Summary
التهاب الجلد الحلئي (DH) هو مرض مزمن التهابات يتميز رد فعل المناعة الذاتية بين ايغا والبشرة ناقلة الغلوتامين (ETG). DH يتطور على جزء صغير جدا من المرضى الذين يعانون من الغلوتين الحساسة و / أو الاضطرابات الهضمية. نتائج هذه الدراسة تشير إلى أن درهم ويمكن أيضا أن تضع في مضيف قرد هندي صغير مع اعراض التهاب idiopatic.
Abstract
ناقلة الغلوتامين الأنسجة 2 (tTG2) هو انزيم الهضم في الأمعاء التي deamidates بالفعل هضم الغلوتين جزئيا مثل الببتيدات غليادين الغذائية. في الأفراد مهيئون جينيا ، tTG2 مشغلات الاستجابات الذاتية التي تتميز إنتاج الأجسام المضادة وtTG2 ترسبها المباشرة إلى 1،2 جدار الأمعاء الصغيرة. وجود مثل هذه الأجسام المضادة تشكل واحدة من السمات المميزة الرئيسية لمرض الاضطرابات الهضمية (CD). البشرة ناقلة الغلوتامين (ETG) هو عضو آخر من عائلة ناقلة الغلوتامين التي يمكن أن تعمل أيضا بمثابة مستضد ذاتي في أقلية صغيرة من المرضى مؤتمر نزع السلاح. في هذه الحالات نادرة نسبيا ، ETG العوامل التي تسبب رد فعل المناعة الذاتية (طفح جلدي) المعروف سريريا والتهاب الجلد الحلئي (DH). على الرغم من عدم والآلية الدقيقة لمؤتمر نزع السلاح والتسبب درهم مفهومة جيدا ، فمن المعروف أن tTG2 وETG الحواتم مستضدي حصة التي يمكن أن تكون معترف بها من قبل أضداد المصل من المرضى على حد سواء CD و 3،4 درهم.
معشوقة استخدمت = "jove_content"> في هذه الدراسة ، والفحص المجهري لعينات الخزعة مبائر من الآفات الجلدية من المكاك وهو قرد اسيوي اثنين (المكاك الخلاسي) مع الجلد (الجدول 1 ، الشكل 1 و 2) لدراسة الأنسجة المتضررة. في حيوان واحد (EM96) وتبين وجود تداخل الطيفية ايغا وtTG2 الأضداد (الشكل 3). وجود المزدوج tTG2 ايجابية وتركزت + + ايغا خلايا في البشرة العميقة ، في جميع أنحاء الحليمات الجلدية. وهذا يتفق مع الإصابات الموصوفة في المرضى DH 3. عندما وضعت EM96 على نظام غذائي خال من الغلوتين ، والجلد ، فضلا عن tTG2 ايغا + + ودائع اختفت ولم تعد قابلة للكشف (الشكلان 1-3). التهاب الجلد الظهور ومع ذلك ، استنادا إلى إعادة إدخال الغلوتين من الغذاء في EM96 (لا يظهر). في قرود المكاك الأخرى بما في ذلك الحيوانات مع التهاب لا علاقة لها ، لم يتم الكشف عن + + ودائع tTG2 ايغا. اتباع نظام غذائي خال من الغلوتين التي تعتمد على مغفرة من التهاب في EM96 مع وجود tTG2 + + ايغا الخلايا في الجلد تشير إلى المناعة الذاتية ، مثل DH -آلية لوضع هذا الشرط. هذا هو التقرير الأول من DH - مثل التهاب في أي الرئيسيات غير البشرية.
Protocol
1. خزعة الجلد جمع عينة
- قبل إجراء خزعة الجلد ، وتخدير الحيوانات عضليا مع 2.5 ملغ / كغ من هيدروكلوريد تلييتامين وzolazepam خليط هيدروكلوريد telazol (فورت دودج صحة الحيوان ، وفورت دودج ، IA). مراقبة الحيوانات من إدارة مخدر حتى الاستلقاء ثم إزالتها من الضميمة الخاصة بهم.
- إزالة الشعر من منطقة الجلد التي تهم استفاد من المقص الذهبي اوستر A5 سرعة واحدة البيطري بشفرة 40 الحجم (اوستر المنتجات الفنية ، McMinnville ، تينيسي) ، وإعداد جو معقم و مطهر بالتناوب مع فرك betadine والكحول. تأمين ثنى منوفذة معقمة على موقع خزعة المحدد.
- باستخدام تقنية معقمة ، ضع 4.0 ملم Miltex كمة صك الخزعة الجلدية (Miltex ، نيويورك ، والسلطة الفلسطينية) على الجلد بينما تناوب 180 درجة في اتجاه عقارب الساعة صك وعكس عقارب الساعة مع ضغط طفيف حتى لكمة خزعة المقاطع العرضية من خلال طبقات الجلد تحت الجلد في منظمة الشفافية الدوليةssue. إزالة عينة خزعة وفهم جزء مقطوع من الجلد مع ملقط وخالية من الأنسجة تحت الجلد.
- إغلاق عيب خياطة الجلد مع النايلون 3-0 ملحقة إبرة القطع 08/03 دائرة (Ethilon ، Ethicon ، جونسون أند جونسون الطبية المحدودة ، شركة بيركشاير ، المملكة المتحدة) في نمط الصليبي. تعطي جميع الحيوانات 0.01 هيدروكلوريد البوبرينورفين ملغ / كلغ (هوسبيرا ، ليك فورست ، IL) عضليا لتسكين بعد العملية.
2. تجهيز العينة
- العمل مع عينات الخزعة الجلدية من التهاب مزمن ومراقبة صحية المكاك وهو قرد اسيوي. الحصول 2-3 (4 مليمتر في القطر) الخزعة عينات من كل حيوان.
- الإصلاح العينة الأولى في الفورمالين الزنك (Z - الإصلاح ، Anatech المحدودة ، معركة الخور ، MI) لمدة 24 ساعة ، ويغسل في الماء لمدة 30 دقيقة ، ويغسل لفترة وجيزة في الايثانول 70 ٪ ، ومكان في النسيج المعالج ASP300 ايكا (لايكا مايكروسيستمز ، الجاموس غروف ، KS) حيث الأنسجة المجففة مع درجات تصاعدي من 70 ٪ ، 80 ٪ ، 95 ٪ و 100 الإيثانول بنسبة 48 ٪كل دقيقة (فيشر العلمية ، بيتسبرغ ، بنسلفانيا) ، تليها تغييرين من الزيلين (فيشر).
- تضمين في وسائل البارافين (فيشر) للتخزين الطويل الأجل في درجة حرارة الغرفة. في مكان - 20oC لمدة 20 دقيقة قبل sectioning. إعداد 6 أقسام ميكرون باستخدام مشراح الدوارة (HM325 ، Microm الدولية ، والدورف ، ألمانيا). أقسام المركز على الشرائح مشحونة (فيشر) والهواء الجاف في 60oC بين عشية وضحاها. وصمة عار مع الهيماتوكسيلين يوزين (H & E) الطريقة القياسية (موضح أدناه).
- الإصلاح في العينة الثانية بارافورمالدهيد 2 ٪ (USB كورب ، كليفلاند ، أوهايو) لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، ويغسل ثلاث مرات في الفوسفات مخزنة المالحة (PBS ، Gibco - Invitrogen ، كارلسباد ، كاليفورنيا) ، في مكان السكروز 30 ٪ (فيشر) لل 4 ساعات ، وتضمينها في المتوسط تجميد أكتوبر (ساكورا Finetek ، تورنس ، كاليفورنيا). تبقي في دورتها الحادية و80oC لمدة 20 دقيقة قبل sectioning. 15 ميكرومتر تعد المقاطع باستخدام ناظم البرد (HM560 ، الحرارية العلمية ، كالامازو ، MI).
3. H & E تلطيخ
- تضمين Deparaffinizeدائرة التنمية الاقتصادية من خلال ثلاثة أقسام تغييرات الزيلين (فيشر) وترطيب ethanols متدرج من خلال : ثلاثة تغييرات من 100 ٪ ، تغييرين من 95 ٪ ، تغيير واحد من 80 ٪ والماء المقطر ، 2 دقيقة لكل منهما.
- وصمة عار مع الهيماتوكسيلين (ريتشارد آلان ، والعلم ، كالامازو ، MI) لمدة دقيقة ومتابعة من قبل يغسل وجيزة في إدارة مياه الحنفية.
- ملون مباين مع يوزين (سيغما) لمدة 6 دقائق.
- يذوى الأنسجة الملون من خلال 95 ٪ من الإيثانول والمطلقة ، وهما التغيرات في 2 دقيقة ثم كل ثلاثة تغييرات واضحة في لالزيلين ، 3 دقائق لكل منهما.
- جبل ساترة به Cytoseal متوسطة التركيب (ريتشارد آلان ، والعلم) على مدى H & E - أقسام النسيج الملون.
4. النسجية التقييم
تفقد H & E الملطخة أقسام خزعة الجلد تحت المجهر باستخدام الضوء 4 -- التكبير و40X مجهر لايكا مع كاميرا رقمية سبوت انسايت (رقمي آلات المحدودة ، ميتشيغان ، الولايات المتحدة).
5. مناعي staiنينغ
- العمل مع المقاطع الجلد جزءا لا يتجزأ من أكتوبر للتلوين مناعي. قبل التلوين ، نقع لمدة 20 دقيقة في برنامج تلفزيوني يحتوي على 0.2 ٪ الأسماك الجيلاتين الجلد (FSG ، سيجما) بنسبة 0.1 ٪ تريتون X - 100 (سيغما) لإزالة أكتوبر وpermeabilize الأنسجة.
- بعد غسل الشرائح ، مع احتضان 10 ٪ مصل الماعز العادي (NGS ، سيغما) ، مخففة في برنامج تلفزيوني ، FSG لمدة 1 ساعة ، في درجة حرارة الغرفة ، في غرفة الشريحة مرطب.
- من أجل تصور ترسب ايغا والأضداد tTG2 ، احتضان الشرائح المضادة للريسوس ايغا وtTG2 الأجسام المضادة الأولية ، وتضعف في 10 ٪ NGS ، PBS ، FSG لمدة 1 ساعة.
- تغسل مع X - 100 - PBS FSG - تريتون (سيغما) لمدة 10 دقيقة ، تليها PBS ، FSG لمدة 10 دقيقة.
- احتضان مع الأجسام المضادة الثانوية isotype محددة ، والموسومة ب اليكسا فلور ملون تألقي 488 (أخضر) ، 568 (أحمر) أو 633 (أزرق) (المسابر الجزيئية - Invitrogen) في 1:1،000 التخفيف. استخدام صبغة ToPro - 3 لتصور الحمض النووي. استخدام 10 ٪ NGS ، PBS ، FSG باعتبارها مخفف الأضداد.
- استخدام الحل المضادة للتبريد (سيغما) لتحميل المقاطع النسيج الملون.
6. مبائر التصوير
أداء التصوير مع TCS ايكا SP2 ليزر متحد البؤر صحيح مجهر المسح الضوئي (لايكا ، Wetzlar ، المانيا) مجهزة بثلاث ليزر (ستة خطوط الإثارة متوفرة) : ليزر الأرجون ، الكريبتون في 488 نانومتر (الأخضر) ، ليزر الكريبتون في 568 نانومتر ( الحمراء) ، وجهاز ليزر الهليوم نيون في 633 نانومتر (الأزرق) ، التي تمتد من مرئية إلى الجانب بعيدة الحمراء من الطيف. سجل المقابل تدخل الفرق (DIC) لتقييم الصور غير المسمى هندسة الأنسجة.
7. ممثل النتائج
ويرد مثال على الاعتراف الإيجابي من قبل كل من ETG tTG2 وايغا الاضداد في الشكل. 3A. بما يتفق مع الوضع في المرضى من البشر ، ونظرا لانتشار أقل بكثير من DH - مثل التهاب الجلد من CD - مثل حساسية الغلوتين أيضا في المكاك وهو قرد اسيوي ، يتوقع معظم الجلد عينات الخزعة إلى SHOث التفاعل الإيجابي مع tTG2 الأجسام المضادة ولكن من دون وجود خلايا tTG2 + + ايغا ايجابية مزدوجة (الشكل 4). وهذه الحالات لا علاقة لها DH - ، بما في ذلك حالات التهاب جرثومي المنشأ ، تكشف عن بعض + ايغا واحدة إيجابية لخلايا متناثرة تحت الظهارة ولكن ليس التداخل بين الأطياف tTG2 وايغا المسمى علامات (الشكلان 3B و 4) ولذلك ، فمن المهم للحفاظ على ترتيب إجراءات الاختبار المقترحة ، بدءا من الفحص السريري (الشكل 1) ، تليها الأنسجة التقييم (الشكل 2) ، وإلا إذا لم يمكن التعرف على الآخر ، المسببة للالتهاب أكثر شيوعا وكلاء مبائر ، الفحص المجهري له ما يبرره من خزعات الجلد الملون لtTG2 و IgA. التقييمات السريرية و / أو الأنسجة وحدها ليست كافية للتشخيص الإيجابي لهذا الشرط. في تلك الحالات عند النقر المزدوج الايجابية (ايغا tTG2 + +) ويتم تحديد الخلايا في جميع أنحاء المنطقة من الحليمات الجلدية ، يمكن أن تصدر مثل DH - تشخيص التهاب الجلد. في مثل هذه الحالات ، والانسحاب من الغلوتين الغذائيةوأوصت بإقامة نظام غذائي خال من الغلوتين من أجل التخفيف من أعراض التهاب الجلد.
الشكل 1. الأربي المنطقة من قبل EM96 المكاك (A) وبعد (ب) الانسحاب من الغلوتين الغذائية لمدة 5 أسابيع. وتزامن انبعاث الغلوتين الغذائية مع ظهور أكزيما (C).
الشكل 2. معالي تلون EM96 خزعات الجلد المكاك التي تم جمعها من قبل (A) وبعد (ب) الانسحاب من الغلوتين الغذائية لمدة 9 أسابيع. ج : هو ثخن الطلائية (7-15 طبقات من الخلايا الظهارية) مع قشرة سطحية سميكة من الخلايا التقرن تسلل العدلات مع التحول. العدلات تظهر أيضا داخل الظهارة وتختلط مع أعداد متوسطة من الخلايا الليمفاوية وخلايا البلازما ، والخلايا الناسجة حول ملحقات في الأدمة العليا. باء : بعض hyperkeratعمليات التفتيش الموقعي ما زال موجودا ، وسمك الظهارية غير طبيعية (4-7 طبقات) مع الحد الأدنى من تسلل lymphoplasmacytic في الأدمة العليا. يتم تضمين جلد البطن عادي من FR56 المكاك ، مع عدم وجود تسلل lymphoplasmacytic ، للمقارنة : C. تكبير 20X.
الشكل 3. الصور المجهري متحد البؤر EM96 من خزعات الجلد المكاك التي تم جمعها من قبل (A) وبعد (ب) الانسحاب من الغلوتين الغذائية لمدة 9 أسابيع. ج : تلطيخ ايغا (الأخضر) ، tTG2 (الحمراء) ، وToPro - 3 علامة الحمض النووي (الأزرق). شارك في توطين ايغا وtTG2 يظهر باللون الأصفر في جميع أنحاء المنطقة من papilae الجلدية. باء : عينة الجلد التي اتخذت بعد 9 أسابيع من اتباع نظام غذائي خال من الغلوتين لا يظهر أي ايغا داخل الظهارة في حين أن البعض لا يزال تحت الظهارة ايغا الحالية (الأخضر) ، tTG2 (الحمراء) ، وToPro - 3 علامة الحمض النووي (الأزرق).
الشكل 4.
| العلامات الحيوانية | جنس [M / F] | عمر [سنوات] | الأعراض السريرية | البلازما tTG2 الأضداد | حمية [1،2] * |
| HJ71 | F | 1.3 | صحي | -- | 1 |
| HD13 | M | 1.4 | صحية ، والإسهال في بعض الأحيان | + | 1 |
| FR56 | M | 5.4 | الاسهال المزمن مجهول السبب | -- | 1 |
| EM96 | F | 5.0 | التهاب مزمن | + / -- (الشريط الحدودي) | 1 و 2 |
| GI24 | F | 4.6 | التهاب مزمن | -- | 1 |
الجدول 1. TNPRC المكاك ريسوس تستخدم لجمع عينات للفحص الجلد
* النظام الغذائي 1 -- القرد تشاو العادية (التي تحتوي على الغلوتين) ؛ حمية 2 -- اتباع نظام غذائي خال من الغلوتين
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وقد استخدمت مؤخرا لدينا المنشأة حديثا غير البشرية نموذج الثدييات العليا للحساسية الغلوتين لدراسة التغيرات نفاذية الأمعاء الناجمة عن الغلوتين الغذائية 5،6. تم الكشف عن الأجسام المضادة tTG2 البلازما وكذلك الأمعاء tTG2 + + ودائع ايغا الغلوتين المكاك في بعض الأحرف. منذ وجدناها في الآونة الأخيرة حوادث نادرة من التهاب مجهول السبب في المستعمرة الريسوس المكاك ، حيث يمكن إنشاء أي المعتادة (المعدية / الأيض) المسببات ، وكان الهدف من هذه الدراسة لتقييم ما إذا tTG2 + يمكن الكشف عن ودائع ايغا الضد + في عينات الجلد من هذه الحالات النادرة من التهاب الجلد (الجدول 1).
انتشار الأجسام المضادة tTG2 التي تدل على CD يتراوح بين 1:70 و 7 1:200. دراساتنا مع الغلوتين المكاك حساسة تشير إلى أن معدل انتشار الأجسام المضادة في tTG2 الأسير المكاك وهو قرد اسيوي يشبه ذكرت من البشر. الابتدائية العوامل البيئية والوراثية التي قد تؤثر على مدى سوسلوكه و انتشار هذا النوع في كل من البشر وقرود المكاك 8،9. هي أيضا من العوامل التي ترتبط مع انخفاض معدل انتشار درهم (1:400 إلى 1:10،000) من القرص المضغوط غير معروفة. لذا ، لا بد من مزيد من البحوث لدراسة دقيقة لمؤتمر نزع السلاح والتسبب درهم. هذا التقرير هو الأول لإثبات وجود مثل DH - التهاب في الرئيسيات غير البشرية. على الرغم من أن انتشار مثل التهاب DH - يبدو أن يكون أقل بكثير من نسبة انتشار الأمعاء الحساسة من الغلوتين أيضا في قرود المكاك ، والنتائج المقدمة توفير الأمل للبحث في المستقبل ، على افتراض أنه سيتم تحديد الحيوانات إضافية مع DH - مثل التهاب الجلد. الكشف المزدوج إيجابية tTG2 + + ايغا الخلايا في خزعات الجلد من الحيوانات المتأثرة المجهري مبائر يكون مفيدا في هذه الجهود.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
فإن الكتاب أود أن أشكر اماندا Tardo ، والدكتور مصطفى Bouljihad ، فيلي ستيفاني كوين كارول الدكتور Ribka ايرين ، والدكتور ديدييه بيتي وكيبلر دوروثي لمساعدتها التقنية. وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح R01 - DK076653 و3R01 DK076653 - KS - 02S1 لومنح التشغيل قاعدة TNPRC RR000164.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-Human IgA-FITC * | Sigma-Aldrich | F-5259 | 1:100 working dilution |
| Anti-Human tTG2 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | MS-300-P1ABX | 1:100 working dilution |
| Anti-Mouse IgG1 ** | Invitrogen | A-21124 | 1:1,000 working dilution |
| ToPro-3 DNA probe *** | Invitrogen | T-3605 | 1:1,000 working dilution |
| Zinc Formalin (Z-fix) | Anatech Ltd., Battle Creek, MI | 171 | |
| OCT Freezing Medium | Sakura Finetek | 4583 | |
| Cytoseal Mounting Medium | Richard-Allan Scientific | 8312-4 | |
| Anti-Quenching Solution | Sigma-Aldrich | P 3130 | |
| Ethilon (Nylon Suture) | Ethicon Inc. | 663G | |
| Miltex Punch Dermal Biopsy Instrument | Miltex Inc. | NA | |
| Oster Golden A5 Single Speed Vet Clipper with a size 40 blade | Oster Professional Products | 78005-050 | |
| Leica Tissue Processor | Leica Microsystems | ASP300 | |
| Rotary Microtome | Microm International | HM325 | |
| Cryostat | Thermo Fisher Scientific, Inc. | HM560 | |
| Confocal Microscope | Leica, Wetzlar | TCS SP2 | |
| * Fluorescein isothiocyanate ** Secondary (Alexa Fluor 568-conjugated) antibody used after tTG2 primary antibody ** Dye |
|||
References
- Diosdado, B., Wijmenga, C. Molecular mechanisms of the adaptive, innate and regulatory immune responses in the intestinal mucosa of celiac disease patients. Expert. Rev. Mol. Diagn. 5 (5), 681-700 (2005).
- Schuppan, D., Dennis, M. D., Kelly, C. P. Celiac disease: epidemiology, pathogenesis, diagnosis, and nutritional management. Nutr. Clin. Care. 8 (2), 54-69 (2005).
- Sardy, M. Epidermal transglutaminase (TGase 3) is the autoantigen of dermatitis herpetiformis. J. Exp. Med. 195 (6), 747-757 (2002).
- Rose, C. Autoantibodies against epidermal transglutaminase are a sensitive diagnostic marker in patients with dermatitis herpetiformis on a normal or gluten-free diet. J. Am. Acad. Dermatol. 61 (1), 39-43 (2009).
- Bethune, M. Transepithelial transport and enzymatic detoxification of gluten in gluten-sensitive rhesus macaques. PLoS ONE. 3 (3), e1857-e1857 (2008).
- Mazumdar, K. Visualization of transepithelial passage of the immunogenic 33-residue peptide from α-2 gliadin in gluten-sensitive macaques. PLoS ONE. 5 (4), e10228-e10228 (2010).
- Schuppan, D., Junker, Y., Barisani, D. Celiac disease: from pathogenesis to novel therapies. Gastroenterol. 137 (6), 1912-1933 (2009).
- Hunt, K. Newly identified genetic risk variants for celiac disease related to the immune response. Nature Genet. 40 (4), 395-402 (2008).
- Abadie, V. Integration of genetic and immunological insights into a model of celiac disease pathogenesis. Annu. Rev. Immunol. 29, 493-525 (2011).
