Summary
En live fluorescens bildteknik för att kvantifiera påfyllning och mobilisering av specifika synaptiska vesikler (SV) pooler i centrala nervterminalerna beskrivs. Två omgångar av SV återvinning följs i samma nervterminalerna ger en intern kontroll.
Abstract
Efter frisättningen av neurotransmittorer i centrala nerv terminaler är SVS snabbt hämtas av endocytos. Hämtad SVS fylls sedan på med signalsubstans och återförenas med återvinning poolen, definierat som SVS som är tillgängliga för exocytos 1,2. Återvinning poolen kan generellt delas upp i två olika bassänger - den lätt öppningsbara poolen (rek.) och reserven poolen (RP). Som deras namn antyder, består rek av SVS som är omedelbart tillgängliga för fusion, medan RP SVS frigörs bara under intensiv stimulering 1,2. Det är viktigt att ha en tillförlitlig analys som redovisar skillnaden påfyllning av dessa SV pooler för att förstå 1) hur SVS trafiken efter olika typer av endocytos (exempelvis clathrin beroende endocytos och aktivitet beroende bulk endocytos) och 2) de mekanismer kontrollera mobilisering av både RRP och RP som svar på olika stimuli.
FM-färgämnen anställa rutinmässigtgick till kvantitativt rapportera SV omsättning i centrala nervterminalerna 3-8. De har en hydrofob kolväte svans som gör att reversibla partitionering i membranet, och en hydrofil huvudet grupp som blockerar passagen över membran. Färgen har lite fluorescens i vattenlösning, men deras kvantutbyte ökar dramatiskt när partitionerad i membranet 9. Således FM-färgämnen är idealiska fluorescerande prober för att spåra aktivt återvinning SVS. Det standardprotokoll för användning av FM-färg är följande. Först de tillämpas på nervceller och tas upp under endocytos (figur 1). Efter icke-internaliserade färg har tvättats bort från plasmamembranet, återvunnen SVS omfördela inom återvinning poolen. Dessa SVS sedan utarmat med lossning stimuli (Figur 1). Eftersom FM färg märkning av SVS är quantal 10, är den resulterande fluorescensen släppa proportion till mängden av frigjort blåsor. Således genererade återvinning och sammanslagning av SVS från previous omgången av endocytos tillförlitligt kan kvantifieras.
Här presenterar vi ett protokoll som har modifierats för att få ytterligare två delar av information. För det första är sekventiella lossning stimuli som används för att differentiellt lossa rek och RP, för att möjliggöra kvantifiering av påfyllning av specifika SV pooler. För det andra genomgår varje nervändslutet protokollet två gånger. Således kan svaret från samma nerv terminalen på S1 jämföras mot förekomsten av ett testämne i fas S2 (Figur 2), vilket ger en intern kontroll. Detta är viktigt, eftersom omfattningen av SV återvinning i olika nervändar är mycket varierande 11.
Alla anhängare primära neuronala kulturer kan användas för detta protokoll, dock plätering densitet, lösningar och villkor stimulering är optimerade för cerebellär granulat neuroner (CGNs) 12,13.
Protocol
1. Cerebellär Granule Neuron Förberedelser
- Autoklav ca 100 25 täckglas mm (tabell 1).
- Placera täckglas i en 50 ml sterilt rör innehållande steril poly-D-lysin lösning (tabell 2). Placera på en roterande plattform för 2 timmar att belägga täckglas.
- Torr belagda täckglas på sterilt papper i ett laminärt flöde huva (tabell 1).
- Placera täckglas till sterila 6-brunnar och varma i en CO 2-inkubator (tabell 1). Täckglas kan lagras en månad vid 4 ° C före användning.
- Euthanize en 7 dagar gammal Sprague Dawley hos råttungar enligt lokala etiska kommittén riktlinjer. Vi avlivas valpar med halsdislokation.
- Dissekera lillhjärnan och placera den i en steril petriskål med en fosfatbuffrad salter (lösning B, tabell 3).
- Upprepa steg 1,5 och 1,6 för 4-6 råttungar.
- Cerebella placeras sedan på den sterila skede av en McIlwain Tissue Chopper (tabell 1). Tissue är hackad på 375 ìm mellanrum före roterande scenen 90 ° och upprepa processen.
- Den hackade cerebella överförs till ett trypsin (lösning T, tabell 4) som tidigare värmts till 37 ° C.
- Inkubera cerebella vid 37 ° C i 20 minuter under försiktig omrörning cirka var 5 min.
- Under Tryptic matsmältning, låga polska tre sterila glaspipetter (tabell 1) med hjälp av en Bunsen låga. Använd lågan för att skapa en fin bar, en bar medium och en stor bar vid respektive munnar pipetter.
- Efter 20 minuter inkubation i lösning T, tillsätt 20 ml av en trypsin / DNas hämmare (lösning W, tabell 5) till lillhjärnan fjädring och pellets celler vid 1000 gi 1 min i en bänk centrifug (tabell 1).
- Dekantera supernatanten och resuspendera cellpelleten i 1,5 ml av en koncentrerad trypsin / DNas hämmare (lösning C, tabell 6) med den bredaste bar pipetten.
- Varva cellsuspension på toppen av 10 ml av en uppvärmd (37 ° C) bovint serumalbumin kompletteras Earles Balanced Salt Solution (tabell 7) i en steril 15 ml tub.
- Centrifugera suspensionen i 5 min vid 1500 g och resuspendera cellpelleten i 2 ml av uppvärmd (37 ° C) odlingssubstrat (tabell 8).
- Uppskatta mobilnummer med hjälp av en haemocytometer (tabell 1) och späd cellsuspensionen till en slutlig densitet på 3,3 x 10 6 celler per ml.
- Celler är pläterade genom att tillsätta 75 ìl av cellsuspension till mitten av poly-D-lysin-belagda täckglas (slutliga densitet 2,5 x 10 5).
- Den odlingsplattor innehåller täckglas placeras i CO 2-inkubator för 60 min så att cellerna till endhere.
- Tillsätt 1,5 ml odlingsmedium i varje brunn noga med att inte störa pläterade cellerna och tillbaka odlingsplattor till CO 2 inkubator.
- Följande dag ersätter odlingsmedium med färska odlingsmedium kompletteras med mitotiska hämmaren cytosin arabinoside (Tabell 8). Arresteringar spridning av gliaceller i kultur.
2. Experimentuppställning
- Grundläggande experimentuppställning bör bestå av följande (se tabell 1 och 9 för specifik utrustning och använda programvara):
- Inverterad epi-fluorescensmikroskop
- Kylt CCD-kamera
- Fluorescerande ljuskälla (monokromator eller filter hjul)
- Gravity perfusion apparater
- Imaging kammare med parallella platina elektroder
- Elektrisk stimulator
- Dator
- Bild förvärv programvara
- Experiment ska utföras i mörker eller under rött ljus konditions med minst fluorescerande belysning av provet för att undvika FM färg blekning.
- Experimenten utförs i rumstemperatur. Om fysiologisk temperatur krävs, får en temperaturkontrollerad perfusion systemet användas.
3. Provberedning
- Kulturer bör användas efter 8-12 dagar in vitro.
- Överför en enda täckglas till koksaltlösning (tabell 10) i 10 min i rumstemperatur för att möjliggöra stabilisering i nytt medium.
- Ta bort täckglas, torr undersidan och området kring den bifogade cellerna med en liten bit hushållspapper eller absorberande papper.
- Använda silikonfett (tabell 2), täckglas lim på undersidan av avbildning kammaren. Celler ska vara mellan de två parallella ledningar. Tillräckligt silikonfett bör användas för att helt försegla kammaren men utan fett in i mitten av badet kammaren.
- Försiktigt fylla badkaret kammaren med ~ 260 l SArad lösning och sedan fylla ingången rör med samma lösning.
- Limma en ren täckglas med silikonfett till toppen av kammaren att täta den. Den input och output slangar kan användas för att avlägsna eventuella luftbubblor fångade i kammaren. Det är viktigt att den elektriska kretsen inte avbryts av luftbubblor.
- Spärra avbildning kammaren i en rostfri plattform och kolla efter läckor genom att försiktigt perfusing saltlösning genom ingången slangen.
- Montera ihop kammare på scenen av ett inverterat mikroskop och anslut kammaren till en gravitation perfusion system, efter att först grundmålas inloppet med koksaltlösning.
- Fäst anslutning av kablar i kammaren till den elektriska stimulatorn.
- Tillsätt en droppe immersionsolja till målet om en olja objektiv används. Fokus på cellerna i mitten av kammaren med hjälp av ljusa fält belysning.
4. S1 Fas
- BEGJUTA nervceller med 1,5 mlFM färgämne (tabell 2) utspädda i koksaltlösning.
- Stimulera nervceller att frammana färga upptag med hjälp av bifogade stimulatorn.
- Efter stimulering, för att BEGJUTA nervceller med färska saltlösning för 2 min tvätta bort överflödigt FM-färg (flöde 7 ml / min). Gliaceller föroreningar i CGN kulturen är mindre än 5% 14, är därför denna tidsram som är tillräcklig för att ta bort färg .
- Lämna nervceller vila i 8 min.
- Under detta intervall, lokalisera axonal nätverk där enskilda FM dye-loaded nervändar är synliga med hjälp av fluorescein våglängder (excitation, 480 nm, emission,> 550 nm). Undvik områden med kluster av celler. Håll belysningen till ett minimum i detta steg, eftersom intensiv upphetsning kan resultera i färg fototoxicitet. Tydliga tecken på detta är blebbing av axoner och bristande färgämne lossning (på grund av färg fixering).
- Ny inriktning bild precis innan bilden förvärvet sedan en lätt drift kan ha inträffat under viloperiod. Börja time-lapse bild förvärvet till en kurs av en ram var 4 S.
- Efter förvärvet 5 till 10 baslinjen bilder, framkalla exocytos av RRP genom att leverera en 30 Hz stimulering under 2 s (60 aktionspotentialer) 8 Börja stimulering manuellt omedelbart efter ram fånga..
- Efter förvärvet ytterligare 10 bilder väcker SV exocytos av RP med tre stimuli på 40 Hz under 10 s (400 aktionspotentialer), var 30 sek mellanrum 8.
- Förvärva ytterligare 5 till 10 bilder och sedan pausa bilden förvärvet.
5. Återhämtningsfasen (se figur 2)
- Låt nervceller att återhämta sig under minst 20 min.
- Tillval - Om effekten av ett läkemedel på endocytos ska testas, BEGJUTA nervceller med läkemedel lösning under denna period (figur 2b) 3,8.
6. S2 Fas
- Upprepa S1 fas-protokollet (avsnitt 4) för en kontroll experiment med samma synfält somi S1.
- Tillval - Om effekten av ett läkemedel på endocytos ska testas, BEGJUTA nervceller med drogen lösningen kompletteras med FM färgämne (figur 2b) 3,8.
- Valfritt - Alternativt om läkemedelseffekter på exocytos är av intresse, BEGJUTA nervceller med drogen lösning både före och under rek och RP lossning stimuli (Figur 2c) 3.
7. Dataanalys
- Använd ImageJ och Microsoft Excel eller liknande program för dataanalys.
- För analys är en bildsekvens i stacken format som krävs. Vissa bildhanteringsprogram kan exportera sekvenser som enskilda bilder. Om så är fallet, konvertera bilder till en skorsten med ett ImageJ inbyggd funktion Bild> Staplar> Bilder att stapla.
- Justera ljusstyrka och kontrast bunten för att maximera det dynamiska omfånget. Bild> Justera> Ljusstyrka / Kontrast (figur 3a).
- Om betydande horisontell drift har inträffat under tHan experimenterar, kör StackReg ( http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/ ) och TurboReg ( http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/ ) plugins på ImageJ att anpassa bildstapel (Figur 3b) .
- Driftstid plugin-serie Analyzer ( http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/time-series.html ) (Figur 3c).
- Definiera områden av intresse (ROI) över minst 90 nervändslut. Dessa bör vara identiska (cirkulär ROI med 1,5 ìm diameter) Det är bra att växla mellan bilderna före och efter färg lossning avslöja aktiva nervändslut (alternativt en pre-stimulering bild kan dras från en post-stimulering bild). Ett idealiskt ROI storlek är ett som är mycket större än en typisk nervändslutet (figur 3c).
- Skaffa totala / integrerade fluorescensintensitet varje ROI över Time och exportera till Microsoft Excel (figur 3d och 4a).
- Normalise ROI spår till samma godtyckligt värde genom att rikta spåren i planet på Y-axeln för den första lossningen stimulans i både S1 och S2 faser (figur 4b-c). Detta för att kontrollera för små variationer i bakgrundsfluorescens intensitet.
- Mät absoluta minskningen i fluorescens framkallat av varje lossning stimulans i godtyckligt fluorescens enheter för S1 och S2 enligt följande (Figur 4d):
- RRP = Förändring i fluorescens (ΔF) utlöses av 30 Hz 2 s
- RP = Summa ΔF utlöses av 3 x 40 Hz 10 s
- Total återvinning pool = rek + RP
- För varje relevant parameter i 7,9, beräkna medelvärdet över alla nervändar i ett enda experiment.
- För statistisk analys, medelvärden från flera oberoende experiment kan beräknas. Antalet täckglasen snarare än antalet nervterminalerna bör användas som STATISTICAl n.
8. Representativa resultat:
En kontroll experiment där CGNs genomgick två omgångar av identiska lastning och lossning steg är representerad i figur 5. När börjar en serie experiment, är det viktigt att en kontroll experiment som detta sker varje dag för att bekräfta att S1 och S2 är jämförbara innan de olika experimentella förhållanden under S2.
I detta exempel var CGNs lastade med 10 mikroM FM1-43 med en 80 Hz 10 s stimulering (Figur 5a). Figur 5b visar FM1-43-laddad nervterminaler representeras av fluorescerande puncta. ROI definierades över 90 nervändar som visas i Figur 5c. Samma uppsättning ROI användes för både S1 och S2. Under båda lastar var rek first lossas med ett 30 Hz (2 s) stimulering följt av RP lossning med 3 sekventiell 40Hz (10 s) stimuli (Figur 5a). Fluorescensen droppe under varje stimulus kan tydligt observeras och kvantifieras (figur 5d-e). När undersöktes, sjunker fluorescens motsvarar rek var RP och total återvinning pool jämförbara i både S1 och S2. Dessutom bodde 20% av återvunnet SVS i rek medan 80% bodde i RP i både S1 och S2.
Figur 1 Schematisk bild av en typisk FM-experiment. A) SV endocytos utlöses i närvaro av FM färgämne (representerade i grönt). Färgen tas upp av invaginating membran (singel SVS eller bulk endosomes). B) icke-internaliserade färg på plasmamembranet tvättas bort av perfusion. C) på begäran av en lossning stimulans, märkt SVS som blivit tillgängliga för övergång säkring med plasmamembranet vilket resulterar i en förlust av fluorescens. D) Förändringen i fluorescens (ΔF) som är proportionell mot mängden av frigjort märkt SVS kan sedan kvantifieras.
_upload/3143/3143fig2.jpg "/>
Figur 2 Schematisk diagram över möjliga experimentella protokoll. A) Flödesschema för en kontroll experiment där cellerna genomgår två omgångar av FM färg lastning och lossning (S1 och S2). Celler kan laddas med hjälp av en rad olika stimuli. Lossning steg är identiska i att rek lossas med 30 Hz för 2 ar följt av RP lossa med hjälp av 3 gånger 40 Hz för 10 s. RRP och reserv pool lossning stimuli var åtskilda av 40 sek, alla andra stimuli med 30 sek. Celler är kvar att återhämta sig i 20 min mellan S1 och S2. Flödesscheman för eventuella ändringar för att testa effekten av ett ämne som antingen B) endocytos eller C) exocytos visas också. Motsvarande test läkemedel kan perfusion in i kammaren under angivna perioder.
Figur 3 Bilder av dataanalys i bild J. Skärmdumpar visasför A) ljusstyrka och kontrast justering, B) ram justering, C) ROI urval, och D) värden intensiteten extraktion med Image J.
Figur 4 Skärmdumpar av dataanalys i Microsoft Excel. Skärmdumpar visas för A) Att importera rådata från Image J (1 st spalt = bildnummer, återstående kolumnerna = data från enskilda nervändar) B) justering av S1 utgångsvärden (ram 10) till ett godtyckligt värde (200) i början av de första stimulans, C) justering av S2 utgångsvärden på frame 55 där identiskt protokoll till S1, och d) Mätning av fluorescens droppar med hjälp av Microsoft Excel. Observera att i genomsnitt spår som visas i D används för att definiera tidpunkter före och efter varje droppe. Storleken på fluorescens droppar för varje ROI bör bestämmas värden på kalkylbladet visas i C.
Figur 5. Representant kontroll experiment. A) Flödesschema för en kontroll experiment där CGNs var lastade med 10μM FM1-43 med 80 Hz (10 s) stimulering. S1 och S2 faser är identiska. RRP och reserv pool lossning stimuli var åtskilda av 40 sek, alla andra stimuli med 30 sek. B) En bild som visar nervterminaler laddad med FM1-43. C) Samma bild som B visar 90 numrerade ROI ut för analys. D) Bilder av ett område skildras av en röd ruta i B på utvalda tidpunkter. Basal = före stimuleringen, 30 Hz = efter 30 Hz 2 s stimulans, 40 Hz 1,2,3 = efter varje 40 Hz 10 s stimulans. Dessa bilder presenteras i pseudofärger att illustrera förändringar i fluorescens (spektrum bar visas till höger). E) Medel ± SEM spår från 90 nervändar som skildras i C. Enskilda stimuli representeras av horisontella staplar. Skala staplar = 10 mikrometer.
Discussion
FM-färgämnen används flitigt för att undersöka nervändslutet funktion i många neuronala förberedelser. De har använts främst för att kontrollera omfattningen av antingen SV endocytos, SV omsättningen eller kinetik exocytos 6. Den beskrivna protokollet utvidgar dessa studier för att undersöka den differentiella lossning av specifika SV pooler. Detta ger ytterligare information om påfyllnad av SV pooler och även deras omfattning mobilisering.
FM-färgämnen kan användas för att beteckna flera rundor av SV återvinning inom samma nervändslut. Vi har utnyttjat denna egenskap och utformade protokoll där SV omsättning i varje terminal kan övervakas två gånger i samma nervändslut. Detta ger en noggrann intern kontroll, vilket är nödvändigt på grund av den heterogena karaktären av SV återvinning parallellt nervterminalerna 11. Via användning av S1 fas som en intern kontroll, påfyllning av RRP, RP och den totalaSV pool i närvaro av läkemedel kan vara ett tillförlitligt och direkt jämföras.
Förutom att ge information om den absoluta storleken på återvinning, rek och RP pooler under olika stimulering förhållanden, kan detta protokoll ger också data för följande - 1) uppdelning av SVS mellan rek och RP som en funktion av återvinningsprocessen poolen för S1 och S2, 2) den relativa storleken på S2 pooler (rek. och RP) som en funktion av det totala S1 återvinning pool och 3) den relativa storleken på eventuella definieras SV pool i S2 som en funktion av samma pool i S1. Denna speciella protokoll kommer inte att ge information om lossning kinetik men eftersom förvärvet tiden är för långsam (för kinetisk mätning förvärv tider bör så snabbt som möjligt och lossning synkroniseras automatiskt att ta bilder).
Vår 30 Hz 2 s stimuli framkallar en identisk omfattning av RRP lossning till hyperton sackaros 8. Eftersom storleken på RRPdefinieras av hyperton sackaros lossning 15, kan vi konstatera att detta protokoll lossar alla rek SVS, i samförstånd med studier i hippocampus nervceller 16. Reservatet poolen är nästan helt slut av tre tåg av 400 stimuli (40 Hz 10 s vardera) eftersom detta stimulering lossar en identisk mängd färgämne för att ett paradigm (2 stimuli med 50 mm KCl) som utarmar 95% av alla färg-märkta SVS 8,17. Exakt kvantifiering av storleken på både RRP och reserv poolen är också beroende av att skaffa information inom det linjära dynamiska omfånget av CCD-kamera.
Denna enkla protokoll kan också ändras ytterligare. Styrkan för lastning stimuli kan också varieras för att avgöra hur neuronala aktivitet och olika lägen endocytos påverkar SV pool påfyllning. Dessutom kan mer än två cykler av lastning och lossning även utföras vid behov. Detta protokoll kan även användas i celler transfekterade med antingen överuttryck ellershRNA vektorer. På grund av den låga transfektion effektivitet primära neuronala kulturer måste uttryckta proteinerna vara märkta med fluorescerande proteiner. Det är viktigt att dessa lysrör taggarna inte stör FM-dye-signalen (använd cyan eller rött proteiner, till exempel). I detta fall kan nervändslut från transfekterade och icke-transfekterade celler i samma synfält även jämföras som en extra kontroll 8. I ett sådant experiment en jämförelse av graden av belastning mellan S1 och S2 laster är av ringa värde, eftersom den störning är närvarande under båda laster. Partitionering färgämne mellan SV pooler kan fortfarande visualiseras dock 8.
Genetiska reportrar kallas pHluorins också kan användas för att övervaka SV exocytos och endocytos i primära neuronala kultur. Dessa sonder använda en pH-känslig grönt fluorescerande protein för pH miljö luminala domäner taggade SV proteiner såsom VAMP, synaptophysin och VGLUT1 18 19. FM-dye baserade tillvägagångssätt som beskrivs här har vissa fördelar över pHluorin tekniken, det första FM-färgämnen ge information om vilka SV endocytos läge fyller på rek och reservera pooler 8. För det andra specifika SV pooler kan märkas med FM-färgämnen som har olika spektrala egenskaper 20 och slutligen finns det inget krav för transfektion. FM-färgämnen kan inte ge information om SV trafiken mellan vila och återvinning SV pooler dock (i motsats till pHluorins 19), eftersom per definition SVS måste laddas med färgämne under endocytos att synas. Alltså både FM-färgämnen och pHluorins har styrkor och svagheter och är mest kraftfulla när de används i oberoende experiment för att ta upp samma fråga.
Bilder med hög kvalitet är avgörande för giltiga analys och reproducibLe resultat. Medan horisontella glida lätt kan korrigeras kan experiment där det finns en tendens i Z-axeln inte återställas. Av denna anledning är det viktigt att åter fokusera bilderna innan man börjar S1 och S2 lossar. I de fall när en betydande fluorescerande förfall har skett, kan sönderfallskorrigering tillämpas (vanligtvis genom att subtrahera ett tidigare inspelat spår från FM-laddade celler i avsaknad av stimulans). Däremot föreslås det att förfallet korrigering bara görs för grafisk representation och inte användas för något kvantitativ analys.
Disclosures
Vi har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
Detta arbete stöds av ett bidrag från Wellcome Trust (Ref: 084.277).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AxioCam MRm Rev. 3 Digital Camera | Carl Zeiss, Inc. | 4265099901000 | |
| Axio Observer.A1 Microscope | Carl Zeiss, Inc. | 4310040000000 | |
| Cell culture plates (6 wells) | Greiner Bio-One | 657160 | |
| Centrifuge (Universal 32R) | Hettich Zentrifugen | 1610 | |
| CO2 incubator | Heraeus Instruments | 51014042 | |
| Falcon tubes (15/50 ml) | Greiner Bio-One | 188271/210261 | |
| Fluar 20X /0.75 ∞/0.17 Objective | Carl Zeiss, Inc. | 4401459901000 | |
| Glass coverslips (25mm) | VWR international | 631-1584 | |
| Glass pasteur pipettes (230 nm) | Greiner Bio-One | 612-1799 | |
| Haemocytometer | VWR international | 15170-170 | |
| Imaging chamber | Warner Instruments | RC-21 BRFS | |
| Laminar flow hood | BIOHIT | VLF BHS 1200 | |
| McIlwain Tissue Chopper | Mickle Laboratory Engineering Co. Ltd. | MTC/2 | |
| Mercury lamp | Carl Zeiss, Inc. | HBO 103 | |
| MultiStim System Electrical Stimulator (100mV, 1ms pluse width) |  Digitimer Ltd. |
D330 | |
| Perfusion pump | Watson-Marlow Pumps Group | 313S | |
| Serological Pipettes (5/10/25 ml) | Greiner Bio-One | 606180/607180/760180 | |
| Shutter controller | Carl Zeiss, Inc. | MAC5000 | |
| Syringe (20 ml) | BD Biosciences | ST01-B002 | |
| Syringe Filters (Minisart -– 0.20 μm) | Sartorius AG | 16532 | |
| VC-6 Six Channel valve controller | Warner Instruments | 64-0135 | |
| YFP Filter set (Set 46) | Carl Zeiss, Inc. | 1196-681 | |
| Table 1. Specific equipment and apparatus used | |||
| FM1-43 | Cambridge BioScience | BT70021 | 10 μM |
| FM2-10 | Cambridge BioScience | BT70044 | 100 μM |
| Poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | P7886 | 15 μg/ml |
| Silicone grease | Sigma-Aldrich | 85403 | - |
| Table 2. Specific reagents used | |||
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A4503 | 0.3% |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | 0.25% |
| MgSO4·7H2O | Sigma-Aldrich | M2773 | 1.5 mM |
| D-PBS | GIBCO, by Life Technologies | 21300 | 960 mg/100 ml |
| -make 100ml fresh for each preparation -sterile filter before use |
|||
| Table 3. Solution B for CGN preparation | |||
| Solution B | 19 ml | ||
| Trypsin (5 mg/ml stock, -20°C) | Sigma-Aldrich | T9201 | 1 ml |
| Table 4. Solution T for CGN preparation | |||
| Solution C | 3.2 ml | ||
| Solution B | 16.8 ml | ||
| Table 5. Solution W for CGN preparation | |||
| Deoxyribonuclease (DNase, 500 U per 0.5 ml stock, -20°C) | Sigma-Aldrich | D5025 | 0.5 ml |
| MgSO4· 7H2O | Sigma-Aldrich | M2773 | 1.5 mM |
| Solution B | 10 ml | ||
| Soybean trypsin inhibitor (SBTI, 0.5 mg per 0.5 ml stock, -20°C) | Sigma-Aldrich | T9003 | 0.5 ml |
| Table 6. Solution C for CGN preparation | |||
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A4503 | 4% |
| Earle’s Balanced Salt Solution (EBSS) | GIBCO, by Life Technologies | 24010 | 10 ml |
| MgSO4· 7H2O | Sigma-Aldrich | M2773 | 3 mM |
| Table 7. EBSS Solution for CGN preparation | |||
| Cytosine β-D-arabinofuranoside (Ara-C) * | Sigma-Aldrich | C1768 | 10 μM |
| F–tal Bovine Serum | GIBCO, by Life Technologies | 10106 | 10 % |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | 30 mM |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G3126 | 2 mM |
| KCl | Sigma-Aldrich | P5405 | 25 mM |
| Minimal Essential Medium (MEM) | GIBCO, by Life Technologies | 21090 | 500 ml |
| Penicillin (P)/Streptomycin (S) | GIBCO, by Life Technologies | 15140 | 100 U/ml (P), 100 μg/ml (S) |
| *Ara-C should be added to medium from 1 DIV onwards | |||
| Table 8. Culture Media for CGN preparation | |||
| AxioVision Rel. | Carl Zeiss, Inc. | 4.8 | |
| ImageJ | National Institutes of Health | 1.42q | |
| Microsoft Excel | Microsoft | 2003 | |
| Table 9. Specific computer software used | |||
| CaCl2 · 2H2O | Sigma-Aldrich | C7902 | 1.3 mM |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | 5 mM |
| KCl | Sigma-Aldrich | P5405 | 3.5 mM |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P9791 | 0.4 mM |
| MgCl2·6H2O | Sigma-Aldrich | M0250 | 1.2 mM |
| NaCl | Fluka | 71378 | 170 mM |
| NaHCO3 | Fluka | 71627 | 5 mM |
| Na2SO4 | VWR | 10264 | 1.2 mM |
| TES | Sigma-Aldrich | T1375 | 20 mM |
| Table 10. Saline Solution (pH 7.4) | |||
References
- Rizzoli, S. O., Betz, W. J.
- Sudhof, T. C. The synaptic vesicle cycle revisited. Neuron. 28, 317-320 (2000).
- Evans, G. J., Cousin, M. A. Activity-dependent control of slow synaptic vesicle endocytosis by cyclin-dependent kinase 5. J. Neurosci. 27, 401-411 (2007).
- Clayton, E. L., Cousin, M. A. Differential labelling of bulk endocytosis in nerve terminals by FM dyes. Neurochem. Int. 53, 51-55 (2008).
- Clayton, E. L., Evans, G. J., Cousin, M. A. Bulk synaptic vesicle endocytosis is rapidly triggered during strong stimulation. J. Neurosci. 28, 6627-6632 (2008).
- Cousin, M. A. Use of FM1-43 and other derivatives to investigate neuronal function. Curr. Protoc. Neurosci. Chapter 2, Unit 2-Unit 2 (2008).
- Clayton, E. L. The phospho-dependent dynamin-syndapin interaction triggers activity-dependent bulk endocytosis of synaptic vesicles. J. Neurosci. 29, 7706-7717 (2009).
- Cheung, G., Jupp, O. J., Cousin, M. A. Activity-dependent bulk endocytosis and clathrin-dependent endocytosis replenish specific synaptic vesicle pools in central nerve terminals. J. Neurosci. 30, 8151-8161 (2010).
- Betz, W. J., Mao, F., Smith, C. B.
- Ryan, T. A., Reuter, H., Smith, S. J. Optical detection of a quantal presynaptic membrane turnover. Nature. 388, 478-482 (1997).
- Murthy, V. N., Sejnowski, T. J., Stevens, C. F. Heterogeneous release properties of visualized individual hippocampal synapses. Neuron. 18, 599-612 (1997).
- Tan, T. C. Cdk5 is essential for synaptic vesicle endocytosis. Nat. Cell. Biol. 5, 701-710 (2003).
- Anggono, V., Cousin, M. A., Robinson, P. J. Styryl dye-based synaptic vesicle recycling assay in cultured cerebellar granule neurons. Methods. Mol. Biol. 457, 333-345 (2008).
- Gallo, V. Selective release of glutamate from cerebellar granule cells differentiating in culture. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 79, 7919-7923 (1982).
- Stevens, C. F. Neurotransmitter release at central synapses. Neuron. 40, 381-388 (2003).
- Mozhayeva, M. G. Development of vesicle pools during maturation of hippocampal synapses. J. Neurosci. 22, 654-665 (2002).
- Cousin, M. A., Evans, G. J. O. Activation of silent and weak synapses by cAMP-dependent protein kinase in cultured cerebellar granule neurons. J. Physiol. 589, 1943-1955 (2011).
- Kim, S. H., Ryan, T. A. Synaptic vesicle recycling at CNS synapses without AP-2. J. Neurosci. 29, 3865-3874 (2009).
- Kim, S. H., Ryan, T. A. Cdk5 serves as a major control point in neurotransmitter release. Neuron. 67, 797-809 (2010).
- Groemer, T. W., Klingauf, J. Synaptic vesicles recycling spontaneously and during activity belong to the same pool. Nat. Neurosci. 10, 145-147 (2007).
