CD4 + T-לימפוציטים לכידת באמצעות שבב Microfluidic פנויה ל-HIV

Summary

Protocol

1. הכן ערוץ microfluidic עם משטח ⁺ אנטי CD4 biotinlayted.
2. הזרק 10 מ"ל של דם מדגם ב 5 מ"ל / דקה לתוך התעלה microfluidic עם משאבת מזרק.
3. לשטוף את הדם 20 מ"ל / דקה במשך 20 דקות עם PBS.
4. הזרק פתרון FACS בדילול lysing (בדילול מלא 10% מן המניות עם פתרון PBS) בשעה 5ul/min במשך 15 דקות.
5. דגירה של 15 דקות.
6. הזרק CD3 העיקרי ⁺ פתרון נוגדן (בדילול מלא 10% מן המניות עם פתרון PBS) בשעה 5 מ"ל / דקה במשך 20 דקות.
7. דגירה למשך 2 שעות.
8. פלאש החוצה עם ערוץ PBS ב 5 מ"ל / דקה במשך 15 דקות.
9. הזרק 20% AF488 CD4 ⁺ נוגדן, 0.2% פתרון DAPI מניות, ו -10% משני CD3 ⁺ נוגדן ב 5 מ"ל / דקה במשך 20 דקות באותו זמן.
10. דגירה של 20 דקות.
11. לשטוף את הערוץ עם PBS ב 5 מ"ל / דקה במשך 15 דקות.
12. ספירת תאים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי:
    1. לבן (אופטי) - שחור ולבן: תא ואבק
    2. UV (DAPI) - כחול: תא בלבד
    3. כחול (CD4 ⁺⁾ - ירוק: לימפוציטים מסוג T ו מונוציטים
    4. גרין (CD3 ⁺⁾ - אדום: לימפוציטים מסוג T בלבד

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
PDMS microchannel				Fabricated by SU-8 mold
Blood				Donated blood from normal human subject. Mass General Hospital, 10 X high density WBC or Brigham and Women’s Hospital.
PBS	Buffer	Invitrogen	14190	1x Dulbecco’s Phosphated Buffered Saline.
FACS lysing solution		BD Biosciences	349202	Diluted to 10% from stock solution with PBS.
Anti-CD4+ biotinlayted Ab		Beckman Coulter Inc.	IM0704	Surface prepared with Anti-CD4+ biotinlayted Ab, diluted to 10% from stock solution with PBS/BSA after mixing with 0.2mg stock and 1ml deionized water.
goat anti-hCD3delta	pAB	Santa Cruz Biotechnology, Inc.	sc-1128	Diluted to 10% from stock solution with PBS
rabbit anti-goat IgG PE		Santa Cruz Biotechnology, Inc.	sc-3755	Secondary Ab fro anti-CD3 Ab, diluted to 10% from stock solution with PBS
anti-human CD4+		BD Biosciences	557695	Alexa Fluor 488 labeled, diluted to 20% from stock solution with PBS.
DAPI		Invitrogen	D1306	4’,6-dianidino-2-phenylindole, dihydrochloride solution, diluted to 0.2% from stock solution with PBS.