Biology

+ टी lymphocyte कैद CD4 एचआईवी के लिए एक डिस्पोजेबल microfluidic चिप का उपयोग

Published: October 1, 2007 doi: 10.3791/315

Sang Jun Moon¹, Richard Lin², Utkan Demirci¹

¹Bio-Acoustic-MEMS Laboratory in Medicine (BAMM), HST-Center for Bioengineering, Brigham and Women's Hospital, ²Massachusetts Institute of Technology

Summary

Protocol

विरोधी - CD4 ⁺ biotinlayted सतह के साथ microfluidic चैनल तैयार है.
5 मिलीलीटर / मिनट में नमूना रक्त के 10 मिलीलीटर सिरिंज पंप के साथ microfluidic चैनल में इंजेक्षन.
पीबीएस के साथ 20 मिनट के लिए / 20 मिलीलीटर मिनट पर खून फ्लश.
5ul/min पर 15 मिनट के लिए पतला FACS lysing समाधान (पीबीएस साथ शेयर समाधान से 10% करने के लिए पतला) इंजेक्षन.
15 मिनट के लिए सेते हैं.
5 मिलीलीटर / 20 मिनट के लिए मिनट पर प्राथमिक CD3 ⁺ एंटीबॉडी समाधान (पीबीएस साथ शेयर समाधान से 10% करने के लिए पतला) इंजेक्षन.
2 घंटे के लिए सेते हैं.
5 मिलीग्राम / 15 मिनट के लिए मिनट में पीबीएस चैनल के साथ बाहर फ्लश.
5 / मिलीलीटर मिनट पर एक ही समय में 20 मिनट के लिए 20% ^{AF488 सीडी 4} + एंटीबॉडी, 0.2% DAPI शेयर समाधान, और 10% माध्यमिक ^CD3 + एंटीबॉडी सुई .
20 मिनट के लिए सेते हैं.
5 मिलीग्राम / 15 मिनट के लिए मिनट में पीबीएस चैनल के साथ बाहर फ्लश.
फ्लोरोसेंट खुर्दबीन के नीचे कोशिकाओं की गणना:
1. (ऑप्टिकल) सफेद - काले और सफेद: सेल और धूल
2. (DAPI) यूवी - केवल ब्लू: सेल
3. ब्लू ^{(सीडी 4 +)} - ग्रीन: टी लिम्फोसाइट और monocyte
4. ग्रीन (CD3 ⁺⁾ - केवल लाल: टी lymphocyte

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Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
PDMS microchannel				Fabricated by SU-8 mold
Blood				Donated blood from normal human subject. Mass General Hospital, 10 X high density WBC or Brigham and Women’s Hospital.
PBS	Buffer	Invitrogen	14190	1x Dulbecco’s Phosphated Buffered Saline.
FACS lysing solution		BD Biosciences	349202	Diluted to 10% from stock solution with PBS.
Anti-CD4+ biotinlayted Ab		Beckman Coulter Inc.	IM0704	Surface prepared with Anti-CD4+ biotinlayted Ab, diluted to 10% from stock solution with PBS/BSA after mixing with 0.2mg stock and 1ml deionized water.
goat anti-hCD3delta	pAB	Santa Cruz Biotechnology, Inc.	sc-1128	Diluted to 10% from stock solution with PBS
rabbit anti-goat IgG PE		Santa Cruz Biotechnology, Inc.	sc-3755	Secondary Ab fro anti-CD3 Ab, diluted to 10% from stock solution with PBS
anti-human CD4+		BD Biosciences	557695	Alexa Fluor 488 labeled, diluted to 20% from stock solution with PBS.
DAPI		Invitrogen	D1306	4’,6-dianidino-2-phenylindole, dihydrochloride solution, diluted to 0.2% from stock solution with PBS.