Summary
ووصفت العيش تقنية التصوير مضان لقياس التجديد وتعبئة حويصلة متشابك محددة (SV) مجمعات في المحطات العصبية المركزية. ويتم رصد جولتين من إعادة التدوير في محطات SV العصب نفسه توفير الرقابة الداخلية.
Abstract
بعد الافراج العصبي في المحطات العصبية المركزية ، ويتم استردادها بسرعة بواسطة مركبة فضاء الإلتقام. ثم يتم تعبئتها مع مركبة فضاء استرجاع العصبي والانضمام إلى التجمع إعادة التدوير ، على النحو المحدد مركبة فضاء التي تتوفر ل1،2 إيماس. عموما يمكن إعادة تدوير تجمع تقسم الى قسمين حمامات متميزة -- تجمع نشره بسهولة (RRP) ، وتجمع إماراتي (RP). كما يعني أسمائهم ، ويتكون من مركبة فضاء RRP التي يتم على الفور المتاحة للاندماج في حين يتم إطلاق مركبة فضاء RP 1،2 فقط خلال التحفيز مكثفة. فمن المهم أن يكون هناك فحص تقارير موثوقة تفيد بأن عملية التجديد هذه الفرق حمامات SV من أجل فهم 1) كيف مركبة فضاء بعد مرور أنماط مختلفة من الإلتقام (مثل clathrin التي تعتمد على الإلتقام والنشاط التي تعتمد على الإلتقام بالجملة) و 2) الآليات السيطرة على تعبئة RRP على حد سواء وRP استجابة لمحفزات مختلفة.
الأصباغ وزير الخارجية وتوظف بشكل روتينياد تقرير لدوران SV كميا في المحطات العصب المركزي 3-8. لديهم ذيل مسعور المحروقات التي تسمح بتقسيم عكسها في طبقة ثنائية المادة الدهنية ، ورئيس المجموعة للماء الذي يمنع المرور عبر الأغشية. الأصباغ ومضان قليلا في محلول مائي ، ولكن عوائدها الكم يزيد بشكل كبير في الغشاء عند تقسيم 9. هكذا هي الأصباغ FM تحقيقات الفلورسنت مثالية لتتبع بنشاط إعادة التدوير مركبة فضاء. البروتوكول القياسي للاستخدام صبغة FM هي على النحو التالي. الأولى هي تطبيقها على الخلايا العصبية ويتم تناولها خلال الإلتقام (الشكل 1). بعد غسلها غير المنضوية صبغة بعيدا عن غشاء البلازما وإعادة تدويرها ، إعادة توزيع داخل مركبة فضاء تجمع إعادة التدوير. ونضبت ثم باستخدام هذه المحفزات تفريغ مركبة فضاء (الشكل 1). منذ FM صبغة وسم مركبة فضاء غير كمي 10 ، وتراجع الناتج مضان يتناسب مع كمية من الحويصلات الافراج عنهم. وهكذا ، ولدت إعادة التدوير وانصهار مركبة فضاء من العلاقات العامةويمكن لجولة evious الإلتقام كميا بشكل موثوق به.
هنا ، نقدم البروتوكول الذي تم تعديله للحصول على عنصرين إضافية للمعلومات. أولا ، يتم استخدام المنبهات متتابعة التفريغ لتفريغ بالتفاوت في RRP وRP ، والسماح الكمي لتجديد حمامات SV محددة. ثانيا ، كل محطة يمر العصب البروتوكول مرتين. وبالتالي ، يمكن مقارنة استجابة العصب نفسه في محطة S1 ضد الوجود من مادة الاختبار في المرحلة S2 (الشكل 2) ، وتوفير الرقابة الداخلية. هذا هو المهم ، لأن مدى إعادة التدوير SV عبر محطات مختلفة العصب هو متغير جدا 11.
ويمكن استخدام أي ملتصقة الثقافات العصبية الأساسي لهذا البروتوكول ، ولكن يتم تحسين كثافة الطلاء والحلول والشروط لتحفيز الخلايا العصبية الحبيبية للدماغ (CGNs) 12،13.
Protocol
1. مخيخي إعداد الحبيبة الخلية العصبية
- الأوتوكلاف حوالي 100 25 coverslips مم (الجدول 1).
- coverslips مكان في أنبوب العقيمة التي تحتوي على 50 مل العقيمة بولي - D - يسين الحل (الجدول 2). مكان على منصة الرئاسة الدورية لمدة 2 ساعة إلى معطف coverslips.
- مغلفة coverslips الجاف على المناديل الورقية المعقمة في التدفق الصفحي هود (الجدول 1).
- ويمكن تخزين coverslips المكان الى لوحات 6 معقمة وكذلك Coverslips دافئة في حاضنة ثاني أكسيد الكربون 2 (الجدول 1). : 1 درجة مئوية في شهر 4 لقبل الاستخدام.
- الموت ببطء على 7 ايام العمر فأر سبراغ داولي الجرو المحلية وفقا لمبادئ توجيهية لجنة أخلاقية. الموت الرحيم نحن الجراء به خلع عنق الرحم.
- تشريح المخيخ ووضعه في طبق بتري معقمة تحتوي على أملاح الفوسفات مخزنة الحل (حل باء ، الجدول 3).
- كرر الخطوات من 1.5 و 1.6 لأنواع الجرذان 4-6.
- ثم توضع على المسرح مخيخات العقيمة من الأنسجة تشو McIlwainpper (الجدول 1). غير مقطعة الأنسجة في 375 ميكرون قبل فترات تناوب 90 درجة خلال مرحلة وتكرار هذه العملية.
- يتم نقل مخيخات المفروم في حل التربسين (حل T ، الجدول 4) الذي سبق أن تحسنت إلى 37 درجة مئوية.
- احتضان مخيخات عند 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة مع الانفعالات طيف تقريبا كل 5 دقائق.
- خلال عملية الهضم زيتية ، لهب تلميع الزجاج three ماصات معقمة (الجدول 1) باستخدام لهب بنسن. استخدام الشعلة لخلق تحمل غرامة ، وتحمل المتوسطة وتحملت واسعة في أفواه كل من ماصات.
- بعد 20 دقيقة في حضانة تي الحل ، إضافة 20 مل من محلول مثبط التربسين / الدناز (حل W ، الجدول 5) إلى تعليق مخيخي والخلايا بيليه في 1000 ز 1 دقيقة للطرد المركزي في الفوق (الجدول 1).
- صب وطاف وresuspend الكرية الخلية في 1.5 مل من مثبط التربسين / الدناز مركزة (حل C ، الجدول 6) باستخدام أوسع ماصة تتحمل.
- طبقة وقف على رأس خلية 10 مل من prewarmed (37 درجة مئوية) ألبومين المصل البقري تستكمل إيرلز الحل المتوازن الأملاح (الجدول 7) في أنبوب 15 مل العقيمة.
- تعليق الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 1500 ز وresuspend الكرية خلية في ملل 2 من prewarmed (37 درجة مئوية) مستنبت (الجدول 8).
- تقدير عدد الخلايا باستخدام haemocytometer (الجدول 1) ، وتمييع تعليق خلية إلى الكثافة النهائية من 3.3 X 10 في الخلايا 6 مل.
- ومطلي الخلايا بإضافة 75 ميكرولتر من تعليق الخلية إلى مركز بولي - D - يسين المغلفة coverslips (الكثافة النهائية 2.5 × 10 5).
- يتم وضع لوحات تحتوي على ثقافة coverslips في الحاضنة لمدة 60 CO 2 دقيقة للسماح للخلايا إلىديري.
- إضافة 1.5ml المتوسطة الثقافة في اتخاذ كل جانب الحرص على عدم تعكير صفو الخلايا مطلي والعودة لوحات الثقافة الحاضنة 2 CO.
- في اليوم التالي استبدل متوسطة الثقافة مع ثقافة جديدة تستكمل المتوسطة مع الأرابينوزيد مثبط الإنقسامية السيتوزين (الجدول 8). هذا الانتشار من الخلايا الدبقية الاعتقالات في الثقافة.
2. إعداد التجريبية
- وينبغي الإعداد التجريبية الأساسية تتكون من ما يلي (انظر الجدولين 1 و 9 للمعدات والبرمجيات المستخدمة محددة) :
- المقلوب EPI - مضان المجهر
- تبريد الكاميرا CCD
- مصدر ضوء الفلورسنت (مستوحد اللون أو عجلة فلتر)
- خطورة جهاز نضح
- غرفة التصوير مع أقطاب البلاتين موازية
- محفز كهربائي
- الكمبيوتر
- صورة اقتناء البرمجيات
- يجب أن يتم تنفيذ التجارب في الظلام أو تحت ضوء أحمر كوندإنارة الفلورسنت itions مع الحد الأدنى من العينة لتجنب صبغ FM التبييض.
- وتجرى التجارب في درجة حرارة الغرفة. إذا كان المطلوب درجة الحرارة الفسيولوجية ، يمكن استخدام نظام الارواء درجة الحرارة التي تسيطر عليها.
3. تحضير العينة
- وينبغي أن تستخدم بعد 8-12 أيام الثقافات في المختبر.
- نقل ساترة واحد لمحلول ملحي (الجدول 10) لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة للسماح للاستقرار في الوسيلة الجديدة.
- إزالة ساترة ، الجافة السفلي والمنطقة المحيطة بها الخلايا المرفقة مع قطعة صغيرة من الورق منشفة ورقية أو ماصة.
- استخدام الشحوم سيليكون (الجدول 2) ، ساترة الغراء على الجانب السفلي من غرفة التصوير. وينبغي أن يكون بين الخلايا السلكين موازية. وينبغي أن تستخدم ما يكفي من الشحوم سيليكون تماما لاغلاق الغرفة ولكن من دون أي تدخل الشحوم في وسط غرفة الحمام.
- ملء بلطف مع غرفة حمام سا 260 ميكروليتر ~الحل السطر ثم ملء أنابيب الإدخال مع نفس الحل.
- الغراء a ساترة نظيفة مع الشحوم سيليكون إلى الأعلى للغرفة لختم عليها. يمكن استخدام أنابيب الإدخال والإخراج لإزالة أي فقاعات الهواء المحبوس في غرفة ، ومن المهم أن لا تنقطع الدائرة الكهربائية عن طريق فقاعات الهواء.
- Immobilise غرفة التصوير في منصة الفولاذ المقاوم للصدأ والتحقق من التسريبات التي perfusing بلطف محلول ملحي من خلال أنابيب الإدخال.
- جبل غرفة تجميعها في مرحلة مجهر مقلوب ، وتوصيلها إلى غرفة الجاذبية نظام التروية ، حيث تستعد لأول مرة مدخل مع محلول ملحي.
- نعلق ربط الاسلاك من الغرفة إلى محفز كهربائي.
- إضافة قطرة من النفط الانغماس في تحقيق الهدف إذا تم استخدام عدسة النفط. التركيز على الخلايا في منتصف الغرفة باستخدام الإضاءة الساطعة الميدان.
4. المرحلة S1
- يروي الخلايا العصبية مع 1.5 ملمن FM صبغ (الجدول 2) في محلول ملحي مخفف.
- تحفز الخلايا العصبية لاستحضار امتصاص الصبغة باستخدام منشط المرفقة.
- بعد التحفيز ، يروي الخلايا العصبية مع محلول ملحي الطازجة لمدة 2 دقيقة ليغسل الزائدة FM صبغ (معدل تدفق 7 مل / دقيقة). التلوث الدبقية في CGN نظام الثقافة هي أقل من 5 ٪ 14 ، وبالتالي هذا الإطار الزمني كافية لإزالة الصبغة .
- ترك الخلايا العصبية للراحة لمدة 8 دقائق.
- خلال هذا الفاصل الزمني ، موقع الشبكات محواري حيث الفردية محطات FM العصب صبغ محملة مرئية باستخدام موجات فلوريسئين (الإثارة و 480 نانومتر ؛ الانبعاثات ،> 550 نانومتر). تجنب المناطق مع مجموعات من الخلايا. احتفظ الإضاءة إلى الحد الأدنى في هذه الخطوة ، لأن الإثارة الشديدة يمكن أن تؤدي إلى صبغ الضيائية. علامات واضحة لهذا النوع من blebbing المحاور وعدم وجود صبغة التفريغ (نتيجة لتحديد الصبغة).
- إعادة تركيز الصورة على الفور قبل الحصول على الصور منذ ذلك الحين قد الانجراف طفيفة حدثت أثناء فترة الراحة. تبدأ الوقت الفاصل بين الحصول على الصور بمعدل من 1 الإطار كل ثانية 4
- بعد الحصول على 5 -- الصور الأساس 10 ، تستحضر إيماس من RRP من خلال تقديم 30 لتحفيز هرتز 2 ثانية (إمكانات العمل 60) 8 إشرع التحفيز على الفور يدويا بعد التقاط الإطار.
- بعد الحصول على آخر 10 صور ، تستحضر إيماس SV من البرنامج العادي باستخدام ثلاثة التحفيز من 40 هرتز لمدة 10 ثانية (إمكانات العمل 400) ، كل 30 ثانية بغض النظر 8.
- الحصول على آخر 5-10 الصور وقفة ثم الحصول على الصور.
5. المرحلة الاسترداد (انظر الشكل 2)
- تسمح الخلايا العصبية لاسترداد أكثر من 20 دقيقة على الأقل.
- اختياري -- إذا كان أثر المخدرات على الإلتقام أن يكون اختبارها ، يروي الخلايا العصبية مع الحل المخدرات خلال هذه الفترة (الشكل 2B) 3،8.
6. المرحلة S2
- كرر S1 بروتوكول المرحلة (القسم 4) لتجربة التحكم باستخدام نفس المجال من حيث عرضفي S1.
- اختياري -- إذا كان أثر المخدرات على الإلتقام أن يكون اختبارها ، يروي الخلايا العصبية مع الحل المخدرات تستكمل مع صبغة FM (الشكل 2B) 3،8.
- اختياري -- إذا كان بدلا من آثار المخدرات على إيماس تهم ، يروي الخلايا العصبية مع الحل المخدرات على حد سواء قبل وأثناء وRRP RP المحفزات التفريغ (الشكل 2C) 3.
7. تحليل البيانات
- استخدام ImageJ و Microsoft Excel أو برنامج مشابه لتحليل البيانات.
- للتحليل ، هناك حاجة إلى تسلسل الصور في شكل كومة. قد تكون بعض برامج التصوير تصدير تسلسل كصور واحد. إذا كان هذا هو الحال ، تحويل الصور إلى كومة باستخدام ImageJ المدمج في صورة وظيفة> مداخن> صور لالمكدس.
- ضبط السطوع والتباين من المكدس لتعظيم المدى الديناميكي. صورة> ضبط> السطوع / التباين (الشكل 3A).
- إذا حدث الانحراف الأفقي كبيرة خلال رانه تجربة تشغيل StackReg ( http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/ ) وTurboReg ( http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/ ) الإضافات على ImageJ المكدس لمحاذاة الصورة (الشكل 3B) .
- تشغيل سلسلة من الزمن المساعد محلل ( http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/time-series.html ) (الشكل 3C).
- تحديد المناطق ذات الأهمية (رويس) على مدى لا يقل عن 90 محطات العصبية. وينبغي أن تكون هذه متطابقة (رويس دائرية قطرها ميكرون 1.5) ومن المفيد للتبديل بين الصور قبل وبعد صبغ التفريغ للكشف عن محطات العصبية نشطة (بدلا من ذلك لتحفيز مسبقا ويمكن طرح صورة من الصور ما بعد التحفيز). مثالية دوروا واحد هو أن حجم أكبر بقليل من محطة العصب نموذجي (الشكل 3C).
- الحصول على كثافة الكل / مضان متكاملة لكل عائد الاستثمار على تيمه وتصدير إلى Microsoft Excel (الشكل 3D و4A).
- Normalise آثار دوروا على القيمة التعسفي نفسه عن طريق مواءمة آثار في الطائرة من المحور Y لتحفيز first التفريغ في مراحل السواء S1 S2 و (الشكل 4B - C) ، وهذا هو السيطرة على الاختلافات الطفيفة في كثافة مضان الخلفية.
- قياس انخفاض مطلق في كل مضان أثار التحفيز التفريغ في وحدات التعسفي لمضان S1 S2 وعلى النحو التالي (الشكل 4D) :
- RRP = التغيير في مضان (ΔF) نجمت عن 30 ثانية 2 هرتز
- أثار RP = مجموع ΔF بنسبة 3 × 40 ق 10 هرتز
- مجموع بركة التدوير RRP = + RP
- لكل معلمة ذات الصلة في 7.9 ، وحساب قيمة يعني على كل المحطات عصب تجربة واحدة.
- للتحليل الإحصائي ، يعني يمكن أن يكون متوسط القيم التي تم الحصول عليها من تجارب مستقلة متعددة. وينبغي استخدام عدد coverslips بدلا من عدد من المحطات العصبية كما statisticaل ن.
8. ممثل النتائج :
وتمثل تجربة السيطرة حيث خضع CGNs جولتين من خطوات التحميل والتفريغ متطابقة في الشكل 5. عندما تبدأ سلسلة من التجارب ، فمن الضروري أن يتم تنفيذ تجربة تحكم مثل هذا كل يوم للتأكد من أن S1 S2 وقابلة للمقارنة قبل متفاوتة الظروف التجريبية خلال S2.
في هذا المثال ، كانت محملة ب 10 ميكرومتر CGNs FM1 - 43 باستخدام 80 هرتز التحفيز ق 10 (الشكل 5A). يوضح الشكل 5B محطات العصب FM1 - 43 - تحميل يمثله نقاط والفلورية. وقد تم تحديد محطات رويس على العصب 90 كما هو مبين في الشكل 5C. تم استخدام نفس مجموعة رويس لكلا S1 و S2. افرغت خلال كلا ، لم تفرغ أولا RRP مع هرتز 30 (2) مفتاحية التحفيز تليها RP التفريغ مع 3 40Hz المتسلسل (10 ق) المنبهات (الشكل 5A). يمكن أن يكون انخفاض مضان خلال كل الحوافز لوحظ بشكل واضح وكميا (الشكل 5D - ه). وكان مجموع RP بركة التدوير عند فحصها ، ومضان قطرات المقابلة لRRP وقابلة للمقارنة في كل من S1 و S2. بالإضافة إلى ذلك ، يقيم 20 ٪ من مركبة فضاء المعاد تدويرها في RRP بينما 80 ٪ يقيمون في البرنامج العادي في كل من S1 و S2.
رسم تخطيطي الرقم 1 من التجربة ، وزير الخارجية نموذجي. أ) يتم تشغيل SV الإلتقام في حضور وزير الخارجية صبغ (ممثلة باللون الأخضر). يتم أخذ صبغة بنسبة غشاء invaginating (مركبة فضاء واحدة أو الإندوسومات بالجملة). يغسل ب) عدم صبغ المنضوية في غشاء البلازما بعيدا التروية. C) بناء على طلب من حافز التفريغ ، المسمى مركبة فضاء التي أصبحت متاحة لإطلاق فتيل مع غشاء البلازما مما أدى إلى فقدان مضان. يمكن D) ، ثم التغيير في مضان (ΔF) الذي يتناسب مع كمية سراح المسمى مركبة فضاء يمكن قياسها كميا.
_upload/3143/3143fig2.jpg "/>
الشكل 2 المخططات تخطيطي بروتوكولات تجريبية ممكن. أ) تدفق الرسم البياني لتجربة مراقبة الخلايا حيث يخضع جولتين من صبغ FM التحميل والتفريغ (S1 S2 و). يمكن تحميل الخلايا باستخدام مجموعة من المحفزات المختلفة. خطوات مماثلة في التفريغ التي يتم تفريغها في RRP مع 30 هرتز لمدة 2 ق تليها RP تفريغ به 3 مرات 40 هرتز لمدة 10 ثانية. تم فصل RRP والاحتياطي تجمع المحفزات التفريغ بنسبة 40 ثانية ، وجميع المحفزات الأخرى بنسبة 30 ثانية. يتم ترك الخلايا لاستعادة لمدة 20 دقيقة بين S1 و S2. وتبين ايضا مخططات تدفق التعديلات الممكنة لاختبار تأثير مادة على أي B) الإلتقام أو C) إيماس. ويمكن اختبار المخدرات perfused المناظرة في الغرفة خلال الفترات المشار إليها.
وتظهر لقطات من الشكل 3 تحليل البيانات في صورة J. قطاتلوالسطوع) وتعديل التباين ، B) محاذاة الإطار ، C) واختيار رويس ، ودال) استخلاص قيم الكثافة باستخدام صورة J.
الشكل 4 لقطات من تحليل البيانات في Microsoft Excel. وتظهر لقطات لأ) استيراد البيانات الخام من J صورة (1 ش = عمود عدد الإطار ، والأعمدة المتبقية = البيانات من محطات العصبية الفردية) B) تعديل القيم الأساسية S1 (اف 10) إلى قيمة التعسفي (200) في بداية من الحافز الأول ، C) تعديل القيم الأساسية في إطار S2 55 باستخدام بروتوكول مطابقة لS1 ، و D) قياس قطرات مضان باستخدام Microsoft Excel. علما أنه يتم استخدام التتبع متوسط هو موضح في D لتحديد نقاط زمنية قبل وبعد كل قطرة. وينبغي تحديد حجم قطرات مضان لكل من العائد على الاستثمار القيم على جدول يظهر في C.
الشكل 5. ممثل السيطرة التجربة. أ) تدفق الرسم البياني لتجربة الرقابة حيث تم تحميل CGNs مع 10μM FM1 - 43 باستخدام 80 هرتز (10 ق) التحفيز. مراحل S1 S2 ومتطابقة. تم فصل RRP والاحتياطي تجمع المحفزات التفريغ بنسبة 40 ثانية ، وجميع المحفزات الأخرى بنسبة 30 ثانية. ب) صورة تظهر الأعصاب الطرفية محملة FM1 - 43. C) صورة تظهر نفس B 90 مرقمة رويس المختارة للتحليل. د) صور من منطقة صورت من قبل في مربع أحمر B في نقاط زمنية محددة. = القاعدية قبل التحفيز و 30 هرتز = بعد 30 هرتز 2 ثانية التحفيز و 40 هرتز = 1،2،3 بعد كل التحفيز 40 هرتز 10 ثانية. وتعرض هذه الصور في pseudocolor لتوضيح التغيرات في مضان (شريط الطيف المعروضة على اليمين). E) تمثل متوسط ± SEM التتبع الحصول عليها من محطات العصب صورت في 90 جيم المحفزات الفردية بواسطة قضبان أفقية. أشرطة النطاق = 10 ميكرون.
Discussion
وتستخدم على نطاق واسع الأصباغ وزير الخارجية للتحقيق في وظيفة الأعصاب الطرفية في الاستعدادات العصبية كثيرة. وقد استخدمت بصورة رئيسية لرصد مدى إما الإلتقام SV ، دوران SV أو حركية إيماس 6. بروتوكول صفها تمتد هذه الدراسات لدراسة الفرق تفريغ أحواض SV محددة. وهذا يوفر معلومات إضافية بخصوص تجديد حمامات SV وكذلك مداها التعبئة.
ويمكن استخدام الأصباغ وزير الخارجية لتسمية جولات متعددة من إعادة التدوير في محطات SV العصب نفسه. استغلت هذه الخاصية ونحن تصميم البروتوكولات التي يمكن رصدها SV دوران في كل محطة طرفية مرتين في العصب نفسه. هذا يتيح مراقبة دقيقة الداخلية ، وهو أمر ضروري نظرا للطبيعة غير متجانسة من إعادة التدوير في محطات SV العصبية الموازية 11. عبر استخدام المرحلة S1 باعتبارها الرقابة الداخلية ، وإعادة تعبئتها من RRP ، RP واجمالىيمكن SV تجمع في وجود مخدرات موثوق بها ومباشرة مقارنة.
بالإضافة إلى توفير المعلومات عن حجم المطلقة لإعادة التدوير ، وRRP RP حمامات التحفيز في ظل ظروف مختلفة ، ويمكن لهذا البروتوكول أيضا توفير البيانات عن بعد -- 1) وتقسيم بين مركبة فضاء وRRP RP بوصفها وظيفة من تجمع التدوير ل2 ، S1 و S2) الحجم النسبي للحمامات S2 (RRP وRP) بوصفها وظيفة من مجموع بركة التدوير S1 و 3) الحجم النسبي في أي تجمع SV المعرفة في S2 بوصفها وظيفة من نفس المجموعة في S1. وهذا البروتوكول ولا سيما عدم تقديم معلومات عن حركية التفريغ ولكن ، منذ ذلك الوقت اقتناء بطيء جدا (لقياس الحركية مرات الاستحواذ يجب أن يكون سريعا بقدر الإمكان والتفريغ تلقائيا مزامنة لالتقاط الصورة).
لدينا 30 هرتز 2 المحفزات ليالي يستحضر حد ما متطابقة من RRP التفريغ لالسكروز مفرط التوتر 8. منذ حجم RRPتم تعريفها بواسطة السكروز مفرط التوتر تفريغ 15 ، يمكننا أن نقول أن هذا البروتوكول افرغت كل مركبة فضاء RRP ، بالاتفاق مع الخلايا العصبية في قرن آمون الدراسات 16. تماما تقريبا استنزاف الاحتياطي التي تجمع ثلاثة قطارات من 400 المنبهات (40 هرتز كل 10 ثانية) منذ هذا التحفيز افرغت مبلغ مماثل من صبغ لنموذج (2 المحفزات مع بوكل 50 مم) التي تستنزف 95 ٪ من جميع مركبة فضاء صبغ المسمى 8،17. تقدير دقيق لحجم RRP على حد سواء وحمام سباحة احتياطي يعتمد أيضا على الحصول على المعلومات ضمن مجموعة ديناميكية الخطية للكاميرا CCD.
ويمكن أيضا أن يكون هذا البروتوكول بسيطة مزيد من التعديل. يمكن أيضا أن قوة من المحفزات التحميل تكون متنوعة لتحديد مدى نشاط الخلايا العصبية وطرق مختلفة تؤثر الإلتقام SV تجديد حوض السباحة. وعلاوة على ذلك ، يمكن أيضا أكبر من دورتين من التحميل والتفريغ أن يؤديها إذا لزم الأمر. ويمكن أيضا أن تستخدم هذا البروتوكول في خلايا transfected إما مع أو overexpressionناقلات shRNA. نظرا لانخفاض كفاءة ترنسفكأيشن الثقافات العصبية الأولية ، لا بد من البروتينات وأعرب المفتاحية مع البروتينات الفلورية. فمن الضروري أن هذه العلامات الفلورية لا تتداخل مع الإشارة صبغ FM (سماوي أو استخدام البروتينات الحمراء ، على سبيل المثال). في هذه الحالة ، يمكن أيضا من الخلايا العصبية الطرفية وغير transfected transfected في نفس الحقل للعرض يمكن مقارنة كعنصر تحكم إضافية 8. في مثل هذه التجارب المقارنة بين مدى التحميل بين الاحمال وS1 S2 غير ذات قيمة تذكر ، لأن وجود اضطراب في كلتا الأحمال. يمكن تقسيم بين صبغ أحواض SV يزال من الممكن تصور ولكن 8.
ودعا الصحفيين وراثية ويمكن أيضا أن تستخدم لpHluorins رصد إيماس SV الإلتقام في الثقافة والعصبية الأولية. هذه التحقيقات استخدام درجة الحموضة حساسة للبروتين الفلورية الخضراء للبيئة درجة الحموضة من المجالات اللمعية من البروتينات SV المفتاحية مثل VAMP ، وsynaptophysin VGLUT1 18 19. النهج FM - صبغة تستند الموصوفة هنا لديه بعض المزايا على أسلوب pHluorin ، أولا ، والأصباغ وزير الخارجية تقديم معلومات عن الوضع الذي SV الإلتقام تغذي RRP وبرك الاحتياطي 8. ويمكن تسمية محددة ثانيا حمامات SV FM مع الأصباغ التي لها خصائص مختلفة الأطياف 20 وأخيرا لا يوجد أي شرط لترنسفكأيشن. يمكن الأصباغ وزير الخارجية لا توفر معلومات عن حركة المرور SV بين الراحة وإعادة تدوير حمامات SV لكن (على النقيض من pHluorins 19) ، ومنذ ذلك الحين مركبة فضاء التعريف يجب أن تكون محملة صبغ خلال الإلتقام أن تكون مرئية. وبالتالي كل من وزير الخارجية والأصباغ pHluorins لها من القوة والضعف وأقوى عندما تستخدم في تجارب مستقلة لمعالجة مسألة واحدة.
صور عالية الجودة ضرورية للتحليل صحيح وreproducibالنتائج جنيه. في حين يمكن بسهولة تصحيح الانحراف الأفقي ، لا يمكن أن التجارب التي يوجد فيها انحراف في المحور Z يمكن استردادها. لهذا السبب ، فإنه من الأهمية بمكان إعادة تركيز الصور قبل البدء S1 و S2 افرغت. في الحالات عندما تسوس كبيرة الفلورسنت حدث ، يجوز تطبيق التصحيحات تسوس (عادة من خلال طرح تتبع المسجلة مسبقا من وزير الخارجية محملة الخلايا في غياب التحفيز). ومع ذلك ، فمن المقترح أن يتم تنفيذ سوى تصحيح تسوس لتمثيل رسومي وليس لاستخدامها في أي تحليل كمي.
Disclosures
ليس لدينا شيء في الكشف عنها.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل عن طريق منحة مقدمة من ويلكوم ترست (المرجع : 084277).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AxioCam MRm Rev. 3 Digital Camera | Carl Zeiss, Inc. | 4265099901000 | |
| Axio Observer.A1 Microscope | Carl Zeiss, Inc. | 4310040000000 | |
| Cell culture plates (6 wells) | Greiner Bio-One | 657160 | |
| Centrifuge (Universal 32R) | Hettich Zentrifugen | 1610 | |
| CO2 incubator | Heraeus Instruments | 51014042 | |
| Falcon tubes (15/50 ml) | Greiner Bio-One | 188271/210261 | |
| Fluar 20X /0.75 ∞/0.17 Objective | Carl Zeiss, Inc. | 4401459901000 | |
| Glass coverslips (25mm) | VWR international | 631-1584 | |
| Glass pasteur pipettes (230 nm) | Greiner Bio-One | 612-1799 | |
| Haemocytometer | VWR international | 15170-170 | |
| Imaging chamber | Warner Instruments | RC-21 BRFS | |
| Laminar flow hood | BIOHIT | VLF BHS 1200 | |
| McIlwain Tissue Chopper | Mickle Laboratory Engineering Co. Ltd. | MTC/2 | |
| Mercury lamp | Carl Zeiss, Inc. | HBO 103 | |
| MultiStim System Electrical Stimulator (100mV, 1ms pluse width) |  Digitimer Ltd. |
D330 | |
| Perfusion pump | Watson-Marlow Pumps Group | 313S | |
| Serological Pipettes (5/10/25 ml) | Greiner Bio-One | 606180/607180/760180 | |
| Shutter controller | Carl Zeiss, Inc. | MAC5000 | |
| Syringe (20 ml) | BD Biosciences | ST01-B002 | |
| Syringe Filters (Minisart -– 0.20 μm) | Sartorius AG | 16532 | |
| VC-6 Six Channel valve controller | Warner Instruments | 64-0135 | |
| YFP Filter set (Set 46) | Carl Zeiss, Inc. | 1196-681 | |
| Table 1. Specific equipment and apparatus used | |||
| FM1-43 | Cambridge BioScience | BT70021 | 10 μM |
| FM2-10 | Cambridge BioScience | BT70044 | 100 μM |
| Poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | P7886 | 15 μg/ml |
| Silicone grease | Sigma-Aldrich | 85403 | - |
| Table 2. Specific reagents used | |||
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A4503 | 0.3% |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | 0.25% |
| MgSO4·7H2O | Sigma-Aldrich | M2773 | 1.5 mM |
| D-PBS | GIBCO, by Life Technologies | 21300 | 960 mg/100 ml |
| -make 100ml fresh for each preparation -sterile filter before use |
|||
| Table 3. Solution B for CGN preparation | |||
| Solution B | 19 ml | ||
| Trypsin (5 mg/ml stock, -20°C) | Sigma-Aldrich | T9201 | 1 ml |
| Table 4. Solution T for CGN preparation | |||
| Solution C | 3.2 ml | ||
| Solution B | 16.8 ml | ||
| Table 5. Solution W for CGN preparation | |||
| Deoxyribonuclease (DNase, 500 U per 0.5 ml stock, -20°C) | Sigma-Aldrich | D5025 | 0.5 ml |
| MgSO4· 7H2O | Sigma-Aldrich | M2773 | 1.5 mM |
| Solution B | 10 ml | ||
| Soybean trypsin inhibitor (SBTI, 0.5 mg per 0.5 ml stock, -20°C) | Sigma-Aldrich | T9003 | 0.5 ml |
| Table 6. Solution C for CGN preparation | |||
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A4503 | 4% |
| Earle’s Balanced Salt Solution (EBSS) | GIBCO, by Life Technologies | 24010 | 10 ml |
| MgSO4· 7H2O | Sigma-Aldrich | M2773 | 3 mM |
| Table 7. EBSS Solution for CGN preparation | |||
| Cytosine β-D-arabinofuranoside (Ara-C) * | Sigma-Aldrich | C1768 | 10 μM |
| F–tal Bovine Serum | GIBCO, by Life Technologies | 10106 | 10 % |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | 30 mM |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G3126 | 2 mM |
| KCl | Sigma-Aldrich | P5405 | 25 mM |
| Minimal Essential Medium (MEM) | GIBCO, by Life Technologies | 21090 | 500 ml |
| Penicillin (P)/Streptomycin (S) | GIBCO, by Life Technologies | 15140 | 100 U/ml (P), 100 μg/ml (S) |
| *Ara-C should be added to medium from 1 DIV onwards | |||
| Table 8. Culture Media for CGN preparation | |||
| AxioVision Rel. | Carl Zeiss, Inc. | 4.8 | |
| ImageJ | National Institutes of Health | 1.42q | |
| Microsoft Excel | Microsoft | 2003 | |
| Table 9. Specific computer software used | |||
| CaCl2 · 2H2O | Sigma-Aldrich | C7902 | 1.3 mM |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | 5 mM |
| KCl | Sigma-Aldrich | P5405 | 3.5 mM |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P9791 | 0.4 mM |
| MgCl2·6H2O | Sigma-Aldrich | M0250 | 1.2 mM |
| NaCl | Fluka | 71378 | 170 mM |
| NaHCO3 | Fluka | 71627 | 5 mM |
| Na2SO4 | VWR | 10264 | 1.2 mM |
| TES | Sigma-Aldrich | T1375 | 20 mM |
| Table 10. Saline Solution (pH 7.4) | |||
References
- Rizzoli, S. O., Betz, W. J.
- Sudhof, T. C. The synaptic vesicle cycle revisited. Neuron. 28, 317-320 (2000).
- Evans, G. J., Cousin, M. A. Activity-dependent control of slow synaptic vesicle endocytosis by cyclin-dependent kinase 5. J. Neurosci. 27, 401-411 (2007).
- Clayton, E. L., Cousin, M. A. Differential labelling of bulk endocytosis in nerve terminals by FM dyes. Neurochem. Int. 53, 51-55 (2008).
- Clayton, E. L., Evans, G. J., Cousin, M. A. Bulk synaptic vesicle endocytosis is rapidly triggered during strong stimulation. J. Neurosci. 28, 6627-6632 (2008).
- Cousin, M. A. Use of FM1-43 and other derivatives to investigate neuronal function. Curr. Protoc. Neurosci. Chapter 2, Unit 2-Unit 2 (2008).
- Clayton, E. L. The phospho-dependent dynamin-syndapin interaction triggers activity-dependent bulk endocytosis of synaptic vesicles. J. Neurosci. 29, 7706-7717 (2009).
- Cheung, G., Jupp, O. J., Cousin, M. A. Activity-dependent bulk endocytosis and clathrin-dependent endocytosis replenish specific synaptic vesicle pools in central nerve terminals. J. Neurosci. 30, 8151-8161 (2010).
- Betz, W. J., Mao, F., Smith, C. B.
- Ryan, T. A., Reuter, H., Smith, S. J. Optical detection of a quantal presynaptic membrane turnover. Nature. 388, 478-482 (1997).
- Murthy, V. N., Sejnowski, T. J., Stevens, C. F. Heterogeneous release properties of visualized individual hippocampal synapses. Neuron. 18, 599-612 (1997).
- Tan, T. C. Cdk5 is essential for synaptic vesicle endocytosis. Nat. Cell. Biol. 5, 701-710 (2003).
- Anggono, V., Cousin, M. A., Robinson, P. J. Styryl dye-based synaptic vesicle recycling assay in cultured cerebellar granule neurons. Methods. Mol. Biol. 457, 333-345 (2008).
- Gallo, V. Selective release of glutamate from cerebellar granule cells differentiating in culture. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 79, 7919-7923 (1982).
- Stevens, C. F. Neurotransmitter release at central synapses. Neuron. 40, 381-388 (2003).
- Mozhayeva, M. G. Development of vesicle pools during maturation of hippocampal synapses. J. Neurosci. 22, 654-665 (2002).
- Cousin, M. A., Evans, G. J. O. Activation of silent and weak synapses by cAMP-dependent protein kinase in cultured cerebellar granule neurons. J. Physiol. 589, 1943-1955 (2011).
- Kim, S. H., Ryan, T. A. Synaptic vesicle recycling at CNS synapses without AP-2. J. Neurosci. 29, 3865-3874 (2009).
- Kim, S. H., Ryan, T. A. Cdk5 serves as a major control point in neurotransmitter release. Neuron. 67, 797-809 (2010).
- Groemer, T. W., Klingauf, J. Synaptic vesicles recycling spontaneously and during activity belong to the same pool. Nat. Neurosci. 10, 145-147 (2007).
