Summary
Et live fluorescens avbildningsteknikk å kvantifisere etterfylling og mobilisering av spesifikke synaptiske vesicle (SV) bassengene i sentral nerve terminaler er beskrevet. To runder med SV resirkulering overvåkes i samme nerveterminaler gir en intern kontroll.
Abstract
Etter nevrotransmitter utgivelsen i det sentrale nerve terminaler, er SVS raskt hentes av endocytose. Hentet SVS blir deretter etterfylt med nevrotransmitter og slutte resirkulering bassenget, definert som SVS som er tilgjengelige for eksocytose 1,2. Resirkulering bassenget kan generelt deles inn i to forskjellige bassenger - den lett releasable pool (RRP) og reserve pool (RP). Som deres navn antyder, består RRP av SVS som er umiddelbart tilgjengelig for fusjon, mens RP SVS er utgitt bare under intens stimulering 1,2. Det er viktig å ha en pålitelig analyse som rapporterer differensial etterfylling av disse SV bassengene for å forstå 1) hvordan SVS trafikk etter forskjellige former for endocytose (som clathrin-avhengig endocytose og aktivitet-avhengige bulk endocytose) og 2) mekanismene kontrollere mobilisering av både RRP og RP som respons på ulike stimuli.
FM fargestoffer blir rutinemessig ansetteed å kvantitativt rapportere SV omsetning i sentrale nerveterminaler 3-8. De har en hydrofobe hydrokarbon hale som gjør at reversibel partisjonering i lipid bilayer, og en hydrofil hode gruppe som blokkerer passasjen over membraner. De fargene som har liten fluorescens i vandig løsning, men deres kvanteutbytte øker dramatisk når partisjonert i membran 9. Dermed FM fargestoffer er ideelle fluorescerende prober for sporing aktivt resirkulering SVS. Standard protokoll for bruk av FM fargestoff er som følger. Først de brukes til nevroner og blir tatt opp under endocytose (figur 1). Etter ikke-internalisert fargestoff er skylt vekk fra plasma membran, resirkulert SVS redistribuere innen resirkulering bassenget. Disse SVS er så utarmet bruker lossing stimuli (Figur 1). Siden FM dye merking av SVS er quantal 10, er den resulterende fluorescens slippe proporsjonal med mengden av vesikler utgitt. Dermed genererte resirkulering og sammensmeltingen av SVS fra previous runde av endocytose kan måles pålitelig kvantifisert.
Her presenterer vi en protokoll som har blitt endret for å få ytterligere to elementer av informasjon. For det første er sekvensielle lossing stimuli brukes for å differensielt losse RRP og RP, slik at kvantifisering av påfyll av spesifikke SV bassenger. Dernest gjennomgår hver nerve terminal protokollen to ganger. Dermed kan responsen av samme nerve terminalen på S1 bli sammenlignet mot tilstedeværelsen av en test stoffer på fase S2 (figur 2), som gir en intern kontroll. Dette er viktig, siden omfanget av SV gjenbruk på tvers av ulike nerveterminaler er svært variabel 11.
Enhver tilhenger primære neuronal kulturer kan brukes for denne protokollen, men plating tetthet, løsninger og stimulering forholdene er optimalisert for lillehjernen granule nevroner (CGNs) 12,13.
Protocol
1. Lillehjernen Granule Neuron Forberedelse
- Autoclave ca 100 25 mm diameter Dekkglass (Tabell 1).
- Plasser Dekkglass i en 50 ml sterilt rør som inneholder sterilt poly-D-lysin løsning (tabell 2). Plasser på en roterende plattform for 2 t å belegge Dekkglass.
- Tørr belagt Dekkglass på sterile silkepapir i en laminær hette (Tabell 1).
- Plasser Dekkglass inn i sterile 6-brønn plater og varm i en CO 2 inkubator (Tabell 1). Dekkglass kan lagres i 1 måned ved 4 ° C før bruk.
- Avlive en 7 dagers gammel Sprague Dawley rotte pup i henhold til lokale etiske komiteen retningslinjer. Vi avlives valper bruker cervical forvridning.
- Dissekere lillehjernen og legg den i en steril petriskål inneholder en fosfatbufret salter løsning (løsning B, Tabell 3).
- Gjenta trinn 1,5 og 1,6 for 4-6 rotteunger.
- Cerebella blir deretter plassert på sterile stadium av en McIlwain Tissue Chopper (Tabell 1). Tissue er hakket på 375 mikrometer intervaller før roterende scenen gjennom 90 ° og gjenta prosessen.
- Den hakkede cerebella overføres til en trypsin løsning (løsning T, Tabell 4) som tidligere hadde blitt varmet til 37 ° C.
- Inkuber cerebella ved 37 ° C i 20 min med forsiktig omrøring ca hvert 5 min.
- Under tryptic fordøyelsen, flamme polish tre sterile glass pipetter (tabell 1) med en Bunsen flamme. Bruk flammen til å lage en fin bar, et medium bar og et bredt bar ved de respektive munnen på pipetter.
- Etter 20 min inkubering i løsning T, tilsett 20 ml av en trypsin / DNase inhibitor-løsning (løsning W, tabell 5) til lillehjernen fjæring og pellet cellene ved 1000 g for 1 min i en Borstemmaskin sentrifuge (Tabell 1).
- Dekanter supernatanten og cellepelleten suspenderes i 1,5 ml av en konsentrert trypsin / DNase inhibitor (løsning C, Tabell 6) bruker det bredeste fødte pipetten.
- Layer cellen suspensjon på toppen av 10 ml av en forvarmet (37 ° C) bovint serum albumin supplert Earles Balanced Salts Solution (Tabell 7) i en steril 15 ml tube.
- Sentrifuger suspensjon 5 min ved 1500 g og cellepelleten suspenderes i 2 mls av forvarmet (37 ° C) kultur medium (Tabell 8).
- Anslå celle nummer med en haemocytometer (Tabell 1) og fortynne cellesuspensjon til en endelig tetthet på 3,3 x 10 6 celler per ml.
- Cellene er belagt ved å tilsette 75 mL av cellesuspensjon til midten av poly-D-lysin-belagte Dekkglass (endelig tetthet 2,5 x 10 5).
- Kulturen platene inneholder Dekkglass er plassert i CO 2 inkubator for 60 min å la cellene til endhere.
- Legg 1.5ml av kultur medium i hver brønn ta vare for ikke å forstyrre belagt celler og returnere kultur platene til CO 2 inkubatoren.
- Dagen etter erstatte kultur medium med ferske kultur medium supplert med mitotiske inhibitor cytosin arabinoside (Tabell 8). Denne arrestasjoner spredning av gliaceller i kultur.
2. Eksperimentell Setup
- Grunnleggende eksperimentelle oppsett bør bestå av følgende (se tabell 1 og 9 for spesifikke utstyr og programvare som brukes):
- Inverted epi-fluorescens mikroskop
- Avkjølt CCD-kamera
- Fluorescerende lys kilde (monokromator eller filter hjul)
- Gravity perfusjon apparater
- Imaging kammer med parallelle platina elektroder
- Elektrisk stimulator
- Datamaskin
- Bilde oppkjøpet programvare
- Eksperimenter skal utføres i mørket eller under rødt lys dirigentitions med minimum fluorescerende belysning av prøven for å unngå FM dye bleking.
- Eksperimenter utføres ved romtemperatur. Hvis fysiologiske temperatur er nødvendig, kan et temperaturkontrollert perfusjon system benyttes.
3. Prøvepreparering
- Kulturer skal brukes etter 8-12 dager in vitro.
- Overfør et enkelt dekkglass til saltvann (Tabell 10) i 10 min ved romtemperatur å tillate stabilisering i nye medium.
- Fjern dekkglass, tørr undersiden og området rundt den vedlagte celler med et lite stykke papir håndkle eller tørkepapir.
- Bruk silikonfett (tabell 2), dekkglass lim til undersiden av bildebehandling kammeret. Cellene skal være mellom de to parallelle ledninger. Tilstrekkelig silikonfett bør brukes til å fullstendig forsegle kammeret men uten fett inn i sentrum av badekaret kammeret.
- Forsiktig fylle badekaret kammer med ~ 260 mL SAlinje løsning og deretter fylle inn slanger med samme løsning.
- Lim et rent dekkglass med silikonfett til toppen av kammeret å forsegle den. Input og output rør kan brukes til å fjerne eventuelle luftbobler fanget i kammeret. Det er viktig at den elektriske kretsen ikke blir avbrutt av luftbobler.
- Immobilise imaging kammer i rustfritt stål plattform og sjekk for lekkasjer ved forsiktig perfusing saltvann gjennom innspill slangen.
- Monter sammen kammer på scenen av en invertert mikroskop, og koble kammeret til et tyngdekraften perfusjon system, etter først å ha primet innløpet med saltoppløsning.
- Fest koble ledninger av kammeret til elektrisk stimulator.
- Legg til en dråpe nedsenking olje til målet om en olje-objektiv brukes. Fokus på cellene i midten av kammeret bruke lyse feltet belysning.
Fire. S1 Fase
- Perfuse nevroner med 1,5 mlav FM fargestoff (tabell 2) fortynnet i saltoppløsning.
- Stimulere neurons å fremkalle fargestoff opptak ved hjelp av vedlagte stimulator.
- Etter stimulering, til perfuse nevroner med frisk saltvann for 2 min vaske vekk overflødig FM fargestoff (flow rate 7 ml / min). Glial forurensning i CGN kultur systemet er mindre enn 5% 14, er derfor denne tidsrammen tilstrekkelig til å fjerne fargestoff .
- La neurons å hvile i 8 min.
- I løpet av dette intervallet, finn aksonal nettverk hvor den enkelte FM dye-loaded nerveterminaler er synlige ved hjelp av fluorescein bølgelengder (eksitasjon, 480 nm, utslipp,> 550 nm). Unngå områder med klynger av celler. Hold belysning til et minimum på dette trinnet, siden intense eksitasjon kan resultere i fargestoff fototoksisitet. Åpenbare tegn på dette er blebbing av axoner og mangel på fargestoff lossing (på grunn av fargestoff fikse).
- Re-fokus image umiddelbart før image oppkjøpet siden en liten drift kan ha oppstått under resten perioden. Begynn time-lapse bilde oppkjøpet på frekvensen av en ramme hver 4. s.
- Etter å skaffe 5-10 baseline bilder, fremkalle eksocytose av RRP ved å levere en 30 Hz stimulering for 2 s (60 aksjonspotensialer) 8 Commence stimulering manuelt umiddelbart etter ramme fangst..
- Etter å skaffe ytterligere 10 bilder, fremkalle SV eksocytose av RP ved hjelp av tre stimuleringer på 40 Hz til 10 s (400 aksjonspotensialer), hvert 30 s hverandre 8.
- Skaff en annen 5-10 bilder og deretter pause image oppkjøpet.
5. Recovery fase (se figur 2)
- La neurons å komme over minst 20 min.
- Valgfritt - Hvis effekten av et medikament på endocytose skal testes, perfuse nevroner med narkotika løsning i denne perioden (Figur 2b) 3,8.
Seks. S2 fase
- Gjenta S1 fase protokoll (§ 4) for en kontroll eksperiment ved hjelp av samme synsfelt somi S1.
- Valgfritt - Hvis effekten av et medikament på endocytose skal testes, perfuse nerveceller med stoffet løsningen supplert med FM fargestoff (Figur 2b) 3,8.
- Valgfritt - Alternativt hvis stoffet effekter på eksocytose er av interesse, perfuse nerveceller med stoffet løsningen både før og under RRP og RP lossing stimuli (figur 2c) 3.
7. Data Analysis
- Bruk ImageJ og Microsoft Excel eller lignende programvare for dataanalyse.
- For analyse, er en bildesekvens i stack format nødvendig. Noen bildebehandlingsprogrammer kan eksportere sekvenser som enkle bilder. Hvis dette er tilfelle, konvertere bilder til en stabel med en ImageJ innebygd funksjon Image> Stabler> Bilder til stack.
- Juster lysstyrken og kontrasten i stabelen for å maksimere det dynamiske området. Image> Adjust> Brightness / Contrast (figur 3a).
- Hvis betydelige horisontale drift har oppstått under tHan eksperimentere, løpe StackReg ( http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/ ) og TurboReg ( http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/ ) plugins på ImageJ å justere bildestakk (figur 3b) .
- Run Time Series Analyzer plugin ( http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/time-series.html ) (figur 3c).
- Definer regioner av interesse (Rois) over minst 90 nerveterminaler. Disse bør være identiske (sirkulær Rois med 1,5 mikrometer diameter) Det er nyttig å veksle mellom bildene før og etter dye lossing å avsløre aktive nerveterminaler (alternativt en pre-stimulering bilde kan trekkes fra en post-stimulering bilde). En ideell ROI størrelsen er en som er litt større enn en typisk nerve terminal (figur 3c).
- Skaff innlegg / integrerte fluorescensintensitet av hver ROI enn time og eksport til Microsoft Excel (Figur 3D og 4a).
- Normalise ROI spor til den samme vilkårlig verdi ved å justere spor i planet på Y-aksen for første lossing stimulus i både S1 og S2 faser (Figur 4b-c). Dette er å kontrollere for små variasjoner i bakgrunnsfluorescens intensitet.
- Mål absolutt nedgang i fluorescens fremkalt av hver lossing stimulans i vilkårlig fluorescens enheter for S1 og S2 som følger (figur 4d):
- RRP = Endring i fluorescens (ΔF) utløst ved 30 Hz 2 s
- RP = Summen av ΔF utløst av 3 x 40 Hz 10 s
- Total gjenvinning pool = RRP + RP
- For hver relevant parameter i 7.9, beregne middelverdien over alle nerveterminaler av et enkelt eksperiment.
- For statistisk analyse, middelverdier innhentet fra flere uavhengige eksperimenter kan være gjennomsnittet. Antallet Dekkglass snarere enn antallet nerveterminaler bør brukes som STATISTICAl n.
8. Representant Resultater:
En kontroll eksperiment der CGNs gjennomgikk to runder med identiske lasting og lossing trinn er representert i figur 5. Når begynner en serie eksperimenter, er det viktig at en kontroll eksperiment som dette utføres hver dag for å bekrefte at S1 og S2 er sammenlignbare før varierende eksperimentelle forhold under S2.
I dette eksempelet var CGNs lastet med 10 mM FM1-43 bruker en 80 Hz 10 s stimulering (figur 5a). Figur 5b viser FM1-43-loaded nerveterminaler representert med fluorescerende puncta. Rois ble definert over 90 nerveterminaler som vist i Figur 5c. Det samme settet av Rois ble brukt både S1 og S2. Under begge losser, var den RRP første losses med en 30 Hz (2 s) stimulering etterfulgt av RP lossing med 3 sekvensiell 40Hz (10 s) stimuli (Figur 5a). Fluorescens slipp i løpet av hver stimulus kan tydelig observeres og kvantifiseres (figur 5d-e). Da undersøkte faller fluorescens tilsvarende RRP var RP og total resirkulering bassenget sammenlignbare i både S1 og S2. I tillegg bodde 20% av resirkulert SVS i RRP mens 80% bodde i RP både S1 og S2.
Figur 1 Prinsippskisse av en typisk FM eksperiment. A) SV endocytose blir utløst i nærvær av FM fargestoff (representert i grønt). Fargestoffet er tatt opp av invaginating membran (single SVS eller bulk endosomes). B) Ikke-internalisert dye på plasma membranen er vasket bort av perfusjon. C) Ved anvendelse av en lossing stimulus, merket SVS som har blitt tilgjengelig for utgivelse sikring med plasma membran som resulterer i et tap av fluorescens. D) Endringen i fluorescens (ΔF) som er proporsjonal med mengden av frigitte merket SVS kan da bli kvantifisert.
_upload/3143/3143fig2.jpg "/>
Figur 2 Skjematisk diagram over mulige eksperimentelle protokoller. A) Flow diagram av en kontroll eksperiment der celler gjennomgå to runder av FM fargestoff lasting og lossing (S1 og S2). Celler kan lastes inn ved hjelp av en rekke ulike stimuli. Lossing trinn er identiske ved at RRP er losses med 30 Hz for 2 s etterfulgt av RP losse bruke 3 ganger 40 Hz i 10 s. RRP og reserve pool lossing stimuli ble separert med 40 sek, alle andre stimuli med 30 sek. Celler er igjen til å gjenopprette i 20 min mellom S1 og S2. Flow diagrammer av mulige endringer for å teste effekten av et stoff på enten B) endocytose eller C) eksocytose vises også. Tilsvarende test stoffet kan være perfused inn i kammeret under indikerte perioder.
Figur 3 Skjermbilder av dataanalyse i Image J. Skjermbilder er vistfor A) lysstyrke og kontrast justering, B) frame alignment, C) Rois utvelgelse, og D) intensitet verdier ekstraksjon ved hjelp av Image J.
Figur 4 Skjermbilder av dataanalyse i Microsoft Excel. Skjermbilder er vist for A) å importere rådata fra bilde J (1. kolonne = ramme nummer, gjenværende kolonner = data fra individuelle nerveterminaler) B) justering av S1 baseline verdier (ramme 10) til en vilkårlig verdi (200) ved start av de første stimulus, C) justering av S2 baseline verdier på ramme 55 med en identisk protokollen til S1, og D) måling av fluorescens dråper bruke Microsoft Excel. Merk at i gjennomsnitt spore vist i D brukes til å definere tidspunkter før og etter hver dråpe. Størrelsen på fluorescens synker for hver ROI bør bestemmes ut fra verdier i regnearket som vises i C.
Figur 5. Representant kontroll eksperiment. A) Flow diagram av en kontroll eksperiment der CGNs var lastet med 10μM FM1-43 bruker 80 Hz (10 s) stimulering. S1 og S2 fasene er identiske. RRP og reserve pool lossing stimuli ble separert med 40 sek, alle andre stimuli med 30 sek. B) Et bilde som viser nerveterminaler lastet med FM1-43. C) Det samme bilde som B viser 90 nummererte Rois valgt for analyse. D) Bilder av et område skildret av en rød boks i B på utvalgte tidspunkter. Basal = før stimulering, 30 Hz = etter 30 Hz 2 s stimulering, 40 Hz 1,2,3 = etter hvert 40 Hz 10 s stimulering. Disse bildene er presentert i pseudocolor å illustrere endringene i fluorescens (spectrum bar vises til høyre). E) Mean ± SEM spor innhentet fra 90 nerveterminaler avbildet i C. Individuelle stimuli er representert med vannrette streker. Scale barer = 10 mikrometer.
Discussion
FM fargestoffer er mye brukt for å undersøke nerve terminal funksjon i mange neuronal forberedelser. De har vært ansatt i hovedsak til å overvåke omfanget av enten SV endocytose, SV omsetning eller kinetikken av eksocytose 6. De beskrevne Protokollen utvider disse studiene for å undersøke differensial lossing av spesifikke SV bassenger. Dette gir ytterligere informasjon om etterfylling av SV bassenger og også deres grad av mobilisering.
FM fargestoffer kan brukes til å merke flere runder med SV resirkulering innenfor samme nerveterminaler. Vi har utnyttet denne egenskapen og designet protokoller der SV omsetning i hver terminal kan overvåkes to ganger i samme nerveterminaler. Dette gir en nøyaktig intern kontroll, noe som er viktig på grunn av heterogene natur SV gjenvinning i parallell nerveterminaler 11. Via bruk av S1 fasen som en intern kontroll, påfylling av RRP, RP og den totaleSV bassenget i nærvær av narkotika kan være pålitelig og direkte sammenlignet.
I tillegg til å gi opplysninger av den absolutte størrelsen på resirkulering, RRP og RP bassenger under ulike stimulering forhold, kan denne protokollen også gi data for følgende - 1) oppdeling av SVS mellom RRP og RP som en funksjon av resirkulering bassenget for S1 og S2, 2) den relative størrelsen på S2 bassenger (RRP og RP) som en funksjon av total S1 resirkulering basseng og 3) den relative størrelsen på noen definert SV bassenget i S2 som en funksjon av det samme bassenget i S1. Dette bestemte protokollen vil ikke gi informasjon om lossing kinetikk men siden oppkjøpet tiden er for langsom (for kinetiske målinger innhentingstider bør være så rask som mulig og lossing automatisk synkronisert til Image Capture).
Våre 30 Hz 2 s stimuli fremkaller en identisk omfanget av RRP lossing til hyperton sukrose 8. Siden størrelsen på RRPer definert ved hyperton sakkarose lossing 15, kan vi konstatere at denne protokollen losser alle RRP SVS, i enighet med studier i hippocampus nevroner 16. Reservatet Bassenget er nesten helt utarmet av tre tog på 400 stimuli (40 Hz 10 s hver) siden dette stimulering losser en identisk mengde fargestoff til et paradigme (2 stimuli med 50 mM KCl) som depletes 95% av alle dye-merket SVS 8,17. Nøyaktig tallfesting av størrelsen på både RRP og reserve basseng er også avhengig av å skaffe opplysninger innen den lineære dynamiske området for CCD kameraet.
Denne enkle protokoll kan også endres ytterligere. Styrken til lasting stimuli kan også varieres for å avgjøre hvordan neuronal aktivitet og ulike endocytose moduser påvirke SV pool påfylling. Videre kan større enn to sykluser med lasting og lossing også utføres om nødvendig. Denne protokollen kan også brukes i celler transfektert med enten overekspresjon ellershRNA vektorer. På grunn av den lave transfeksjon effektiviteten av primær neuronal kulturer, må uttrykte proteiner merkes med fluorescerende proteiner. Det er viktig at disse fluoriserende kodene ikke forstyrre FM fargestoff signal (bruk cyan eller rød proteiner, for eksempel). I dette tilfellet kan nerveterminaler fra transfektert og ikke-transfektert celler i samme synsfelt også sammenliknes som en ekstra kontroll 8. I slike eksperimenter en sammenligning av omfanget av lasting mellom S1 og S2 last er av liten verdi, siden uro er til stede både under belastning. Partisjonering av fargestoff mellom SV bassenger fremdeles kan visualiseres imidlertid 8.
Genetisk reportere kalte pHluorins kan også være ansatt for å overvåke SV eksocytose og endocytose i grunnskolen neuronal kultur. Disse sondene bruker en pH-sensitiv grønt fluorescerende protein til pH miljøet luminal domener tagget SV proteiner som VAMP, synaptophysin og VGLUT1 18 19. FM-dye baserte tilnærmingen som beskrives her har noen fordeler over pHluorin teknikk, det første FM fargestoffer gi informasjon om hvilke SV endocytose modus replenishes den RRP og reserve bassenger 8. Dernest spesifikke SV bassengene kan merkes med FM fargestoffer som har ulike spektrale egenskaper 20 og til slutt er det ingen krav til transfeksjon. FM fargestoffer kan ikke gi informasjon om SV trafikken mellom hvile og resirkulering SV bassenger imidlertid (i motsetning til pHluorins 19), da per definisjon SVS må være lastet med fargestoff under endocytose å være synlig. Dermed både FM fargestoffer og pHluorins har styrker og svakheter og er mest kraftig når brukt i uavhengige eksperimenter for å møte de samme spørsmål.
Bilder av høy kvalitet er avgjørende for gyldige analyse og reproducible resultater. Mens horisontale drift kan lett korrigeres, kan eksperimenter der det er drift i Z-aksen ikke gjenopprettes. Av denne grunn er det viktig å re-fokusere bilder før påbegynnes S1 og S2 losser. I tilfeller hvor en betydelig fluoriserende forfallet har skjedd, kan forfallet rettelser påføres (vanligvis ved å trekke et tidligere innspilt spor fra FM-loaded celler i fravær av stimulering). Imidlertid er det foreslått at forfallet korreksjon er bare utført for grafisk representasjon og ikke brukes for enhver kvantitativ analyse.
Disclosures
Vi har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av et stipend fra Wellcome Trust (Ref: 084277).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AxioCam MRm Rev. 3 Digital Camera | Carl Zeiss, Inc. | 4265099901000 | |
| Axio Observer.A1 Microscope | Carl Zeiss, Inc. | 4310040000000 | |
| Cell culture plates (6 wells) | Greiner Bio-One | 657160 | |
| Centrifuge (Universal 32R) | Hettich Zentrifugen | 1610 | |
| CO2 incubator | Heraeus Instruments | 51014042 | |
| Falcon tubes (15/50 ml) | Greiner Bio-One | 188271/210261 | |
| Fluar 20X /0.75 ∞/0.17 Objective | Carl Zeiss, Inc. | 4401459901000 | |
| Glass coverslips (25mm) | VWR international | 631-1584 | |
| Glass pasteur pipettes (230 nm) | Greiner Bio-One | 612-1799 | |
| Haemocytometer | VWR international | 15170-170 | |
| Imaging chamber | Warner Instruments | RC-21 BRFS | |
| Laminar flow hood | BIOHIT | VLF BHS 1200 | |
| McIlwain Tissue Chopper | Mickle Laboratory Engineering Co. Ltd. | MTC/2 | |
| Mercury lamp | Carl Zeiss, Inc. | HBO 103 | |
| MultiStim System Electrical Stimulator (100mV, 1ms pluse width) |  Digitimer Ltd. |
D330 | |
| Perfusion pump | Watson-Marlow Pumps Group | 313S | |
| Serological Pipettes (5/10/25 ml) | Greiner Bio-One | 606180/607180/760180 | |
| Shutter controller | Carl Zeiss, Inc. | MAC5000 | |
| Syringe (20 ml) | BD Biosciences | ST01-B002 | |
| Syringe Filters (Minisart -– 0.20 μm) | Sartorius AG | 16532 | |
| VC-6 Six Channel valve controller | Warner Instruments | 64-0135 | |
| YFP Filter set (Set 46) | Carl Zeiss, Inc. | 1196-681 | |
| Table 1. Specific equipment and apparatus used | |||
| FM1-43 | Cambridge BioScience | BT70021 | 10 μM |
| FM2-10 | Cambridge BioScience | BT70044 | 100 μM |
| Poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | P7886 | 15 μg/ml |
| Silicone grease | Sigma-Aldrich | 85403 | - |
| Table 2. Specific reagents used | |||
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A4503 | 0.3% |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | 0.25% |
| MgSO4·7H2O | Sigma-Aldrich | M2773 | 1.5 mM |
| D-PBS | GIBCO, by Life Technologies | 21300 | 960 mg/100 ml |
| -make 100ml fresh for each preparation -sterile filter before use |
|||
| Table 3. Solution B for CGN preparation | |||
| Solution B | 19 ml | ||
| Trypsin (5 mg/ml stock, -20°C) | Sigma-Aldrich | T9201 | 1 ml |
| Table 4. Solution T for CGN preparation | |||
| Solution C | 3.2 ml | ||
| Solution B | 16.8 ml | ||
| Table 5. Solution W for CGN preparation | |||
| Deoxyribonuclease (DNase, 500 U per 0.5 ml stock, -20°C) | Sigma-Aldrich | D5025 | 0.5 ml |
| MgSO4· 7H2O | Sigma-Aldrich | M2773 | 1.5 mM |
| Solution B | 10 ml | ||
| Soybean trypsin inhibitor (SBTI, 0.5 mg per 0.5 ml stock, -20°C) | Sigma-Aldrich | T9003 | 0.5 ml |
| Table 6. Solution C for CGN preparation | |||
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A4503 | 4% |
| Earle’s Balanced Salt Solution (EBSS) | GIBCO, by Life Technologies | 24010 | 10 ml |
| MgSO4· 7H2O | Sigma-Aldrich | M2773 | 3 mM |
| Table 7. EBSS Solution for CGN preparation | |||
| Cytosine β-D-arabinofuranoside (Ara-C) * | Sigma-Aldrich | C1768 | 10 μM |
| F–tal Bovine Serum | GIBCO, by Life Technologies | 10106 | 10 % |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | 30 mM |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G3126 | 2 mM |
| KCl | Sigma-Aldrich | P5405 | 25 mM |
| Minimal Essential Medium (MEM) | GIBCO, by Life Technologies | 21090 | 500 ml |
| Penicillin (P)/Streptomycin (S) | GIBCO, by Life Technologies | 15140 | 100 U/ml (P), 100 μg/ml (S) |
| *Ara-C should be added to medium from 1 DIV onwards | |||
| Table 8. Culture Media for CGN preparation | |||
| AxioVision Rel. | Carl Zeiss, Inc. | 4.8 | |
| ImageJ | National Institutes of Health | 1.42q | |
| Microsoft Excel | Microsoft | 2003 | |
| Table 9. Specific computer software used | |||
| CaCl2 · 2H2O | Sigma-Aldrich | C7902 | 1.3 mM |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | 5 mM |
| KCl | Sigma-Aldrich | P5405 | 3.5 mM |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P9791 | 0.4 mM |
| MgCl2·6H2O | Sigma-Aldrich | M0250 | 1.2 mM |
| NaCl | Fluka | 71378 | 170 mM |
| NaHCO3 | Fluka | 71627 | 5 mM |
| Na2SO4 | VWR | 10264 | 1.2 mM |
| TES | Sigma-Aldrich | T1375 | 20 mM |
| Table 10. Saline Solution (pH 7.4) | |||
References
- Rizzoli, S. O., Betz, W. J. Synaptic vesicle pools. Nat. Rev. Neurosci. 6, 57-69 (2005).
- Sudhof, T. C. The synaptic vesicle cycle revisited. Neuron. 28, 317-320 (2000).
- Evans, G. J., Cousin, M. A. Activity-dependent control of slow synaptic vesicle endocytosis by cyclin-dependent kinase 5. J. Neurosci. 27, 401-411 (2007).
- Clayton, E. L., Cousin, M. A. Differential labelling of bulk endocytosis in nerve terminals by FM dyes. Neurochem. Int. 53, 51-55 (2008).
- Clayton, E. L., Evans, G. J., Cousin, M. A. Bulk synaptic vesicle endocytosis is rapidly triggered during strong stimulation. J. Neurosci. 28, 6627-6632 (2008).
- Cousin, M. A. Use of FM1-43 and other derivatives to investigate neuronal function. Curr. Protoc. Neurosci. Chapter 2, Unit 2-Unit 2 (2008).
- Clayton, E. L. The phospho-dependent dynamin-syndapin interaction triggers activity-dependent bulk endocytosis of synaptic vesicles. J. Neurosci. 29, 7706-7717 (2009).
- Cheung, G., Jupp, O. J., Cousin, M. A. Activity-dependent bulk endocytosis and clathrin-dependent endocytosis replenish specific synaptic vesicle pools in central nerve terminals. J. Neurosci. 30, 8151-8161 (2010).
- Betz, W. J., Mao, F., Smith, C. B. Imaging exocytosis and endocytosis. Curr. Opin. Neurobiol. 6, 365-371 (1996).
- Ryan, T. A., Reuter, H., Smith, S. J. Optical detection of a quantal presynaptic membrane turnover. Nature. 388, 478-482 (1997).
- Murthy, V. N., Sejnowski, T. J., Stevens, C. F. Heterogeneous release properties of visualized individual hippocampal synapses. Neuron. 18, 599-612 (1997).
- Tan, T. C. Cdk5 is essential for synaptic vesicle endocytosis. Nat. Cell. Biol. 5, 701-710 (2003).
- Anggono, V., Cousin, M. A., Robinson, P. J. Styryl dye-based synaptic vesicle recycling assay in cultured cerebellar granule neurons. Methods. Mol. Biol. 457, 333-345 (2008).
- Gallo, V. Selective release of glutamate from cerebellar granule cells differentiating in culture. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 79, 7919-7923 (1982).
- Stevens, C. F. Neurotransmitter release at central synapses. Neuron. 40, 381-388 (2003).
- Mozhayeva, M. G. Development of vesicle pools during maturation of hippocampal synapses. J. Neurosci. 22, 654-665 (2002).
- Cousin, M. A., Evans, G. J. O. Activation of silent and weak synapses by cAMP-dependent protein kinase in cultured cerebellar granule neurons. J. Physiol. 589, 1943-1955 (2011).
- Kim, S. H., Ryan, T. A. Synaptic vesicle recycling at CNS synapses without AP-2. J. Neurosci. 29, 3865-3874 (2009).
- Kim, S. H., Ryan, T. A. Cdk5 serves as a major control point in neurotransmitter release. Neuron. 67, 797-809 (2010).
- Groemer, T. W., Klingauf, J. Synaptic vesicles recycling spontaneously and during activity belong to the same pool. Nat. Neurosci. 10, 145-147 (2007).
