Summary
Dermatite herpetiforme (DH) é uma condição inflamatória crônica caracterizada por uma reação auto-imune entre IgA e transglutaminase epidérmica (ETG). DH se desenvolve em uma parcela muito pequena dos pacientes glúten-sensíveis e / ou doença celíaca. Os resultados deste estudo indicam que a DH também pode se desenvolver em um hospedeiro macaco rhesus com sintomas da dermatite idiopática.
Abstract
Transglutaminase tecidular 2 (tTG2) é uma enzima digestiva intestinal que deamidates já parcialmente digeridos da dieta do glúten peptídeos gliadina por exemplo. Em indivíduos geneticamente predispostos, tTG2 desencadeia respostas auto-imunes que se caracterizam pela produção de anticorpos e tTG2 sua deposição direta em 1,2 parede do intestino delgado. A presença de tais anticorpos constitui uma das características principais da doença celíaca (CD). Transglutaminase epidérmica (ETG) é outro membro da família transglutaminase, que também pode funcionar como auto-antígeno em uma pequena minoria de pacientes com DC. Nestes casos relativamente raros, ETG desencadeia uma reação auto-imune (erupção cutânea) clinicamente conhecida como dermatite herpetiforme (DH). Embora o mecanismo exato da patogênese da DH CD e não é bem compreendida, sabe-se que tTG2 e ETG epítopos antigênicos partes que podem ser reconhecidas por anticorpos de soro de pacientes de CD e DH 3,4.
(Macaca mulatta) com dermatite (Tabela 1, fig. 1 e 2) foi usado para estudar os tecidos afetados. Em um animal (EM96) uma sobreposição espectral de IgA e tTG2 anticorpos (Fig. 3) foi demonstrada. A presença de duplo-positivos tTG2 + + células IgA foi focada na epiderme profunda, em torno da papila dérmica. Isto é consistente com lesões descritas em pacientes DH 3. Quando EM96 foi colocado em uma dieta livre de glúten, a dermatite, bem como tTG2 + IgA + depósitos desapareceu e já não eram detectáveis (Figs. 1-3). Dermatite reapareceu no entanto, com base na re-introdução do glúten na dieta EM96 (não mostrado). Em macacos, incluindo animais com dermatite independentes, o tTG2 + + depósitos de IgA não foram detectadas. Dieta sem glúten-dependente remissão de dermatite em EM96 juntamente com presença de IgA + + tTG2 células em sua pele sugerem uma auto-imunes, como a DH-mecanismo para o desenvolvimento dessa condição. Este é o primeiro relatório de DH-como a dermatite em qualquer primata não-humano.
Protocol
1. Coleta de amostra de biópsia de pele
- Antes de procedimento de biópsia de pele, anestesiar animais por via intramuscular com 2,5 mg / kg de cloridrato de tiletamina e cloridrato de zolazepam mistura telazol (Fort Dodge Saúde Animal, Fort Dodge, IA). Monitorar os animais desde a administração do anestésico até decúbito e depois remover do seu gabinete.
- Remover os pêlos da área de interesse da pele utilizando uma de Ouro Oster A5 Clipper Single Speed Veterinária com uma lâmina de tamanho 40 (Oster Professional Products, McMinnville, TN) e preparar assepticamente com alternância matagal betadine e álcool. Garantir uma cortina fenestrado estéril sobre o local da biópsia selecionado.
- Usando uma técnica asséptica, coloque um 4,0 milímetros Miltex Soco instrumento de biópsia cutânea (Miltex, York, PA) contra a pele enquanto gira o instrumento de 180 graus no sentido horário e anti-horário com leve pressão até que a biópsia transectos através das camadas dérmicas na ti subcutâneassue. Retirar a amostra da biópsia e agarrar a parte transeccionados da pele com uma pinça e livre do tecido subcutâneo.
- Fechar o defeito da pele com fio de náilon 3-0 ligado a uma agulha 3 / 8 círculo de corte (Ethilon, Ethicon, Johnson & Johnson Medical Limited, Berkshire, UK) em um padrão cruzado. Dar a todos os animais de cloridrato de buprenorfina 0,01 mg / kg (Hospira, Lake Forest, IL) por via intramuscular para analgesia pós-operatória.
2. Processamento das amostras
- Trabalhar com amostras de biópsia da pele de dermatite crônica e controles saudáveis macacos rhesus. Obter 2-3 (4 mm de diâmetro) biópsia amostras de cada animal.
- Fix primeira amostra em formol de zinco (Z-fix, Anatech Ltd., Battle Creek, MI) por 24 horas, lave em água por 30 min, lave brevemente em etanol 70%, e coloque em ASP300 processador de tecido Leica (Leica Microsystems Inc. , Buffalo Grove, KS) onde o tecido é desidratado com graus ascendentes de 70%, 80%, 95% e 100% de etanol 48min cada (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA), seguido por duas mudanças de xileno (Fisher).
- Incorporar em media de parafina (Fisher) para armazenamento de longo prazo na temperatura ambiente. Coloque a-20oC por 20 min antes do corte. Prepare 6 seções M usando um micrótomo rotativo (HM325, Microm International, Waldorf, Alemanha). Seções lugar em slides cobrado (Fisher) e ar seco a 60 º C durante a noite. Mancha com hematoxilina e eosina (H & E) método padrão (descritas abaixo).
- Fix segunda amostra em paraformaldeído 2% (USB Corp, Cleveland, OH) por 30 min em temperatura ambiente, lavar três vezes em tampão fosfato salino (PBS, Gibco-Invitrogen, Carlsbad, CA), lugar em sacarose 30% (Fisher) para 4 horas, e incorporar em outubro média de congelamento (Sakura Finetek, Torrence, CA). Mantenha a-80oC por 20 min antes do corte. Prepare 15 seções M utilizando o criostato (HM560, Thermo Scientific, Kalamazoo, MI).
3. Coloração H & E
- Deparaffinize incorporarseções ded por três mudanças de xilenos (Fisher) e hidratar através etanóis classificados: três alterações de 100%, duas mudanças de 95%, uma mudança de 80% e água destilada, 2 min cada um.
- Mancha com hematoxilina (Richard Allan-Científico, Kalamazoo, MI) por um min e siga por uma lavagem rápida em água corrente.
- Contracoloração com eosina (Sigma) por 6 min.
- Desidratar os tecidos manchados por 95% e etanol absoluto, duas mudas de 2 min cada um e em seguida, desmarque em três mudanças de xilenos, 3 min cada.
- Monte lamela usando Meio de Montagem Cytoseal (Richard Allan-Científica) sobre a H & E-seções manchada do tecido.
4. Avaliação histopatológica
Inspecionar H & E-corados biópsia da pele sob um microscópio de luz usando a 4 - aumento 40x e microscópio Leica com um SPOT introspecção câmera digital (Digital Instruments Inc., Michigan, EUA).
5. Imunofluorescência staining
- Trabalhar com seções outubro-embedded da pele para a coloração de imunofluorescência. Antes da coloração, de molho por 20 min em PBS contendo 0,2% de peixes de pele de gelatina (FSG, Sigma) com 0,1% Triton X-100 (Sigma) para remover a outubro e de permeabilizar o tecido.
- Depois de lavar os slides, incube com 10% de soro normal de cabra (NGS, Sigma), diluído em PBS-FSG por 1 hora, à temperatura ambiente, em uma câmara de corrediça umidificado.
- Para visualizar a deposição de IgA e tTG2 anticorpos, incubar slides com anti-rhesus IgA e tTG2 anticorpos primários, diluídos em 10% NGS-PBS-FSG por 1 hora.
- Lavar com X-100 PBS-FSG-Triton (Sigma) por 10 min, seguido por PBS-FSG por 10 min.
- Incube com secundário, isotipo de anticorpos específicos marcados com fluorocromos Alexa Fluor 488 (verde), 568 (vermelho) ou 633 (azul) (Molecular Probes-Invitrogen) na diluição 1:1.000. Use o corante ToPro-3 para visualizar o DNA nuclear. Use os 10% NGS-PBS-FSG como diluente de anticorpo.
- Use a solução anti-quenching (Sigma) para montar as seções de tecido manchado.
6. Confocal imagem
Realizar imagens com uma Leica TCS SP2 microscópio de varredura confocal a laser Verdadeiro (Leica, Wetzlar, Alemanha) equipado com três lasers (seis linhas disponíveis para a excitação): um laser de argônio-krypton a 488 nm (verde), um laser de 568 nm krypton ( vermelho) e um laser de hélio-neon a 633 nm (azul), que se estendem do visível para o lado vermelho do espectro. Registro de contraste de interferência diferencial (DIC) de imagens para avaliação das organizações não-rotulados arquitetura do tecido.
7. Resultados representante
Um exemplo de reconhecimento positivo da ETG por ambos tTG2 e IgA é mostrado na figura. 3A. Consistentes com a situação em pacientes humanos e devido à prevalência muito menor de DH-como a dermatite de CD-like sensibilidade ao glúten também em macacos rhesus, a maioria das amostras de biópsia da pele são esperados para show a reação positiva com anticorpos tTG2 mas sem a presença de IgA + + tTG2 dupla células positivas (Fig. 4). Nestes casos DH-independentes, incluindo os casos de dermatite de origem microbiana, vai revelar alguns single-células positivas + IgA espalhados sob o epitélio, mas não sobreposição espectral entre as tTG2 e IgA-rotulados marcadores (Figs. 3B e 4). Portanto, é importante manter a ordem dos procedimentos de teste sugerido, começando com o exame clínico (Fig. 1), seguido de avaliação histopatológica (Fig. 2) e apenas se não houver dermatite causador da doença, outros agentes mais comuns podem ser identificados, confocal exame de microscopia de biópsias de pele manchada para tTG2 e IgA é garantido. Avaliações clínicas e / ou histopatológico por si só não são suficientes para o diagnóstico positivo desta condição. Nos casos em duplo positivo (tTG2 + IgA +) células são identificadas em torno da área de papilas dérmicas, DH-como o diagnóstico de dermatite pode ser emitido. Em tais casos, retirada do glúten da dietae administração de dieta livre de glúten é recomendado para aliviar os sintomas da dermatite.
Figura 1. Região inguinal de EM96 macaco antes (A) e após (B) a retirada do glúten da dieta durante 5 semanas. Reintrodução do glúten da dieta coincidiu com o reaparecimento de dermatite (C).
Figura 2. Coloração HE de EM96 biópsias de pele macaco coletados antes (A) e após (B) a retirada do glúten da dieta por nove semanas. A: Epitélio é engrossado (7-15 camadas de células epiteliais), com uma grossa crosta superficial de células hyperkeratotic infiltradas com neutrofilos degenerando. Neutrófilos aparecem também no interior do epitélio e são misturados com números moderada de linfócitos, células plasmáticas e histiócitos em torno do anexos na derme superior. B: Alguns hyperkeratosis ainda está presente, espessura epitelial é normalizada (4-7 camadas) com infiltração mínima linfoplasmocitário na derme superior. C: pele abdominal normal a partir do FR56 macaco, sem infiltração linfoplasmocitário, está incluído para comparação. Ampliação de 20x.
Figura 3. Imagens de microscopia confocal de EM96 biópsias de pele macaco coletados antes (A) e após (B) a retirada do glúten da dieta por nove semanas. A: coloração IgA (verde), tTG2 (vermelho) e ToPro-3 marcador de DNA nuclear (azul). Co-localização de IgA e tTG2 aparece em amarelo ao redor da área de papilas dérmicas. B: amostra de pele tomada após 9 semanas de dieta sem glúten não mostra IgA dentro do epitélio, enquanto alguns IgA subepitelial ainda está presente (verde), tTG2 (vermelho) e ToPro-3 marcador de DNA nuclear (azul).
Figura 4.
| Tag animais | Sexo [M / F] | Idade [Anos] | Os sintomas clínicos | Plasma tTG2 anticorpos | Dieta [1,2] * |
| HJ71 | F | 1,3 | Saudável | - | 1 |
| HD13 | M | 1,4 | Diarréia, saudável ocasional | + | 1 |
| FR56 | M | 5,4 | Diarréia crônica idiopática | - | 1 |
| EM96 | F | 5,0 | Dermatite crônica | + / - (Limítrofe) | 1 e 2 |
| GI24 | F | 4,6 | Dermatite crônica | - | 1 |
Tabela 1. TNPRC macacos rhesus utilizado para a coleta de biópsias de pele
* A dieta 1 - regular macaco Chow (glúten contendo); Dieta 2 - dieta sem glúten
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Discussion
Nosso recém-criado modelo de primatas não-humanos da sensibilidade ao glúten foi recentemente utilizado para estudar as mudanças da permeabilidade intestinal desencadeada pelo glúten na dieta 5,6. Plasma tTG2 anticorpos, assim como intestinal tTG2 + + depósitos de IgA foram detectados em alguns macacos glúten-sensível. Desde que identificado recentemente incidentes raros de dermatite idiopática em colônia de macacos rhesus, onde nenhuma etiologia (infecciosas / metabólica) usual pôde ser estabelecida, o objetivo deste estudo foi avaliar se tTG2 + depósitos de anticorpos IgA + poderiam ser detectados em amostras de pele a partir desses casos raros de dermatite (Tabela 1).
Prevalência de auto-anticorpos tTG2 que são indicativos de faixas de CD entre 1:70 e 1:200 7. Nossos estudos com macacos glúten-sensível indicam que a prevalência de anticorpos em cativeiro tTG2 macacos rhesus se assemelha ao relatado de população humana. Primários fatores ambientais e genéticos que podem estar afetando a extensão of prevalência como em humanos e macacos são pouco estudados 8,9. Fatores que estão associados com menor prevalência de DH (1:400 a 1:10.000) do CD também não são conhecidos. Portanto, a pesquisa mais rigorosa é necessária para estudar o CD e patogênese DH. Este relatório é o primeiro a demonstrar a existência de DH-como a dermatite em primatas não-humanos. Apesar de que a prevalência de DH-como a dermatite parece ser muito menor do que a prevalência de enteropatia sensível ao glúten também em macacos, os resultados apresentados trazem esperança para pesquisas futuras, assumindo que os animais adicionais com DH-como a dermatite serão identificados. Detecção de dupla-positivos tTG2 + IgA + células em biópsias de pele de animais afetados por microscopia confocal será instrumental em tais esforços.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Os autores gostariam de agradecer a Amanda Tardo, Dr. Mostafa Bouljihad, Stephanie Feely, Carol Coyne, Dr. Erin Ribka, Dr. Didier e Pete Dorothy Kuebler por sua assistência técnica. Este trabalho foi financiado pelo NIH concede R01-DK076653 e 3R01-DK076653-02S1 para KS e da subvenção de funcionamento base do TNPRC RR000164.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-Human IgA-FITC * | Sigma-Aldrich | F-5259 | 1:100 working dilution |
| Anti-Human tTG2 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | MS-300-P1ABX | 1:100 working dilution |
| Anti-Mouse IgG1 ** | Invitrogen | A-21124 | 1:1,000 working dilution |
| ToPro-3 DNA probe *** | Invitrogen | T-3605 | 1:1,000 working dilution |
| Zinc Formalin (Z-fix) | Anatech Ltd., Battle Creek, MI | 171 | |
| OCT Freezing Medium | Sakura Finetek | 4583 | |
| Cytoseal Mounting Medium | Richard-Allan Scientific | 8312-4 | |
| Anti-Quenching Solution | Sigma-Aldrich | P 3130 | |
| Ethilon (Nylon Suture) | Ethicon Inc. | 663G | |
| Miltex Punch Dermal Biopsy Instrument | Miltex Inc. | NA | |
| Oster Golden A5 Single Speed Vet Clipper with a size 40 blade | Oster Professional Products | 78005-050 | |
| Leica Tissue Processor | Leica Microsystems | ASP300 | |
| Rotary Microtome | Microm International | HM325 | |
| Cryostat | Thermo Fisher Scientific, Inc. | HM560 | |
| Confocal Microscope | Leica, Wetzlar | TCS SP2 | |
| * Fluorescein isothiocyanate ** Secondary (Alexa Fluor 568-conjugated) antibody used after tTG2 primary antibody ** Dye |
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References
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