Summary
Герпетиформный дерматит (DH) является хроническим воспалительным состоянием, которое характеризуется аутоиммунной реакции между IgA и эпидермальный трансглутаминазе (ETG). DH развивается в очень небольшая часть глютен-чувствительная и / или целиакия пациентов. Результаты этого исследования показывают, что DH может также развиться в резус обезьяна хост с симптомами idiopatic дерматит.
Abstract
Ткань трансглутаминазе 2 (tTG2) является кишечная пищеварительный фермент который deamidates уже частично переваренный диетические пептиды глиадина например, клейковины. В генетически предрасположенных лиц, tTG2 вызывает аутоиммунные реакции, которые характеризуются производство tTG2 антител и их прямое осаждение тонкого кишечника в 1,2 стене. Наличие таких антител является одним из основных признаков целиакии (CD). Эпидермального трансглутаминазе (ETG) является еще одним членом семьи трансглутаминазе, что может также функционировать как аутоантиген в незначительное меньшинство CD пациентов. В этих довольно редких случаях, ETG запускает аутоиммунные реакции (кожная сыпь) клинически известно как дерматит герпетиформный (DH). Хотя точный механизм патогенеза CD и DH не очень хорошо понимал, как известно, что tTG2 и ETG доля антигенных эпитопов, которые могут быть признаны сывороточных антител с двух компакт-дисков и DH пациентов 3,4.
(Macaca mulatta) с дерматитом (табл. 1, рис. 1 и 2) был использован для исследования пораженных тканей. У одного животного (EM96) спектрального перекрытия IgA и tTG2 антител (рис. 3) была продемонстрирована. Наличие двойной положительный tTG2 + IgA + клеток было сосредоточено в глубоких эпидермиса, вокруг кожных сосочков. Это согласуется с поражением описано у пациентов DH 3. Когда EM96 был сделан на безглютеновой диете, дерматита, а также tTG2 + IgA + депозиты исчезли и больше не наблюдается (рис. 1-3). Дерматит появился однако, основаны на повторное введение пищевого глютена в EM96 (не показано). В других макак в том числе животных с несвязанными дерматит, tTG2 + IgA + депозиты не были обнаружены. Безглютеновой диеты зависит от прощения дерматита у EM96 вместе с наличием tTG2 + IgA + клеток в коже предлагают аутоиммунных, DH-какМеханизм развития этого состояния. Это первый доклад DH-как дерматит у любого не-человеческое приматов.
Protocol
1. Биопсия кожи пробы
- Перед процедурой биопсии кожи, обезболивания животных внутримышечно 2,5 мг / кг tiletamine гидрохлорид и zolazepam гидрохлорид telazol смеси (Fort Dodge Animal Health, Форт Додж, IA). Монитор животных от администрации анестезии до лежачее положение, а затем удалить из их корпуса.
- Удаление волос с поверхности кожи сферу интересов использованием Остер Золотой A5 одной скорости ветеринарной Clipper с размером 40 лезвия (Остер Профессиональное оборудование, McMinnville, TN) и асептически подготовить с чередующимися скраб бетадин и алкоголь. Безопасные стерильной драпировки окончатый за выбранный сайт биопсии.
- Использование стерильных, место 4,0 мм Miltex Удар Кожные инструментом биопсии (Miltex, Йорк, Пенсильвания) против кожи, одновременно вращая инструмент на 180 градусов по часовой стрелке и против часовой стрелки с легким нажатием до биопсии удар разрезов через кожные слои в подкожной тиСГУП. Удалить биоптата и понять пересекаются часть кожи пинцетом и свободной от подкожной клетчатки.
- Закрыть дефект кожи с нейлоновыми 3-0 шва прилагается к 3 / 8 круга резки иглы (Ethilon, Ethicon, Johnson & Johnson Medical Limited, Беркшир, Великобритания) в крестообразной шаблону. Дайте всех животных 0,01 мг / кг бупренорфин гидрохлорид (Hospira, Лейк-Форест, штат Иллинойс) внутримышечно в течение послеоперационного обезболивания.
2. Пример обработки
- Работа с кожей биоптатов от хронического дерматита и контрольная группа здоровых людей резус-макак. Получить 2:58 (4 мм в диаметре) биопсии из каждого животного.
- Fix первый образец в формалине цинка (Z-исправить, Anatech ООО, Battle Creek, Мичиган) в течение 24 часов, промыть в воде в течение 30 мин, смойте кратко в 70% этанола, и поместить в ASP300 Leica ткани процессор (Leica Microsystems, Inc , Buffalo Grove, KS), где ткань обезвоживается с восходящими сорта 70%, 80%, 95% и 100% этилового спирта 48мин каждый (Fisher Scientific, Питтсбург, Пенсильвания), а затем два изменения ксилола (Fisher).
- Добавить в парафин средства массовой информации (Fisher) для длительного хранения при комнатной температуре. Место на-20oC в течение 20 мин до секционирования. Подготовка разделов 6 мкм с помощью роторного микротома (HM325, Microm International, Вальдорф, Германия). Место разделы на заряженные слайды (Fisher) и сухой воздух при 60 ° С в течение ночи. Пятно гематоксилином и эозином (H & E) стандартным методом (см. ниже).
- Fix второго образца в 2% параформальдегида (USB Corp, Кливленд, Огайо) в течение 30 мин при комнатной температуре, мыть три раза в фосфатном буферном растворе (PBS, Gibco-Invitrogen, Карлсбад, Калифорния), место в 30% сахарозы (Fisher) для 4 часа, и внедрить в октябре замерзания среды (Сакура Finetek, Торренс, Калифорния). Хранить при температуре 80 ° С, в течение 20 мин до секционирования. Подготовка 15 мкм разделы, используя криостат (HM560, Thermo Scientific, Каламазу, Мичиган).
3. H & E окрашивания
- Deparaffinize вставлятьДед разделах через три изменения ксилолов (Fisher) и увлажняет через градуированные ethanols: три изменения в 100%, два изменения в 95%, одно изменение на 80% и дистиллированной воды, 2 мин каждый.
- Пятно гематоксилином (Richard Allan-научного, Каламазу, Мичиган) в течение одной минуты и следуйте путем краткого промыть в проточной воде.
- Контрастирующая с эозином (Sigma) в течение 6 мин.
- Дегидрировать окрашенных тканях через 95%, а абсолютный этанол, две перемены 2 мин каждый, и затем снимите в три смены ксилолов, 3 мин каждый.
- Горы покровного стекла использованием Cytoseal Монтаж среднего (Richard Allan Научно-) по сравнению с H & E-окрашенных срезах ткани.
4. Гистопатологические оценки
Осмотрите H & E-окрашенных биопсии кожи разделы под световым микроскопом с помощью 4 - и 40-кратном увеличении микроскопа Leica SPOT Insight цифровой камеры (цифровой инструменты Inc, штат Мичиган, США).
5. Иммунофлуоресцентного СтаиNing
- Работа с октября встраиваемый кожи разделы для иммунофлуоресцентного окрашивания. До окрашивания, замочить на 20 мин в PBS, содержащего 0,2% рыбьей кожи желатин (FSG, Sigma) с 0,1% Тритон Х-100 (Sigma), чтобы удалить октябре и permeabilize ткани.
- После мытья слайды, инкубировать с 10% нормальной козьей сывороткой (NGS, Sigma), разведенного в PBS-ФСГ в течение 1 часа при комнатной температуре, во влажной камере слайд.
- Для того, чтобы визуализировать отложение IgA и tTG2 антител, инкубировать слайды с анти-резус-IgA и tTG2 первичных антител, разведенного в 10% НГС-PBS-ФСГ в течение 1 часа.
- Промыть PBS-ФСГ-Тритон Х-100 (Sigma) в течение 10 мин, после чего PBS-ФСГ в течение 10 мин.
- Инкубируйте со средним, изотип-специфических антител с меткой Alexa Fluor флуорохромом 488 (зеленый), 568 (красный) или 633 (синий) (Molecular Probes-Invitrogen) на 1:1000 разбавления. Используйте ToPro-3 красителя для визуализации ядерной ДНК. Использование 10% НГС-PBS-FSG как антитело разбавителя.
- Использование анти-закалки решение (Sigma) для монтирования окрашенных срезах ткани.
6. Конфокальной микроскопии
Выполните съемку с Leica TCS SP2 Правда конфокальной микроскопии лазерного сканирования (Leica, Wetzlar, Германия) оснащен тремя лазерами (шесть линий для возбуждения имеется): аргон-криптон лазер на 488 нм (зеленый), криптон лазер на 568 нм ( красный) и гелий-неонового лазера на длине волны 633 нм (синий), которые охватывают от видимого до дальнего красного сторону спектра. Запись дифференциального интерференционного контраста (DIC) изображений для оценки без меток ткани архитектуры.
7. Представитель Результаты
Примером позитивного признания ETG как tTG2 и IgA антител, показан на рис. 3А. В соответствии с ситуацией в человеческом пациентов и из-за гораздо более низкую распространенность DH-как дерматит, чем CD-как клейковина чувствительность также в макак-резус, большинство из образцов кожи биопсии, как ожидается, шош положительную реакцию с антителами tTG2 но без присутствия tTG2 + IgA + двойной положительных клеток (рис. 4). Эти DH-несвязанных случаев, в том числе дерматит случаях микробного происхождения, откроет какой-либо одной-положительных IgA + клеток рассеяны под эпителием, но не спектрального перекрытия между tTG2 и IgA-меченых маркеров (рис. 3В и 4). Поэтому, очень важно для поддержания порядка предлагаемые процедуры тестирования, начиная с клинического обследования (рис. 1), а затем гистопатологические оценки (рис. 2) и только при отсутствии других, более общих дерматит возбудителей могут быть идентифицированы, конфокальной микроскопическое исследование кожи биопсии окрашивают в течение tTG2 и IgA является оправданным. Клинические и / или гистопатологические оценки сами по себе недостаточны для положительного диагноза этого заболевания. В тех случаях, когда двойной положительный (tTG2 + IgA +) клетки выявляются в районе кожных сосочков, DH-как дерматит диагноз может быть выдан. В таких случаях выход пищевого глютенаи администрирование безглютеновой диете рекомендуется для того, чтобы облегчить симптомы дерматита.
Рисунок 1. Паховой области EM96 макаки до (А) и после (б) снятие диетические клейковины в течение 5 недель. Реинтродукция диетические клейковины совпало с появлением дерматита (С).
Рисунок 2. HE окрашивание EM96 макаки биопсии кожи, собранные до (А) и после (б) снятие диетические клейковины в течение 9 недель. : Эпителий утолщен (7-15 слоев эпителиальных клеток) с толстым поверхностным коры гиперкератозом клетки проникли с нейтрофилов вырождается. Нейтрофилы появляются и внутри эпителия и смешиваются с умеренным количеством лимфоцитов, плазматических клеток и гистиоцитов вокруг придатков в верхней дерме. В: Некоторые hyperkeratОсис по-прежнему присутствует, эпителиальные толщина нормирован (4-7 слоев) с минимальным лимфоплазмоцитарной инфильтрации в верхней дерме. C: Нормальная кожа живота из FR56 макаки, без лимфоплазмоцитарной инфильтрация, включена для сравнения. Увеличение 20x.
Рисунок 3. Конфокальной микроскопии изображений EM96 макаки биопсии кожи, собранные до (А) и после (б) снятие диетические клейковины в течение 9 недель. : IgA окрашивания (зеленый), tTG2 (красный) и ToPro-3 ядерных маркеров ДНК (синий). Сотрудничество локализации IgA и tTG2 появляется в желтой вокруг области кожных papilae. B: Кожа пробы после 9 недель безглютеновой диете не показывает IgA в эпителии то время как некоторые субэпителиальные IgA-прежнему присутствует (зеленый), tTG2 (красный) и ToPro-3 ядерных маркеров ДНК (синий).
Рисунок 4.
| Животное тегов | Секс [M / F] | Возраст [Лет] | Клинические симптомы | Плазменные tTG2 Антитела | Диета [1,2] * |
| HJ71 | F | 1,3 | Здоровый | - | 1 |
| HD13 | М | 1,4 | Здоровые, иногда диарея | + | 1 |
| FR56 | М | 5,4 | Хроническая диарея идиопатический | - | 1 |
| EM96 | F | 5,0 | Хронический дерматит | + / - (Границы) | 1 и 2 |
| GI24 | F | 4,6 | Хронический дерматит | - | 1 |
Таблица 1. TNPRC макак-резус использоваться для сбора биопсии кожи
* Диета 1 - регулярные обезьяны чау (содержащих клейковину); Диета 2 - безглютеновой диете
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Наши вновь созданных без человеческих приматов модель клейковины чувствительности был недавно использован для изучения кишечных изменения проницаемости вызвано диетических клейковины 5,6. Плазменные tTG2 антител, а также кишечных tTG2 + IgA + депозиты были обнаружены в некоторых глютен-чувствительная макак. Так как мы недавно идентифицированных редких случаях идиопатической дерматит в колонии макак-резус, где нет обычного (инфекционные / метаболические) этиологии может быть установлено, целью данного исследования было оценить, если tTG2 + IgA депозиты + антитела могут быть обнаружены в коже образцы из этих редких случаях дерматита (табл. 1).
Распространенность tTG2 аутоантител, которые указывают на CD составляет от 1:70 и 1:200 7. Наши исследования с глютен-чувствительная макак показывают, что распространенность tTG2 антител в неволе резус-макак напоминает, что зарегистрированы в человеческой популяции. Первичные экологические и генетические факторы, которые могут оказывать влияние степени ое такой распространенностью у людей и макак изученной 8,9. Факторы, которые связаны с более низкой распространенностью DH (1:400 до 1:10000), чем компакт-диск, также не известно. Таким образом, более тщательное изучение необходимо для исследования CD и DH патогенез. Этот доклад является первым, чтобы продемонстрировать существование DH-как дерматит в не-человеческое приматов. Несмотря на то что распространенность DH-как дерматит, как представляется, гораздо ниже, чем распространенность глютен-чувствительная энтеропатия также макаки, представленные результаты дают надежду на будущие исследования, предполагая, что дополнительные животных с DH-как дерматит будут выявлены. Обнаружение двойной положительный tTG2 + IgA + клеток в коже биопсии пораженных животных с помощью конфокальной микроскопии должна играть важную роль в таких усилиях.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить Amanda Tardo, доктор Мустафа Bouljihad, Стефани Фили, Кэрол Койн, доктор Эрин Ribka, доктор Пит Дидье и Дороти Kuebler за техническую помощь. Эта работа была поддержана грантами NIH R01-DK076653 и 3R01-DK076653-02S1 в КС и предоставлять базовую операционную из TNPRC RR000164.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-Human IgA-FITC * | Sigma-Aldrich | F-5259 | 1:100 working dilution |
| Anti-Human tTG2 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | MS-300-P1ABX | 1:100 working dilution |
| Anti-Mouse IgG1 ** | Invitrogen | A-21124 | 1:1,000 working dilution |
| ToPro-3 DNA probe *** | Invitrogen | T-3605 | 1:1,000 working dilution |
| Zinc Formalin (Z-fix) | Anatech Ltd., Battle Creek, MI | 171 | |
| OCT Freezing Medium | Sakura Finetek | 4583 | |
| Cytoseal Mounting Medium | Richard-Allan Scientific | 8312-4 | |
| Anti-Quenching Solution | Sigma-Aldrich | P 3130 | |
| Ethilon (Nylon Suture) | Ethicon Inc. | 663G | |
| Miltex Punch Dermal Biopsy Instrument | Miltex Inc. | NA | |
| Oster Golden A5 Single Speed Vet Clipper with a size 40 blade | Oster Professional Products | 78005-050 | |
| Leica Tissue Processor | Leica Microsystems | ASP300 | |
| Rotary Microtome | Microm International | HM325 | |
| Cryostat | Thermo Fisher Scientific, Inc. | HM560 | |
| Confocal Microscope | Leica, Wetzlar | TCS SP2 | |
| * Fluorescein isothiocyanate ** Secondary (Alexa Fluor 568-conjugated) antibody used after tTG2 primary antibody ** Dye |
|||
References
- Diosdado, B., Wijmenga, C. Molecular mechanisms of the adaptive, innate and regulatory immune responses in the intestinal mucosa of celiac disease patients. Expert. Rev. Mol. Diagn. 5 (5), 681-700 (2005).
- Schuppan, D., Dennis, M. D., Kelly, C. P. Celiac disease: epidemiology, pathogenesis, diagnosis, and nutritional management. Nutr. Clin. Care. 8 (2), 54-69 (2005).
- Sardy, M. Epidermal transglutaminase (TGase 3) is the autoantigen of dermatitis herpetiformis. J. Exp. Med. 195 (6), 747-757 (2002).
- Rose, C. Autoantibodies against epidermal transglutaminase are a sensitive diagnostic marker in patients with dermatitis herpetiformis on a normal or gluten-free diet. J. Am. Acad. Dermatol. 61 (1), 39-43 (2009).
- Bethune, M. Transepithelial transport and enzymatic detoxification of gluten in gluten-sensitive rhesus macaques. PLoS ONE. 3 (3), e1857-e1857 (2008).
- Mazumdar, K. Visualization of transepithelial passage of the immunogenic 33-residue peptide from α-2 gliadin in gluten-sensitive macaques. PLoS ONE. 5 (4), e10228-e10228 (2010).
- Schuppan, D., Junker, Y., Barisani, D. Celiac disease: from pathogenesis to novel therapies. Gastroenterol. 137 (6), 1912-1933 (2009).
- Hunt, K. Newly identified genetic risk variants for celiac disease related to the immune response. Nature Genet. 40 (4), 395-402 (2008).
- Abadie, V. Integration of genetic and immunological insights into a model of celiac disease pathogenesis. Annu. Rev. Immunol. 29, 493-525 (2011).
