Summary
En live fluorescens billedbehandling teknik til at kvantificere opfyldning og mobilisering af specifikke synaptiske vesikel (SV) pools i det centrale nerve terminaler er beskrevet. To runder med SV genanvendelse overvåges i samme nerve terminalerne leverer en intern kontrol.
Abstract
Efter neurotransmitter release i det centrale nerve terminalerne, er SVS hurtigt hentes af endocytose. Hentet SVS er derefter fyldes med neurotransmitter og genindtræde i genbrug pulje, der defineres som SVS, der er tilgængelige for exocytose 1,2. Genanvendelsen pool kan generelt opdeles i to forskellige puljer - det er let frigøres pool (vejl. udsalgspris) og reserven pool (RP). Som deres navne indebærer, RRP består af SVS, der er umiddelbart tilgængelige for fusion, mens RP SVS er kun udgivet under intens stimulation 1,2. Det er vigtigt at have en pålidelig analyse, der rapporterer den differentierede genopfyldning af disse SV puljer med henblik på at forstå, 1) hvordan SVS trafikken efter forskellige former for endocytose (såsom clathrin-afhængig endocytose og aktivitet-afhængige bulk endocytose) og 2) de mekanismer kontrollere mobilisering af både RRP og RP som reaktion på forskellige stimuli.
FM-farvestoffer er rutinemæssigt ansætteed til kvantitativt rapport SV omsætningen i det centrale nerve terminaler 3-8. De har en hydrofobe kulbrinte hale, der gør det muligt reversible partitionering i tolagede, og et hydrofilt hoved gruppe, der blokerer for passage over membraner. De farvestoffer har lidt fluorescens i vandig opløsning, men deres kvanteudbytte stiger dramatisk, når partitioneret i membran 9. Således FM-farvestoffer er ideelle fluorescerende prober til sporing aktivt genbrug SVS. Den standardprotokol for brug af FM-farvestof er som følger. Først de anvendes til neuroner og er taget op under endocytose (Figur 1). Efter ikke-internaliserede er skyllet vaek fra plasmamembranen, genbrugspapir SVS omfordele inden for genbrug pool. Disse SVS er derefter udtømte bruger losning stimuli (Figur 1). Siden FM-dye mærkning af SVS er kvantemekaniske 10, den resulterende fluorescens fald er proportional med mængden af frigivne blærer. Således genbrug og sammensmeltning af SVS genereret fra PRevious runde af endocytose kan opgøres pålideligt kvantificeres.
Her præsenterer vi en protokol, der er blevet ændret for at opnå yderligere to elementer af oplysninger. For det første er sekventiel losning stimuli bruges til varierende læsse RRP og RP, at tillade kvantificering af opfyldning af specifikke SV pools. For det andet, hver nerve terminal gennemgår protokollen to gange. Således kan svar af samme nerve terminal i S1 sammenlignes mod tilstedeværelsen af et teststof på fase S2 (figur 2), hvilket giver en intern kontrol. Dette er vigtigt, da omfanget af SV genbrug på tværs af forskellige nerve terminaler er meget variabel 11.
Enhver tilhænger primære neuronal kulturer kan anvendes til denne protokol, dog plating tæthed, løsninger og stimulation betingelser er optimeret til cerebellare granula neuroner (CGN) 12,13.
Protocol
1. Cerebellare Granule Neuron Forberedelse
- Autoklave ca 100 25 mm i diameter dækglas (Tabel 1).
- Læg dækglas i en 50 ml sterilt rør, der indeholder steril poly-D-lysin opløsning (Tabel 2). Læg dem på en roterende platform for 2 timer til pels dækglas.
- Tør belagt dækglas på sterile silkepapir i en laminar flow hætte (Tabel 1).
- Læg dækglas i sterile 6-godt plader og varme i en CO 2 inkubator (Tabel 1). Dækglas kan opbevares 1 måned ved 4 ° C for før brug.
- Aflive en 7-dages gamle Sprague Dawley rotteafkommets i henhold til lokale etiske komité retningslinjer. Vi aflives unger bruger dislokation af halsen.
- Dissekere lillehjernen og læg den i en steril petriskål, som indeholder en fosfatbufferet salte (Oploesning B, tabel 3).
- Gentag trin 1,5 og 1,6 til 4-6 rotte unger.
- Cerebella bliver derefter placeret på den sterile fase af et McIlwain Tissue Chopper (Tabel 1). Væv er hakket på 375 μm mellemrum før dreje scenen gennem 90 ° og gentage processen.
- De hakkede cerebella overføres til en trypsin (Oploesning T, Tabel 4), der tidligere var blevet opvarmet til 37 ° C.
- Inkuber cerebella ved 37 ° C i 20 min med rolige bevægelser omkring hvert 5 min.
- Under tryptic fordøjelsen, tre sterile glas pipetter (Tabel 1) flamme polish med en Bunsen flamme. Brug flammen til at skabe en fin bar, et medium bar og en bred bar på de respektive munden af pipetter.
- Efter 20 min inkubation i opløsning T, tilsættes 20 ml trypsin / DNase-hæmmer (Oploesning W, tabel 5), at det cerebellare suspension og pellet celler på 1.000 g for 1 min i en bordplade centrifuge (Tabel 1).
- Dekanteres supernatanten og resuspender cellepelleten i 1,5 ml af en koncentreret trypsin / DNase hæmmer (opløsning C, tabel 6) ved hjælp af det bredeste bar pipette.
- Layer cellesuspensionen på toppen af 10 ml af en opvarmet (37 ° C), bovin serum albumin suppleret Earles Balanced Salt Solution (tabel 7) i en steril 15 ml rør.
- Centrifuger suspension til 5 min ved 1500 g og resuspender cellepelleten i 2 ml af forvarmet (37 ° C) naeringssubstrat (tabel 8).
- Skøn cellen nummeret ved hjælp af en haemocytometer (tabel 1) og fortynde cellesuspension til en endelig tæthed på 3,3 x 10 6 celler pr ml.
- Celler er belagt ved at tilsætte 75 μl af cellesuspensionen til midten af poly-D-lysin-belagte dækglas (endelig tæthed 2,5 x 10 5).
- Kulturen plader, der indeholder dækglas er placeret i CO 2 inkubator i 60 min, så cellerne til endhere.
- Tilsæt 1,5 ml af kultur medium til hver brønd og pas på ikke at forstyrre forgyldt celler og returnere den kultur plader til CO 2 inkubator.
- Den følgende dag vil erstatte dyrkningsmediet med frisk kultur medium suppleret med mitotiske hæmmer cytosin arabinosid (tabel 8). Denne anholdelser spredning af gliaceller i kultur.
2. Forsøgsopstilling
- Grundlæggende eksperimentel opstilling bør bestå af følgende (se tabel 1 og 9 for specifikt udstyr og software):
- Omvendt epi-fluorescens mikroskop
- Cooled CCD-kamera
- Fluorescerende lyskilde (monochromator eller filter hjul)
- Gravity perfusion apparater
- Imaging kammer med parallelle platin elektroder
- Elektrisk stimulator
- Computer
- Billede erhvervelse software
- Eksperimenter skal udføres i mørke eller under rødt lys conditions med et minimum af fluorescerende belysning af prøven for at undgå FM farvestof blegning.
- Forsøgene udføres ved stuetemperatur. Hvis fysiologiske temperatur er nødvendig, kan en temperatur-kontrolleret perfusion systemet skal bruges.
3. Prøveforberedelse
- Kulturer skal anvendes efter 8-12 dage in vitro.
- Overførsel af en enkelt dækglas til saltvand (tabel 10) i 10 min ved stuetemperatur, så stabilisering i nyt medie.
- Fjern dækglasset, tørre undersiden og området omkring den vedhæftede celler med et lille stykke køkkenrulle eller absorberende papir.
- Ved hjælp af silikone fedt (Tabel 2), dækglas lim på undersiden af imaging kammeret. Cellerne skal være mellem de to parallelle ledninger. Tilstrækkelig silikonefedt bør anvendes til helt at forsegle kammeret, men uden fedt ind i centrum af badet kammeret.
- Forsigtigt fylde badet kammeret med ~ 260 μl SAline løsning og derefter fylde input slangen med den samme løsning.
- Lim en ren dækglas med silikone fedt til toppen af kammeret at forsegle den. De input og output rør kan bruges til at fjerne eventuelle luftbobler fanget i kammeret. Det er vigtigt, at det elektriske kredsløb ikke afbrydes af luftbobler.
- Immobilise de billeddannende kammer i rustfrit stål, platform og tjekke for lækager ved forsigtigt perfusing saltvandsopløsning gennem input slangen.
- Monter de forsamlede kammeret på scenen af en omvendt mikroskop, og tilslut kammeret til en tyngdekraft perfusion system, først at have spædet fjorden med saltvandsopløsning.
- Vedhæft Tilslutningerne af kammeret til el-stimulator.
- Tilføj en dråbe fordybelse olie til målet, hvis en olie-linse anvendes. Fokus på cellerne i midten af kammeret ved hjælp af lyse felt belysning.
4. S1 Fase
- Perfuse neuroner med 1,5 mlaf FM-farvestof (Tabel 2) fortyndet i saltvand.
- Stimulere neuroner at fremkalde farvestof optagelse ved hjælp af vedlagte stimulator.
- Efter stimulation, at perfuse neuroner med frisk saltvand i 2 min vaske væk overskydende FM farvestof (flow 7 ml / min). Glial forurening i CGN kultur system er mindre end 5% 14, derfor er denne tidsramme er tilstrækkelig til at fjerne farvestof .
- Lad neuroner til at hvile i 8 min.
- I løbet af dette interval, find aksonal netværk, hvor de enkelte FM-dye-loaded nerveterminaler er synlige ved hjælp af fluorescein bølgelængder (excitation, 480 nm, emission,> 550 nm). Undgå områder med klynger af celler. Hold belysning til et minimum på dette trin, da intens irritation kan resultere i farvestof fototoksicitet. Tydelige tegn på dette er blebbing af axoner og manglende farvestof losning (på grund af farvestof fastsættelse).
- Re-fokus billedet umiddelbart før billedet overtagelsen, da en svag tendens kan være opstået under den daglige hviletid. Begynd time-lapse billede købet med en sats på 1 ramme hver 4 S.
- Efter opkøbet af 5 til 10 baseline billeder, fremkalder exocytose af RRP ved at levere en 30 Hz stimulation for 2 s (60 aktionspotentialer) 8 påbegynde stimulation manuelt umiddelbart efter frame capture..
- Efter at erhverve yderligere 10 billeder, fremkalder SV exocytose af RP ved hjælp af tre stimulationer på 40 Hz til 10 s (400 aktionspotentialer), hver 30 s fra hinanden 8.
- Erhverve en anden 5 til 10 billeder og derefter pause billede erhvervelse.
5. Recovery fase (se figur 2)
- Tillad neuroner til at inddrive over mindst 20 min.
- Valgfrit - Hvis effekten af et lægemiddel på endocytose skal testes, perfuse neuroner med narkotika løsning i denne periode (figur 2b) 3,8.
6. S2 Fase
- Gentag S1 fase-protokol (afsnit 4) til en kontrol eksperiment med de samme synsfelt somi S1.
- Valgfrit - Hvis effekten af et lægemiddel på endocytose skal testes, perfuse neuroner med lægemiddelkandidaten løsningen suppleret med FM-farve (figur 2b) 3,8.
- Valgfri - Alternativt, hvis lægemidlet virkninger på exocytose er af interesse, perfuse neuroner med lægemiddelkandidaten løsningen både før og under den vejl. udsalgspris og RP losning stimuli (Figur 2c) 3.
7. Dataanalyse
- Brug ImageJ og Microsoft Excel eller lignende software til dataanalyse.
- Til analyse, er en billedsekvens i stakken format påkrævet. Nogle imaging software kan eksportere sekvenser som enkelte billeder. Hvis dette er tilfældet, konvertere billeder til en stak ved hjælp af en ImageJ indbyggede funktion Image> Stakke> Billeder til stakken.
- Juster lysstyrke og kontrast i stakken for at maksimere det dynamiske område. Image> Juster> Lysstyrke / Kontrast (figur 3a).
- Hvis der betydelige horisontale drift er indtruffet i løbet af than eksperimentere, løbe StackReg ( http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/ ) og TurboReg ( http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/ ) plugins på ImageJ at afstemme billedstak (figur 3b) .
- Run Time Series Analyzer plugin ( http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/time-series.html ) (figur 3c).
- Definer områder af interesse (ROIs) over mindst 90 nerve terminaler. Disse bør være ens (cirkulær ROIs med 1,5 μm i diameter) Det er nyttigt at skifte mellem billederne før og efter farvestof losning til at afsløre aktiv nerveterminaler (alternativt en pre-stimulation billede kan trækkes fra en post-stimulation billede). En ideel ROI størrelse er en, der er lidt større end et typisk nerve terminal (figur 3c).
- Opnå den totale / integreret fluorescensintensitet for hver ROI i løbet af time og eksport til Microsoft Excel (figur 3d og 4a).
- Normalise ROI spor til samme vilkårlige værdi ved at rette spor i planet for Y-aksen for den første aflæsning stimulering i både S1 og S2 faser (Figur 4b-c). Dette er for at kontrollere for små variationer i baggrunden fluorescensintensitet.
- Mål absolutte fald i fluorescens fremkaldes ved hvert aflæsning stimulus i vilkårlig fluorescens enheder til S1 og S2 som følger (Figur 4d):
- RRP = Ændring i fluorescens (ΔF) udløses ved 30 Hz 2 S
- RP = Sum af ΔF udløst af 3 x 40 Hz 10 s
- Total genbrug pool = RRP + RP
- For hver relevant parameter i 7.9, beregnes den gennemsnitlige værdi over alle nerveterminaler af en enkelt eksperiment.
- Til statistisk analyse, middelværdier fra flere uafhængige forsøg kan beregnes. Antallet af dækglas snarere end antallet af nerveterminaler bør anvendes som STATISTISKl N.
8. Repræsentative resultater:
En kontrol eksperiment, hvor CGN gennemgik to runder af identiske lastning og losning trin er repræsenteret i figur 5. Når du begynder en serie af eksperimenter, er det vigtigt, at en kontrol eksperiment som dette udføres hver dag at bekræfte, at S1 og S2 er sammenlignelige før varierende eksperimentelle forhold under S2.
I dette eksempel blev CGN lastet med 10 ìm FM1-43 ved hjælp af en 80 Hz 10 s stimulation (figur 5a). Figur 5b viser FM1-43-lastet nerveterminaler repræsenteret ved fluorescerende puncta. ROIs blev defineret over 90 nerve terminaler, som vist i figur 5c. Det samme sæt ROIs blev brugt til både S1 og S2. Under begge losser, var den RRP første losning med en 30 Hz (2 s) stimulation efterfulgt af RP aflæsning med 3 sekventiel 40 Hz (10 s) stimuli (figur 5a). Fluorescens falde i løbet af hver stimulus kan tydeligt observeres og kvantificeres (figur 5d-e). Når undersøgt, fluorescens dråber, der svarer til den vejl. udsalgspris, var RP og total genbrug pulje sammenlignelige i både S1 og S2. Hertil kommer, boede 20% af genbrugspapir SVS i vejl. udsalgspris, mens 80% boede i RP i både S1 og S2.
Figur 1 Skematisk diagram af en typisk FM-eksperiment. A) SV endocytose udløses ved tilstedeværelse af FM-farvestof (repræsenteret i grøn). Farvestoffet er taget op af invaginating membran (enkelt SVS eller bulk endosomes). B) ikke-internaliserede dye på plasma membranen er skyllet væk af perfusion. C) på anmodning af en losning stimulus, mærket SVS, der er blevet tilgængelige for frigivelse sikring med plasma membranen resulterer i et tab af fluorescens. D) Ændringen i fluorescens (ΔF), som er proportional med mængden af frigivne mærket SVS derefter kan kvantificeres.
_upload/3143/3143fig2.jpg "/>
Figur 2 Skematisk tegning af mulige eksperimentelle protokoller. A) Flow diagram af et kontrolsystem eksperiment, hvor celler gennemgå to runder af FM farvestof lastning og losning (S1 og S2). Celler kan indlæses ved hjælp af en række forskellige stimuli. Aflæsning trin er identiske i, at RRP læsses med 30 Hz til 2 s efterfulgt af RP losse hjælp af 3 gange 40 Hz til 10 sek RRP og reserver pool losning stimuli var adskilt af 40 sek, alle andre stimuli med 30 sek. Celler er overladt til at inddrive i 20 min mellem S1 og S2. Rutediagrammer af mulige ændringer for at afprøve effekten af et stof på hver B) endocytose eller C) exocytose er også vist. Tilsvarende test lægemiddel kan perfunderet ind i kammeret under angivne perioder.
Figur 3 Screenshots af data analyse i Image J. Screenshots er vistfor A) lysstyrke og kontrast justering, B) ramme tilpasning, C) ROIs udvælgelse, og D) intensitet værdier ekstraktion med billede J.
Figur 4 Screenshots af dataanalyse i Microsoft Excel. Screenshots er vist for A) at importere rå data fra Billede J (1 st spalte = frame nummer, resterende kolonner = data fra de enkelte nerveender) B) justering af S1 baseline værdier (frame 10) til en vilkårlig værdi (200) ved starten af de første stimulus, c) tilpasning af S2 baseline værdier ved frame 55 ved hjælp af en identisk protokol til S1, og D) måling af fluorescens dråber ved hjælp af Microsoft Excel. Bemærk, at gennemsnit spor vist i D bruges til at definere tidspunkter før og efter hver dråbe. Størrelsen af fluorescensen dråber for hver ROI bør bestemmes fra værdier på regnearket er vist i C.
Figur 5. Repræsentativ kontrol eksperiment. A) Flow diagram af et kontrolsystem eksperiment, hvor CGN var læsset med 10μM FM1-43 med 80 Hz (10 s) stimulation. S1 og S2 faser er identiske. RRP og reserver pool losning stimuli var adskilt af 40 sek, alle andre stimuli med 30 sek. B) Et billede viser nerveterminaler læsset med FM1-43. C) Det samme billede som B viser 90 nummererede ROIs udvalgt til analyse. D) billeder af et område, afbildet med en rød boks i B på udvalgte tidspunkter. Basal = før stimulation, 30 Hz = efter 30 Hz 2 s stimulation, 40 Hz 1,2,3 = efter hver 40 Hz 10 s stimulation. Disse billeder er præsenteret i pseudocolor at illustrere ændringer i fluorescens (spektrum bar vises til højre). E) Middelværdi ± SEM spore fås fra 90 nerveender afbildet i C. Individuelle stimuli repræsenteres af vandrette søjler. Skala barer = 10 ìm.
Discussion
FM-farvestoffer er flittigt brugt til at undersøge nerveterminalreceptorer fungere i mange neuronal præparater. De har været ansat hovedsageligt til at overvåge omfanget af enten SV endocytose, SV omsætning eller kinetik exocytose 6. De beskrevne protokol udvider disse undersøgelser for at undersøge forskellen losning af specifikke SV pools. Dette giver yderligere oplysninger om genopfyldning af SV puljer og også deres omfanget af mobilisering.
FM-farvestoffer kan bruges til at mærke flere runder SV genanvendelse inden for samme nerve terminalerne. Vi har udnyttet denne ejendom og designet protokoller, hvor SV omsætning i hver terminal kan overvåges to gange i samme nerve terminalerne. Dette giver en nøjagtig intern kontrol, som er afgørende på grund af den heterogene karakter af SV genbrug parallelt nerveterminaler 11. Via brugen af S1 fase som en intern kontrol, påfyldning af RRP, RP og den samledeSV pool i overværelse af medicin kan opgøres pålideligt og direkte sammenlignes.
Ud over at give oplysninger i den absolutte størrelse af genbrug, under forskellige stimulation betingelser vejl. udsalgspris og RP puljer, kan denne protokol også levere data for følgende - 1) Den opdeling af SVS mellem den vejl. udsalgspris og RP som en funktion af genbrug pool til S1 og S2, 2) den relative størrelse af S2 puljer (vejl. udsalgspris og RP) som en funktion af samlet S1 genbrug pool og 3) den relative størrelse af en defineret SV pool i S2 som en funktion af den samme pulje i S1. Denne særlige protokollen, vil ikke give oplysninger om aflæsning kinetik dog siden overtagelsen tid er for langsom (for kinetisk målinger erhvervelse tider bør så hurtigt som muligt og aflæsning automatisk synkroniseret til billedoptagelse).
Vores 30 Hz 2 s stimuli fremkalder en identisk omfang af RRP losning til hypertoniske saccharose 8. Da størrelsen af RRPer defineret ved hypertonisk saccharose aflæsning 15, kan vi fastslå, at denne protokol losser alle RRP SVS, efter aftale med studier i hippocampus neuroner 16. Reserven pool er næsten helt forårsaget af tre tog af 400 stimuli (40 Hz 10 s hver), da denne stimulering losser et tilsvarende beløb af farvestof til et paradigme (2 stimuli med 50 mM KCl), at udtømning 95% af alle dye-mærkede SVS -8,17. Nøjagtig kvantificering af størrelsen af både RRP og reserver pool er også afhængig af at erhverve oplysninger inden for den lineære dynamiske område af CCD-kamera.
Denne enkle protokol kan også ændres yderligere. Styrken ved lastning stimuli kan også varieres for at bestemme, hvordan neuronal aktivitet og forskellige endocytose tilstande påvirker SV pool genopfyldning. Desuden kan mere end to cyklusser af lastning og losning også udføres, hvis det kræves. Denne protokol kan også bruges i celler transficeret med enten overekspression ellershRNA vektorer. På grund af den lave transfektion effektivitet primære neuronale kulturer, må udtrykte proteiner blive mærket med fluorescerende proteiner. Det er vigtigt, at disse fluorescerende tags ikke griber ind med FM-farve-signalet (brug cyan eller rød proteiner, for eksempel). I dette tilfælde kan nerveterminaler fra transficeret og ikke-transfekteret celler i samme synsfelt også sammenlignes som en ekstra kontrol 8. I sådanne forsøg en sammenligning af omfanget af lastning mellem S1 og S2 belastninger er af ringe værdi, da den forstyrrelse er til stede under begge belastninger. Opdeling af farvestof mellem SV puljer stadig kan visualiseres dog 8.
Genetiske journalister kaldte pHluorins kan også være ansat til at overvåge SV exocytose og endocytose i primære neuronale kultur. Disse sonder bruge en pH-følsom grønt fluorescerende protein til pH miljø luminale domæner tagged SV proteiner såsom VAMP, synaptophysin og VGLUT1 18 19. FM-dye tilgang, der er beskrevet her, har nogle fordele i forhold til pHluorin teknik, det første, FM-farvestoffer give oplysninger om, hvor SV endocytose tilstand fylder RRP og reservere pools 8. For det andet specifikke SV puljer kan være mærket med FM-farvestoffer, der har forskellige spektrale egenskaber, 20 og endelig er der intet krav om transfektion. FM-farvestoffer kan ikke give oplysninger om SV trafikken mellem hvile og genbrug SV puljer dog (i modsætning til pHluorins 19), da per definition SVS er nødt til at være belastet med farvestof under endocytose at være synlig. Således både FM-farvestoffer og pHluorins har styrker og svagheder og er mest magtfulde hvis det anvendes til uafhængige forsøg med at behandle det samme spørgsmål.
Billeder i høj kvalitet er afgørende for gyldige analyse og reproducible resultater. Mens vandret drift kan nemt rettes, kan forsøg, hvor der er et skred i Z-aksen ikke gendannes. Af denne grund er det vigtigt at re-fokusere billeder, før påbegyndelse af S1 og S2 losser. I tilfælde, hvor en betydelig fluorescerende forfald er indtruffet, kan der korrigeres for henfald (normalt ved at trække en tidligere optaget spor fra FM-loaded celler i fravær af stimulation). Dog foreslås det, at forfald korrektion kun udføres til grafisk repræsentation og ikke bruges til kvantitativ analyse.
Disclosures
Vi har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af en bevilling fra Wellcome Trust (Ref: 084277).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AxioCam MRm Rev. 3 Digital Camera | Carl Zeiss, Inc. | 4265099901000 | |
| Axio Observer.A1 Microscope | Carl Zeiss, Inc. | 4310040000000 | |
| Cell culture plates (6 wells) | Greiner Bio-One | 657160 | |
| Centrifuge (Universal 32R) | Hettich Zentrifugen | 1610 | |
| CO2 incubator | Heraeus Instruments | 51014042 | |
| Falcon tubes (15/50 ml) | Greiner Bio-One | 188271/210261 | |
| Fluar 20X /0.75 ∞/0.17 Objective | Carl Zeiss, Inc. | 4401459901000 | |
| Glass coverslips (25mm) | VWR international | 631-1584 | |
| Glass pasteur pipettes (230 nm) | Greiner Bio-One | 612-1799 | |
| Haemocytometer | VWR international | 15170-170 | |
| Imaging chamber | Warner Instruments | RC-21 BRFS | |
| Laminar flow hood | BIOHIT | VLF BHS 1200 | |
| McIlwain Tissue Chopper | Mickle Laboratory Engineering Co. Ltd. | MTC/2 | |
| Mercury lamp | Carl Zeiss, Inc. | HBO 103 | |
| MultiStim System Electrical Stimulator (100mV, 1ms pluse width) |  Digitimer Ltd. |
D330 | |
| Perfusion pump | Watson-Marlow Pumps Group | 313S | |
| Serological Pipettes (5/10/25 ml) | Greiner Bio-One | 606180/607180/760180 | |
| Shutter controller | Carl Zeiss, Inc. | MAC5000 | |
| Syringe (20 ml) | BD Biosciences | ST01-B002 | |
| Syringe Filters (Minisart -– 0.20 μm) | Sartorius AG | 16532 | |
| VC-6 Six Channel valve controller | Warner Instruments | 64-0135 | |
| YFP Filter set (Set 46) | Carl Zeiss, Inc. | 1196-681 | |
| Table 1. Specific equipment and apparatus used | |||
| FM1-43 | Cambridge BioScience | BT70021 | 10 μM |
| FM2-10 | Cambridge BioScience | BT70044 | 100 μM |
| Poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | P7886 | 15 μg/ml |
| Silicone grease | Sigma-Aldrich | 85403 | - |
| Table 2. Specific reagents used | |||
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A4503 | 0.3% |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | 0.25% |
| MgSO4·7H2O | Sigma-Aldrich | M2773 | 1.5 mM |
| D-PBS | GIBCO, by Life Technologies | 21300 | 960 mg/100 ml |
| -make 100ml fresh for each preparation -sterile filter before use |
|||
| Table 3. Solution B for CGN preparation | |||
| Solution B | 19 ml | ||
| Trypsin (5 mg/ml stock, -20°C) | Sigma-Aldrich | T9201 | 1 ml |
| Table 4. Solution T for CGN preparation | |||
| Solution C | 3.2 ml | ||
| Solution B | 16.8 ml | ||
| Table 5. Solution W for CGN preparation | |||
| Deoxyribonuclease (DNase, 500 U per 0.5 ml stock, -20°C) | Sigma-Aldrich | D5025 | 0.5 ml |
| MgSO4· 7H2O | Sigma-Aldrich | M2773 | 1.5 mM |
| Solution B | 10 ml | ||
| Soybean trypsin inhibitor (SBTI, 0.5 mg per 0.5 ml stock, -20°C) | Sigma-Aldrich | T9003 | 0.5 ml |
| Table 6. Solution C for CGN preparation | |||
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A4503 | 4% |
| Earle’s Balanced Salt Solution (EBSS) | GIBCO, by Life Technologies | 24010 | 10 ml |
| MgSO4· 7H2O | Sigma-Aldrich | M2773 | 3 mM |
| Table 7. EBSS Solution for CGN preparation | |||
| Cytosine β-D-arabinofuranoside (Ara-C) * | Sigma-Aldrich | C1768 | 10 μM |
| F–tal Bovine Serum | GIBCO, by Life Technologies | 10106 | 10 % |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | 30 mM |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G3126 | 2 mM |
| KCl | Sigma-Aldrich | P5405 | 25 mM |
| Minimal Essential Medium (MEM) | GIBCO, by Life Technologies | 21090 | 500 ml |
| Penicillin (P)/Streptomycin (S) | GIBCO, by Life Technologies | 15140 | 100 U/ml (P), 100 μg/ml (S) |
| *Ara-C should be added to medium from 1 DIV onwards | |||
| Table 8. Culture Media for CGN preparation | |||
| AxioVision Rel. | Carl Zeiss, Inc. | 4.8 | |
| ImageJ | National Institutes of Health | 1.42q | |
| Microsoft Excel | Microsoft | 2003 | |
| Table 9. Specific computer software used | |||
| CaCl2 · 2H2O | Sigma-Aldrich | C7902 | 1.3 mM |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | 5 mM |
| KCl | Sigma-Aldrich | P5405 | 3.5 mM |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P9791 | 0.4 mM |
| MgCl2·6H2O | Sigma-Aldrich | M0250 | 1.2 mM |
| NaCl | Fluka | 71378 | 170 mM |
| NaHCO3 | Fluka | 71627 | 5 mM |
| Na2SO4 | VWR | 10264 | 1.2 mM |
| TES | Sigma-Aldrich | T1375 | 20 mM |
| Table 10. Saline Solution (pH 7.4) | |||
References
- Rizzoli, S. O., Betz, W. J.
- Sudhof, T. C. The synaptic vesicle cycle revisited. Neuron. 28, 317-320 (2000).
- Evans, G. J., Cousin, M. A. Activity-dependent control of slow synaptic vesicle endocytosis by cyclin-dependent kinase 5. J. Neurosci. 27, 401-411 (2007).
- Clayton, E. L., Cousin, M. A. Differential labelling of bulk endocytosis in nerve terminals by FM dyes. Neurochem. Int. 53, 51-55 (2008).
- Clayton, E. L., Evans, G. J., Cousin, M. A. Bulk synaptic vesicle endocytosis is rapidly triggered during strong stimulation. J. Neurosci. 28, 6627-6632 (2008).
- Cousin, M. A. Use of FM1-43 and other derivatives to investigate neuronal function. Curr. Protoc. Neurosci. Chapter 2, Unit 2-Unit 2 (2008).
- Clayton, E. L. The phospho-dependent dynamin-syndapin interaction triggers activity-dependent bulk endocytosis of synaptic vesicles. J. Neurosci. 29, 7706-7717 (2009).
- Cheung, G., Jupp, O. J., Cousin, M. A. Activity-dependent bulk endocytosis and clathrin-dependent endocytosis replenish specific synaptic vesicle pools in central nerve terminals. J. Neurosci. 30, 8151-8161 (2010).
- Betz, W. J., Mao, F., Smith, C. B.
- Ryan, T. A., Reuter, H., Smith, S. J. Optical detection of a quantal presynaptic membrane turnover. Nature. 388, 478-482 (1997).
- Murthy, V. N., Sejnowski, T. J., Stevens, C. F. Heterogeneous release properties of visualized individual hippocampal synapses. Neuron. 18, 599-612 (1997).
- Tan, T. C. Cdk5 is essential for synaptic vesicle endocytosis. Nat. Cell. Biol. 5, 701-710 (2003).
- Anggono, V., Cousin, M. A., Robinson, P. J. Styryl dye-based synaptic vesicle recycling assay in cultured cerebellar granule neurons. Methods. Mol. Biol. 457, 333-345 (2008).
- Gallo, V. Selective release of glutamate from cerebellar granule cells differentiating in culture. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 79, 7919-7923 (1982).
- Stevens, C. F. Neurotransmitter release at central synapses. Neuron. 40, 381-388 (2003).
- Mozhayeva, M. G. Development of vesicle pools during maturation of hippocampal synapses. J. Neurosci. 22, 654-665 (2002).
- Cousin, M. A., Evans, G. J. O. Activation of silent and weak synapses by cAMP-dependent protein kinase in cultured cerebellar granule neurons. J. Physiol. 589, 1943-1955 (2011).
- Kim, S. H., Ryan, T. A. Synaptic vesicle recycling at CNS synapses without AP-2. J. Neurosci. 29, 3865-3874 (2009).
- Kim, S. H., Ryan, T. A. Cdk5 serves as a major control point in neurotransmitter release. Neuron. 67, 797-809 (2010).
- Groemer, T. W., Klingauf, J. Synaptic vesicles recycling spontaneously and during activity belong to the same pool. Nat. Neurosci. 10, 145-147 (2007).
