Summary
描述一个生活的荧光成像技术，量化的补给和动员特定的突触小泡（SV）池，在中央的神经末梢。两轮的SV回收进行监控，在相同的神经终端提供内部控制。
Abstract
在中央神经末梢释放神经递质后，状态变量的内吞作用迅速检索。检索状态变量，然后重新填充的神经递质和归队回收池，作为状态变量定义的胞吐 1,2 。回收池，一般都可以分为两个不同的池 - 易释放池（RRP）和储备池（RP）。顾名思义，定价由是立即融合的状态变量，而RP的状态变量被释放在强烈的刺激 1,2只。重要的是有一个可靠的检测报告这些SV池差增资，以了解1）状态变量通车后不同模式的内吞作用（如网格蛋白依赖的内吞作用和活动依赖大量的内吞作用）和2）的机制如何调动双方的定价和RP控制在不同的刺激的反应。
定期聘请调频染料定量报告中央神经末梢的SV营业额3-8。他们有疏水性烃类尾气的，允许在脂双层的可逆分区，横跨膜和亲水性头组块通过。很少在水溶液中的荧光染料，但在膜 9分区时，其量子产率显着增加。因此，调频染料跟踪积极回收状态变量的理想荧光探针。调频染料使用标准的协议如下。首先，它们是适用于神经元和期间内吞作用（图1）。非内化后的染料从质膜，内回收池回收状态变量重新分配冲走。这些状态变量，然后使用卸载刺激（图1）耗尽。由于调频染料状态变量的标签是量子 10，由此产生的荧光下降释放囊泡数量成正比。因此，状态变量的回收和融合产生的PRevious轮内吞作用，可以可靠地量化。
在这里，我们提出了一个已被修改，以获得两个额外的信息内容的协议。首先，连续装卸刺激差异卸载定价和RP，让量化具体的SV池增资。其次，每一个神经末梢，两次经过协议。因此，在S1相同的神经末梢的反应可以比较一个阶段S2（图2）的测试物质的存在，提供了一个内部控制。这一点很重要，因为SV在不同的神经末梢循环再造的程度是高度可变的11。
可能对本协议中使用的任何附着的初级神经元文化，但电镀密度，解决方案和刺激的条件进行了优化小脑颗粒神经元（CGNS ）12,13。
Protocol
1。小脑颗粒神经元的制备
- 高压灭菌约100直径25毫米的盖玻片（见表1）。
- 在50毫升无菌无菌聚D -赖氨酸溶液（见表2）管放置盖玻片。广场上为2小时到涂层的盖玻片的旋转平台。
- 干涂层盖玻片，在层流罩（见表1）消毒纸巾。
- 可以储存在4 ° C放置盖玻片进入无菌6孔板和温暖在二氧化碳培养箱（见表1）。 盖玻片在使用前1个月 。
- 安乐死7天的老只大鼠小狗根据当地的伦理委员会的指引。我们使用颈椎脱位安乐死幼仔。
- 剖析小脑和放置在无菌培养皿菜含有磷酸盐缓冲盐溶液（溶液B，表3）。
- 重复步骤4-6幼鼠1.5和1.6。
- 小脑，然后放在一个McIlwain组织赵无菌阶段PPER（见表1）。组织切碎通过90 °的旋转舞台，并重复这个过程之前，在375微米的间隔。
- 切碎的小脑被转移到一个胰蛋白酶溶液（溶液T，表4）以前被加热到37 ° C。
- 孵育小脑在37 ° C为20分钟，轻轻搅拌，大约每5分钟。
- 在胰蛋白酶消化，火焰波兰三个无菌玻璃滴管（见表1）使用本生灯火焰。使用火焰创建移液器各自的嘴巴一个罚款孔，一个中等口径和大口径。
- T溶液中20分钟孵化后，加入20毫升一个胰蛋白酶/ DNA酶抑制剂的解决方案（解决方案瓦，表5）小脑悬浮和沉淀细胞在台式离心机1分钟（见表1）1000 克 。
- 弃上清，重悬在1.5毫升集中胰蛋白酶/ DNA酶抑制剂（溶液C，表6）使用最广泛的孔吸管的细胞沉淀。
- 层的细胞悬液10毫升上一个预热（37℃）牛血清白蛋白补充Earles平衡盐溶液15毫升无菌管（表7）。
- 离心5分钟，暂停在1500 克和悬浮预热MLS 2细胞沉淀（37℃）培养基（表8）。
- 估计使用血球（见表1）细胞数量和细胞悬液稀释到最终密度3.3 × 10 6细胞每毫升。
- 细胞是镀加入75μL的细胞悬液，以D -聚赖氨酸包被盖玻片（最终密度为2.5 × 10 5）的中心。
- 二氧化碳培养箱含有盖玻片的培养皿放置60分钟，让一个在细胞dhere。
- 每口井照顾，不要打扰镀细胞，并返回到 CO 2培养箱培养板中加入培养基1.5毫升。
- 次日更换新鲜培养与有丝分裂抑制剂阿糖胞苷（表8）培养基中培养液中。 逮捕这种文化中的神经胶质细胞扩散。
2。实验装置
- 应包括以下基本实验装置（使用特定的设备和软件，见表1和表9）：
- 倒外延荧光显微镜
- 冷却CCD相机
- 荧光光源（单色或滤光轮）
- 重力灌注设备
- 与平行的铂电极影像室
- 起搏器
- 计算机
- 图像采集软件
- 实验应在黑暗中或红色光COND下itions最小样品的荧光照明，以避免调频染料褪色。
- 实验是在室温下进行。如果是必需的生理温度，温度控制灌注系统也可使用。
3。样品制备
- 文化应采用体外后8-12天。
- 传输一个单一的盖玻片，在室温下10分钟的盐水（表10），以便在新的中期稳定。
- 取出盖玻片，干其底面和周边地区的小块用纸巾或吸水纸贴壁细胞。
- 使用硅脂（见表2），胶水盖玻片成像室的下部。细胞之间应该是两条平行线。应使用足够的硅脂完全密封腔，但没有任何油脂进入中心的洗浴室。
- 轻轻地填补了沐浴室〜260μLSA行的解决方案，然后填写相同的解决方案输入管。
- 清洁盖玻片室顶部与硅脂胶密封。输入和输出管道可用于被困在会议厅内，以消除任何空气气泡。 重要的是，气泡不中断电路 。
- Immobilise在不锈钢平台的成像室，轻轻灌注生理盐水溶液通过输入管泄漏检查。
- 山倒置显微镜阶段的组装室，和重力灌注系统连接室，先催芽与盐溶液的入口。
- 连接电刺激室的电线连接。
- 添加浸油下降的目标，如果使用油镜头。在使用亮场照明分中焦点细胞。
4。 S1期
- 灌注神经元与1.5毫升盐水稀释调频染料（见表2）。
- 使用的附加刺激，刺激神经元，以唤起染率。
- 刺激后，2分钟，用新鲜盐水灌注神经元，洗去多余的染料调频（流量为7毫升/分钟）。CGN文化系统中的胶质污染低于 5％14，因此这段时间内是足以消除染料。
- 保留神经元休息8分钟。
- 在此期间，找到个人FM染料加载神经末梢可见荧光波长（激发，480 nm处，发射，550 nm处）的轴突网络。避免细胞群的地区。保持照明至少在这一步，因为强烈的激励可以导致染料的光毒性。 这种明显的迹象是出泡轴突和缺乏的染料卸载（由于染料固色）。
- 立即重新聚焦图像，图像采集前，因为有轻微的漂移可能都发生在休息时间。 开始时间推移，每4秒1帧的速度图像采集
- 获取5 - 10个基准图像后，唤起人们提供2秒（60个动作电位）8 30赫兹刺激的胞吐的定价手动立即开始帧捕获后的刺激。
- 后获得另外10张图像，唤起对RP的SV胞吐为10秒（400个动作电位）40赫兹的刺激，每30 秒 ，除了8。
- 获得另外5 - 10图像，然后暂停图像采集。
5。恢复阶段（见图2）
- 允许的神经细胞恢复至少20分钟。
- 可选 -如果一种药物的内吞作用的影响进行测试，与药物溶液灌注神经元在此期间（图2b）3,8 。
6。 S2期
- 重复使用相同的视野，为控制实验S1阶段协议（第4）在S1。
- 可选 -如果一种药物的内吞作用的影响进行测试，灌注辅以FM染料（图2b）3,8的药物溶液中的神经元。
- 可选 -胞吐作用的药物的影响，或者，如果感兴趣的是，与药物溶液灌注神经元的定价和RP的装卸刺激（图2c）3之前和期间。
7。数据分析
- 使用ImageJ和Microsoft Excel或类似的软件进行数据分析。
- 在堆栈格式的图像序列进行分析，是必需的。一些图像处理软件可导出为单个图像序列。如果是这样的情况下，转换图像堆栈使用一个ImageJ内置函数图像>书库>图片堆叠。
- 堆栈调整亮度和对比度，以最大限度地提高动态范围图像>调整>亮度/对比度 （图3a） 。
- 如果发生在T显著横向漂移他的实验， 运行 StackReg （ http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/） 和 TurboReg （ http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/）ImageJ插件对齐图像堆栈（图3b ） 。
- 运行时间系列分析仪插件（ http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/time-series.html ）（图3c）。
- 定义了至少90神经末梢地区的利益（投资回报）。这些应该是相同的（直径为1.5微米的圆形的ROI）是有帮助的图像之间的切换前后染料装卸透露积极的神经末梢（或者一个预刺激的图像可以从刺激后的图像中减去）一个理想的投资回报率的大小是一个比一个典型的神经终端 （图3c） 大 。
- 获得每个ROI /综合荧光强度超过添E和导出到Microsoft Excel（图3d和4a）。
- Normalise的投资回报率的痕迹相同的任意值调整为先卸载在S1和S2两个阶段的刺激（图4B - C）在Y轴的平面的痕迹，这是为了控制背景荧光强度的微小变化。
- 测量荧光的绝对减少，在S1和S2如下（图4d）的任意荧光单位的每个装卸刺激诱发：
- 定价=荧光变化（ΔF）30赫兹2秒触发
- RP =ΔF萨姆3 × 40赫兹10秒触发
- 总回收池=定价+ RP
- 对于每个在7.9的相关参数，计算平均值，一次实验中所有的神经末梢。
- 进行统计分析，意味着可以从多个独立的实验中获得的值平均。而不是数量的神经末梢盖玻片应作为STATISTICA升北路
8。代表性的成果：
一个对照实验，其中CGNS经历了两轮相同的装卸步骤是在图5表示。当开始了一系列的实验，它是必不可少的，像这样的控制实验是每天执行确认S1和S2前不同实验条件下，在S2的相媲美。
在这个例子中，装有10微米使用80赫兹10秒刺激（图5a）FM1 - 43 CGNS。图5b显示FM1 - 43 -加载的神经，以荧光灯puncta为代表的终端。投资回报率超过90神经末梢定义在图5c所示。用于S1和S2的投资回报率相同。在这两种卸载，定价是先卸载30赫兹（2）反相卸载连续3 40Hz的刺激（10）（图5a）刺激。在每个刺激的荧光下降可以清楚地观察和量化（图5d - E）。检查时，相应的定价荧光滴，RP和总回收池S1和S2相媲美。此外，回收状态变量的20％居住在的定价，而80％的RP居住在S1和S2。
图1一个典型的FM实验示意图 。一）SV的内吞作用是触发FM染料（绿色表示）的存在。染料是内陷膜（单颗或批量内涵体）。乙）非内在质膜上的染料灌注冲走。 c）在应用程序卸载刺激标记SVS，已成为释放造成损失的荧光与血浆膜的导火索的。四）在荧光（ΔF）发布的标示为状态变量的数量成正比的变化，然后可以量化。
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图2可能的实验方案的示意图。一）控制实验的细胞进行两个回合调频染料装卸（S1和S2）的流程图。细胞可以加载使用各种不同的刺激。卸载步骤是相同的，定价是2秒与30赫兹卸载的反相其次卸载使用第10号第3次40赫兹定价和储备库装卸刺激相隔40秒，所有其他的刺激，30秒。左细胞恢复为S1和S2之间的20分钟。流程图可能修改测试效果为B的一种物质）的内吞作用或C）胞吐也显示。相应的测试药物可以灌注在所示期间进入会议厅。
显示图像J的数据分析图3截图截图一）亮度和对比度调整，二）帧对齐，C）的投资回报的选择，和D）强度值的提取，使用图像研究
在Microsoft Excel中的数据分析图4截图 。截图一）导入图像J（ 第一列的原始数据显示，车架号，其余各列数据，从个人的神经末梢B））S1的基准值（10帧）为任意值（ 200）调整开始第一个刺激，三）调整S2基准值55帧，使用相同的协议，到S1，和D）测量使用Microsoft Excel的荧光滴。请注意，在D所示的平均跟踪是用来定义时间点前后每下降。每个ROI的荧光滴的大小应确定在C所示的电子表格上的值
图5。代表控制实验。一）CGNS被载入10μMFM1 - 43使用80赫兹（10秒）刺激的对照实验流程图。 S1和S2阶段是相同的。定价和储备库装卸刺激相隔40秒，所有其他的刺激，30秒。 b）在图像显示神经末梢加载FM1 - 43。三）与B相同的图像显示90编号的投资回报进行分析选择。 d）在选定的时间点在B红色框描绘一个地区的图片。前基底=刺激; 30赫兹= =后每40赫兹10秒刺激后，30赫兹2秒的刺激; 40赫兹1,2,3。这些图像中伪荧光的变化来说明（频谱显示在右边栏）。 E）平均± SEM跟踪从90 C.个人刺激神经描绘终端获得单杠代表。比例尺= 10微米。
Discussion
调频染料被广泛用于研究在许多神经制剂的神经末梢功能。他们已受聘主要监察或SV的内吞作用，的SV营业额或胞吐 6动力学的程度。所描述的协议扩展了这些研究，探讨差卸载特定的SV池。这提供额外的信息有关的SV池的补水和他们的动员程度。
调频染料可用于多轮的SV回收范围内的标签相同的神经末梢。我们利用此属性和设计，其中SV在每一个终端的营业额可在同一神经末梢两次监测的协议。这提供了一个准确的内部控制，这是必不可少的，由于异质性的SV回收并行神经末梢11。通过使用作为内部控制的S1阶段，加气站的定价，RP和总SV药物池，可以比较可靠和直接。
除了提供回收的绝对大小的信息，定价和RP池不同的刺激条件下，该协议还可以提供下列资料 - 1）之间的定价和RP的状态变量作为一个回收池的功能分区S1和S2，2）总S1回收池和3）任何定义S2在S1相同的池功能的SV池的相对大小的功能（定价和RP）的S2池的相对大小。这种特殊的协议不会提供有关卸载动力学的信息不过，因为采集时间太慢（动能测量的采集时间应尽可能和卸载自动同步图像采集快速）。
我们30赫兹2秒的刺激唤起定价相同程度装卸高渗蔗糖8。由于定价的大小是由高渗蔗糖卸载15定义，我们可以这个协议卸载所有定价状态变量，在16个海马神经元的研究协议。储备库3 400刺激（40赫兹10秒），因为这刺激卸载相同的染料量范式（2 50毫米氯化钾刺激），耗尽所有染料标记的状态变量的95％的列车几乎完全耗尽8,17。准确的定量定价和储备库的大小还依赖于线性CCD相机的动态范围内获得的信息。
这个简单的协议，也可以进一步修改。装货刺激的强度，也可以是多种多样的，以确定神经元的活动和不同的内吞作用模式影响SV池补水。此外，也可以进行装卸大于两个周期，如果需要的话。此协议也可使用或者过度表达或转染细胞shRNA的载体。由于转染效率低的初级神经元文化，表达的蛋白质必须与荧光蛋白标记。它是必不可少的，这些荧光标记不与染料的调频信号干扰（例如，使用青色或红蛋白）。在这种情况下，在相同的视野转染和未转染细胞的神经末梢，也可以作为一个额外的控制8相比。在这种实验中的S1和S2之间的负载加载程度的比较是没有什么价值，因为目前在两个负载扰动。 SV池之间的染料分区仍然可以进行可视化不过 8 。
遗传记者称为pHluorins也可以监测初级神经元文化的SV胞吐和内吞作用。这些探头使用pH敏感的绿色荧光蛋白的管腔域的标签，如鞋面，突触和 VGLUT1 18的SV蛋白的pH值环境19动力学和程度。调频染料为基础的方法这里描述在pHluorin技术的一些优点，首先，调频染料提供信息SV内吞作用模式的补充定价和储备池 8 。其次具体SV池可与具有不同的光谱特性的 20年，最后没有要求转FM染料标记。不能提供调频染料之间的休息，但是回收的SV池（对比pHluorins 19）的SV交通信息，自定义状态变量与染料期间加载的内吞作用是可见的。因此FM染料和pHluorins的长处和短处，并在独立实验中使用，以解决同样的问题时，是最强大的。
高品质的图像是必不可少的有效的分析和reproducib乐的结果。虽然可以很容易地纠正横向漂移，那里是一个在Z轴漂移的实验无法恢复。出于这个原因，重要的是重新集中开始前S1和S2卸载的图像。时发生的情况下，一个显著的荧光衰变，衰变更正可应用于（通常是由减去先前记录的跟踪，从FM加载细胞刺激的情况下）。然而，这是建议，图形表示和不被用于任何定量分析进行衰减校正。
Disclosures
我们什么都没有透露。
Acknowledgments
这项工作是从威康信托基金（编号：084277）赠款支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AxioCam MRm Rev. 3 Digital Camera | Carl Zeiss, Inc. | 4265099901000 | |
| Axio Observer.A1 Microscope | Carl Zeiss, Inc. | 4310040000000 | |
| Cell culture plates (6 wells) | Greiner Bio-One | 657160 | |
| Centrifuge (Universal 32R) | Hettich Zentrifugen | 1610 | |
| CO2 incubator | Heraeus Instruments | 51014042 | |
| Falcon tubes (15/50 ml) | Greiner Bio-One | 188271/210261 | |
| Fluar 20X /0.75 ∞/0.17 Objective | Carl Zeiss, Inc. | 4401459901000 | |
| Glass coverslips (25mm) | VWR international | 631-1584 | |
| Glass pasteur pipettes (230 nm) | Greiner Bio-One | 612-1799 | |
| Haemocytometer | VWR international | 15170-170 | |
| Imaging chamber | Warner Instruments | RC-21 BRFS | |
| Laminar flow hood | BIOHIT | VLF BHS 1200 | |
| McIlwain Tissue Chopper | Mickle Laboratory Engineering Co. Ltd. | MTC/2 | |
| Mercury lamp | Carl Zeiss, Inc. | HBO 103 | |
| MultiStim System Electrical Stimulator (100mV, 1ms pluse width) |  Digitimer Ltd. |
D330 | |
| Perfusion pump | Watson-Marlow Pumps Group | 313S | |
| Serological Pipettes (5/10/25 ml) | Greiner Bio-One | 606180/607180/760180 | |
| Shutter controller | Carl Zeiss, Inc. | MAC5000 | |
| Syringe (20 ml) | BD Biosciences | ST01-B002 | |
| Syringe Filters (Minisart -– 0.20 μm) | Sartorius AG | 16532 | |
| VC-6 Six Channel valve controller | Warner Instruments | 64-0135 | |
| YFP Filter set (Set 46) | Carl Zeiss, Inc. | 1196-681 | |
| Table 1. Specific equipment and apparatus used | |||
| FM1-43 | Cambridge BioScience | BT70021 | 10 μM |
| FM2-10 | Cambridge BioScience | BT70044 | 100 μM |
| Poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | P7886 | 15 μg/ml |
| Silicone grease | Sigma-Aldrich | 85403 | - |
| Table 2. Specific reagents used | |||
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A4503 | 0.3% |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | 0.25% |
| MgSO4·7H2O | Sigma-Aldrich | M2773 | 1.5 mM |
| D-PBS | GIBCO, by Life Technologies | 21300 | 960 mg/100 ml |
| -make 100ml fresh for each preparation -sterile filter before use |
|||
| Table 3. Solution B for CGN preparation | |||
| Solution B | 19 ml | ||
| Trypsin (5 mg/ml stock, -20°C) | Sigma-Aldrich | T9201 | 1 ml |
| Table 4. Solution T for CGN preparation | |||
| Solution C | 3.2 ml | ||
| Solution B | 16.8 ml | ||
| Table 5. Solution W for CGN preparation | |||
| Deoxyribonuclease (DNase, 500 U per 0.5 ml stock, -20°C) | Sigma-Aldrich | D5025 | 0.5 ml |
| MgSO4· 7H2O | Sigma-Aldrich | M2773 | 1.5 mM |
| Solution B | 10 ml | ||
| Soybean trypsin inhibitor (SBTI, 0.5 mg per 0.5 ml stock, -20°C) | Sigma-Aldrich | T9003 | 0.5 ml |
| Table 6. Solution C for CGN preparation | |||
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A4503 | 4% |
| Earle’s Balanced Salt Solution (EBSS) | GIBCO, by Life Technologies | 24010 | 10 ml |
| MgSO4· 7H2O | Sigma-Aldrich | M2773 | 3 mM |
| Table 7. EBSS Solution for CGN preparation | |||
| Cytosine β-D-arabinofuranoside (Ara-C) * | Sigma-Aldrich | C1768 | 10 μM |
| F–tal Bovine Serum | GIBCO, by Life Technologies | 10106 | 10 % |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | 30 mM |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G3126 | 2 mM |
| KCl | Sigma-Aldrich | P5405 | 25 mM |
| Minimal Essential Medium (MEM) | GIBCO, by Life Technologies | 21090 | 500 ml |
| Penicillin (P)/Streptomycin (S) | GIBCO, by Life Technologies | 15140 | 100 U/ml (P), 100 μg/ml (S) |
| *Ara-C should be added to medium from 1 DIV onwards | |||
| Table 8. Culture Media for CGN preparation | |||
| AxioVision Rel. | Carl Zeiss, Inc. | 4.8 | |
| ImageJ | National Institutes of Health | 1.42q | |
| Microsoft Excel | Microsoft | 2003 | |
| Table 9. Specific computer software used | |||
| CaCl2 · 2H2O | Sigma-Aldrich | C7902 | 1.3 mM |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | 5 mM |
| KCl | Sigma-Aldrich | P5405 | 3.5 mM |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P9791 | 0.4 mM |
| MgCl2·6H2O | Sigma-Aldrich | M0250 | 1.2 mM |
| NaCl | Fluka | 71378 | 170 mM |
| NaHCO3 | Fluka | 71627 | 5 mM |
| Na2SO4 | VWR | 10264 | 1.2 mM |
| TES | Sigma-Aldrich | T1375 | 20 mM |
| Table 10. Saline Solution (pH 7.4) | |||
References
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