicera Charge Coupled Device (EM- CCD) kamera, dikroiskt speglar (D1 och D2), speglar (M1 och M2) och linser (L1, L2, L3, L4). Alla andra komponenter i trap-konfokalmikroskop systemet är märkta i figuren.
Figur 2. (A) Fluorescens bilder av fångade och manipulerade C. albicans. En instängd fluorescerande-märkt (Alexa Fluor 488 (AF488), blå) organism i ett fält av andra fluorescerande-märkta C. albicans (AF568, gröna och AF647, röd). Scenen flyttas runt instängda, blå CA partikel som framgår av den grå pilarna. (B) Trapped pseudo-hyfernas form av C. albicans bredvid GFP-LC3 RAW cell. Fluorescerande psuedohyphal form av CA (röd, AF647) optiskt fångade och flyttade intill GFP-LC3 uttryckt RAW makrofager. CA organismen förs längs bana som anges av den vita pilen.
Figur 3. Fångst och positionering av A. fumigatus bredvid en fagocytos RAW cell. (A) brightfield bilder av en instängd A. fumigatus, vilket indikeras av den vita pilen, flyttas och placeras längs den väg som framgår av den röda pilen. Den fångade patogen är något ur fokus på grund av fällan att trycka på organismen något över fokalplanet. A. fumigatus flyttas tills den är placerad i anslutning till den önskade RAW cellen. (B) influensanorescence avbildning av fagocytos av A. fumigatus av RAW-cell. Efter att fastna patogenen är placerad intill en RAW-cell, är fagocytos processen aktiveras. Vid 30 s, börjar membranet i RAW-cellen att förändra och bilda en kopp runt partikeln. Vid 60 s, koppen fullt utvecklade. Från 90 till 150S, A. fumigatus är uppslukad och med 180 s, är partikeln helt internaliseras
Figur 4. Svällning primära T-cellen att bilda synaps med anti-CD3 belagda pärlor. DIC bilder av en primär T-cell rörd av den optiska fällan till en position bredvid en pärla belagda med anti-CD3-antikroppen. Cellen ligger sedan en immunologisk synaps, som inte lätt kan urskiljas på bilderna.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I detta arbete använder vi en optisk fälla för att fånga patogener med dimensioner mellan 3 ìm - 5 ìm. Även om patogener av intresse för vårt labb har normalt dessa dimensioner är den optiska pincett som beskrivs här flexibla för att fälla ett stort utbud av storlekar. I själva verket optiska fällor har använts för att fånga partiklar från enskilda atomer till celler cirka 10 mikrometer i diameter. Dessutom var denna optiska fällor system som kan fånga upp partiklar av olika former: sfäriska, elliptiska, och extremt långsträckta partiklar, vilket är användbart vid arbete med biologiska patogener.
Med denna metod, fagocytos och synaps bildning, i realtid, undersöktes och strukturella förändringar på cellulär ytan analyserades. Genom att placera partiklar intill en cell var leva patogener kontrolleras och manipuleras för att aktivera fagocytiska maskiner och studera immunsvaret i levande celler och övervaka absoluta början av en händelse genom hela loppet av fagocytos. Som ett resultat kan hela utvecklingen av fagocytiska händelser och maskiner vara noggrant uppmätt. Vi följde fagocytos av A. fumigatus eftersom patogenen är placerad intill en makrofager, och såg det första membranet ändras när partikeln var uppslukat. Vi kunde exakt mäta hela tidsramen för denna process genom att styra när vi ville processen att börja med placeringen av patogenen. Denna teknik utökades också till att observera synaps bildning av primära T-celler. Den optiska pincett flyttade en T-cellen bredvid en anti-CD3-antikropp pärla, och synaps bildning kan observeras i realtid.
Såvitt vi vet är denna metod först med att kontrollera och manipulera en patogen bredvid en fagocytos cell, och i jämförda med konfokalmikroskopi, användes för att spela in och visualisera absoluta början och slutet av fagocytos i tre dimensioner med diffraktion-begränsad rums- temporal upplösning. Tekniken har också använts för att kontrollera och manipulera primära T-celler för att studera immunologiska synapser, illustrerar den mångsidighet av detta instrument för olika biologiska tillämpningar. Vårt system ger fem excitation våglängder, inklusive UV-excitation, vilket möjliggör avbildning av en mängd olika fluoroforer. Fångsten apparaten har en 4,5 m 2 fotavtryck, kunna integreras på många konventionella epifluorescent och konfokala mikroskop. Även detta instrument har utformats främst för objekt manipulering, skulle framtida ändringar inkluderar högre laser makt, sträng ställning detektionskapacitet etc. skulle göra det möjligt karakterisering av biomekaniska krafter i cell-patogen interaktion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av Massachusetts General Hospital Institutionen för medicin interna medel (JMT, MKM, MLC, JMV), National Institute of Biomedical Imaging och bioteknik bevilja T32EB006348 (CEC), Massachusetts General Hospital Center for Computational och integrativ biologi utvecklingsfonden och AI062773 ( RJH), AI062773 bidrag, DK83756 och Danmark 043.351 (RJX), NSF 0.643.745 (MJL), NIH R21CA133576 (MJL) och National Institute of Allergy och infektionssjukdomar (NIAID) av National Institutes of Health (NIH) AI057999 (JMV ). Vi tackar Nicholas C. Yoder för bra diskussioner, och Charles filtar (RPI, Inc.) för tekniskt stöd.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A. fumigatus | Albino strain, B-5233/RGD12-8, gift from K.J. Kwon-Chung, NIH | ||
| C. albicans | SSY50-B mutant, gift from Eleftherios Mylonakis, MGH; SC5314 strain, gift from Gerald Fink, Whitehead Institute | ||
| Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A20000 | |
| Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A20006 | |
| dimethylformamide | Sigma-Aldrich | D4551 | |
| Fresh blood | Gift from R.J.W. Heath, MGH, HMS | ||
| Nikon inverted microscope | Nikon Instruments | Model Ti-E | |
| Trapping laser, ChromaLase | Blue Sky Research | CLAS-106-STF02-02 | |
| Fluorescence excitation laser | Coherent Inc. | Model Innova 70C | |
| Breadboards for trapping components | Thorlabs Inc. | MB1224, MB1218 | |
| Optical air table | Technical Manufacturing Corp. | ||
| Electronic shutter with pedal control | Uniblitz | Purchased from Vincent Associates, Rochester, NY | |
| Singlemode optical fiber | Oz Optics | PMJ-3S3S-1064-6 | |
| Fiber positioner | Thorlabs Inc. | PAF-X-5-C | |
| Fiber collimator | Oz Optics | HPUCO-23-1064-P-25AC | |
| Lenses for telescope | Thorlabs Inc. | AC254-150-B | Focal length of 150 mm |
| Translation stages (x, y, z) | Newport Corp. | M-461-XYZ | |
| IR dichroic mirror | Chroma Technology Corp. | ET750-sp-2p8 | |
| Objective lens (100X) | Nikon Instruments | NA = 1.49, oil immersion, TIRF objective | |
| Confocal head | Yokogawa | CSU-XI | |
| Polarizer | Nikon Instruments | MEN51941 | |
| Wollaston prism | Nikon Instruments | MBH76190 | |
| EM-CCD camera | Hamamatsu Corp. | C9100-13 | |
| CCD camera (ORCA ER) | Hamamatsu Corp. | C4742-80-12AG | |
| Filter wheel | Ludl | 99A353 | |
| Filter wheel | Sutter Instrument Co. | LB10-NWE | |
| Chambered coverglass | Lab-Tek | 155409 | |
| Dynabeads | Invitrogen | 111-51D | Coated with anti-CD3 |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Invitrogen | 10313 | |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| L-glutamine | Invitrogen | 25030-081 | |
| Fetal Bovine Serum (HyClone) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | SH30071.03 |
References
- Grakoui, A. The immunological synapse: A molecular machine controlling T cell activation. Science. 285, 221-227 (1999).
- Monks, C. R. Three-dimensional segregation of supramolecular activation clusters in T cells. Nature. 395, 82-86 (1998).
- Stuart, L. M., Ezekowitz, R. A. Phagocytosis and comparative innate immunity: Learning on the fly. Nat Rev Immunol. 8, 131-141 (2008).
- Neuman, K. C., Block, S. M. Optical trapping. Rev Sci Instrum. 75, 2787-2809 (2004).
- Ashkin, A. Optical trapping and manipulation of neutral particles using lasers. Proc Natl Acad Sci USA. 94, 4853-4860 (1997).
- Ashkin, A. Acceleration and trapping of particles by radiation pressure. Phys Rev Lett. 24, 156-159 (1970).
- Ashkin, A., Dziedzic, J. Optical trapping and manipulation of viruses and bacteria Science. Nature. 235, 1517-1520 (1987).
- Khalil, A. S. Single M13 bacteriophage tethering and stretching. Proc Natl Acad Sci USA. 104, 4892-4897 (2007).
- Khalil, A. S. Kinesin's cover-neck bundle folds forward to generate force. Proc Natl Acad Sci USA.. 105, 19247-19252 (2008).
- Li, Z. Membrane tether formation from outer hair cells with optical tweezers. Biophys J. , 1386-1395 (2002).
- Kim, S. The αβ T cell receptor is an anisotropic mechanosensor. J Biol Chem. 284, 31028-31028 (2009).
- Mohanty, S., Mohanty, K., Gupta, P. Dynamics of interaction of RBC with optical tweezers. Opt. Express. 13, 4745-4751 (2005).
- Tam, J. Control and manipulation of pathogens with an optical trap for live cell imaging of intercellular interactions. PLoS One. 5, e15215-e15215 (2010).
- Lin, S. J., Schranz, J., Teutsch, S. M. Aspergillosis case-fatality rate: Systematic review of the literature. Clin Infect Dis.. 32, 358-366 (2001).
- Wey, S. B. Hospital-acquired candidemia - the attributable mortality and excess length of stay. Arch. Intern. Med. 148, 2642-2645 (1988).
